本發(fā)明屬于保健食品領(lǐng)域，特別涉及一種具有延緩皮膚光老化和/或抗輻射功能的組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：皮膚光老化是由于長期紫外線輻射導(dǎo)致皮膚加速衰老的現(xiàn)象。大量的流行病學(xué)調(diào)查及研究證實，臨床許多皮膚病光線性彈力纖維病、日光性角化病、慢性光線性唇炎、日光性雀斑樣痣、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑素細胞瘤等的發(fā)生發(fā)展與皮膚光老化有直接或間接的關(guān)系。光老化皮膚有著明顯的組織學(xué)特征和臨床特征。皮膚光老化組織學(xué)特征表現(xiàn)為：表皮肥厚、表皮突消失，在暴光部位表皮可增厚，表皮細胞可發(fā)生異質(zhì)性，光照部位黑素細胞可增多。真皮成熟膠原減少，膠原纖維束散開，彈性纖維嗜堿性變，增多變粗，卷曲扭結(jié)，常在真皮淺層聚集成粗而交織的帶，在嚴重的日光性變性區(qū)可呈無定形狀。電鏡下彈性纖維崩解成短小的微絲。皮膚光老化臨床特征主要為：暴露部位皺紋加深、皮膚松弛、外觀呈皮革樣、色素斑增多、毛細血管擴張。皮膚光老化是指由于長期的日光照射導(dǎo)致皮膚加速衰老的現(xiàn)象，嚴重影響人們的外貌美觀，并可能引發(fā)各種良性或惡性腫瘤。尤其是過多的紫外線接觸是導(dǎo)致皮膚光老化、皮膚癌變、免疫抑制等一系列疾病的主要原因。紫外線輻射(UVR)也稱紫外線，屬于電磁輻射(非電離輻射)，波長范圍在100～400nm之間，按波長不同可分為長波紫外線(UVA315～400nm)，中波紫外線(UVB280～315nm)和短波紫外線(UVC100～280nm)，到達地球表面時大部分UVB和幾乎全部UVC均被大氣臭氧層吸收，對人體產(chǎn)生作用的主要是UVB(占到達地表UVR總量的5％)和UVA(占到達地表UVR總量的95％)，相同劑量UVB的生物學(xué)效應(yīng)是UVA的800～1000倍。UVB可以通過直接損傷DNA或誘發(fā)氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基等機制作用于機體細胞，甚至引起突變頻率增加、細胞周期阻滯、誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生、促進細胞增殖甚至引起皮膚癌。近三十年來，工業(yè)的迅速發(fā)展造成環(huán)境污染不斷加劇，大氣中的臭氧層被嚴重破壞，到達地球表面紫外線增加，更加加速了皮膚光老化的發(fā)生。大量研究報道已指出，長期紫外尤其UVB照射是造成皮膚光老化甚至各種良性或惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素，同時患有皮膚癌的患者也是逐年增加，因此預(yù)防和延緩皮膚光老化已成為當(dāng)前的一大熱點。皮膚光老化的許多改變是可以通過藥物改善和逆轉(zhuǎn)的，但大部分藥物具有一定的毒副作用，會對機體有所損傷，所以尋找安全、高效的防紫外線輻射的天然產(chǎn)物來保護現(xiàn)代人抵御皮膚光老化危害和緩解皮膚過快衰老是很有必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種組合物，具體的說是提供一種具有延緩皮膚光老化和/或抗輻射功能的組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明組合物制成的保健食品，對紫外輻射UVB條件下小鼠皮膚光老化具有顯著的防治作用，可起到延緩皮膚光老化和抗輻射的作用。本發(fā)明提供了一種組合物，包括石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，組合物中所述石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁的體積比為(20-180):(1-10):(1-10):(0.1-5)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，組合物中所述石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁的體積比為20:1:0.2:0.4。本發(fā)明中所述組合物中的石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以通過商業(yè)途徑購買得到或通過現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法壓榨水果得到，其規(guī)格符合國家或行業(yè)標(biāo)準即可。其中，所述石榴原果汁優(yōu)選為紅石榴原果汁。所述石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁分別以新鮮的石榴、枸杞、沙棘、楊梅以清水洗凈，然后進行打漿、壓榨、靜置、離心等物理方式制得石榴原果汁，枸杞原果汁、沙棘原果汁和楊梅原果汁；所述壓榨原汁可以包括果肉和果汁，也可以根據(jù)產(chǎn)品需要濾去果肉只保留果汁。按照本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解所述石榴原果汁、所述枸杞原果汁、所述沙棘原果汁、楊梅原果汁可以為原汁，也可以為石榴、枸杞、沙棘和楊梅的凍干粉、濃縮物或有效成分的提取物，只要所述濃縮物和所述提取物的功效量應(yīng)與所述原汁功效成分份量相等即可。本發(fā)明所述組合物由石榴原果汁、所述枸杞原果汁、所述沙棘原果汁、楊梅原果汁按比例混合制得。本發(fā)明每天給予ICR小鼠裸露皮膚400mJ/cm2UVB照射，連續(xù)30天，以構(gòu)建慢性光損傷模型。Vc處理組和本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)處理組先給小鼠灌胃20min后，再接受等量的UVB輻射，實驗結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，取其背部皮膚，探討其對中波紫外線誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚的防治作用。肉眼觀察藥物處理組比模型組小鼠背部皮膚顏色淺，脫屑少；組織形態(tài)上，與模型組相比，小鼠表皮層增厚幅度小，真皮層纖維組織斷裂、破碎少，膠原纖維束邊緣離散少，有效地緩解皮膚光老化癥狀。進一步對小鼠皮膚組織中抗氧化能力、脂質(zhì)過氧化程度及膠原蛋白含量進行檢測，結(jié)果顯示本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)處理組的小鼠背部皮膚組織中SOD、GSH-Px活力明顯升高，MDA含量顯著降低，Hyp含量增高。應(yīng)用ELISA法檢測小鼠皮膚組織中MMP-1、MMP-3及TNF-α的含量，并對小鼠皮膚組織進行RNA抽提，檢測MMP-1mRNA、MMP-3mRNA和TNF-αmRNA的表達，實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)處理組小鼠皮膚組織中MMP-1、MMP-3及TNF-α分泌量降低，且其mRNA表達量下調(diào)，有效降低皮膚光老化產(chǎn)生的相關(guān)基因的表達，尤其高劑量組效果與陽性藥物Vc組幾乎相當(dāng)。表明本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)對紫外輻射UVB條件下小鼠皮膚光老化具有顯著的防治作用。因此本發(fā)明提供了所述組合物在制備具有延緩皮膚光老化和/或抗輻射的保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明所述組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)制劑方法制備成保健食品的各種常規(guī)制劑，例如，可以向本發(fā)明有效量的組合物中加入食品學(xué)上可接受的添加劑，例如崩解劑、潤滑劑、黏合劑、分散劑等，以常規(guī)制劑方法，制備成各種常用制劑。本發(fā)明優(yōu)選制成片劑、粉劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或口服液。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在知曉活性成分的情況下，可根據(jù)常規(guī)的制劑方法，輕易的制成各種制劑產(chǎn)品，同時在制備中所采用的輔料也為本領(lǐng)域所公知。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述組合物包括石榴原果汁、楊梅原果汁、枸杞原果汁和沙棘原果汁，對紫外輻射UVB條件下小鼠皮膚光老化具有顯著的防治作用，可起到延緩皮膚光老化和抗輻射的作用。本發(fā)明所述組合物可以用于延緩皮膚光老化和抗輻射的保健食品，應(yīng)用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟和社會效應(yīng)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示各組ICR小鼠皮膚外觀觀察圖，其中A為正常對照組、B為輻射模型組、C為VC陽性藥物組、D為復(fù)配低劑量組、E為復(fù)配中劑量組、F為復(fù)配高劑量組；圖2示各組ICR小鼠皮膚組織切片HE染色比較圖(200×)，其中A為正常對照組、B為輻射模型組、C為VC陽性藥物組、D為復(fù)配低劑量組、E為復(fù)配中劑量組、F為復(fù)配高劑量組；圖3示Ⅰ型膠原蛋白免疫組化分析圖(200×)，其中A為正常對照組、B為輻射模型組、C為VC陽性藥物組、D為復(fù)配低劑量組、E為復(fù)配中劑量組、F為復(fù)配高劑量組；圖4示真皮膠原的掃描電鏡圖(SEM×3000)，其中A為正常對照組、B為輻射模型組、C為VC陽性藥物組、D為復(fù)配低劑量組、E為復(fù)配中劑量組、F為復(fù)配高劑量組；圖5示本發(fā)明所述組合物對UVB照射小鼠皮膚勻漿液中Hyp的影響統(tǒng)計圖；圖6示小鼠皮膚組織RNA抽提及熒光定量PCR擴增曲線，其中圖A為1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，圖B為熒光定量PCR擴增曲線；圖7示本發(fā)明所述組合物對光老化小鼠皮膚組織中三個基因表達的影響圖，其中A為MMP-1、B為MMP-3、C為TNF-α。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。如無特殊說明，本發(fā)明提供的組合物中的各組分及其應(yīng)用中所用其他原料及試劑均可由市場購得。其中實驗動物和藥品：ICR小鼠雄性小鼠，清潔級，質(zhì)量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；許可證號：SCXK(湘)2011-0003。VC片，江西遠健藥業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、丙二醛MDA及羥脯氨酸Hyp試劑盒(南京建成生物工程研究所)、DEPC、Trizol試劑、TheDNA-freeTMDNaseTreatment&RemovalReagents、ReverTraqPCRRTKit、SYBRgreenI(美國Sigma公司)、Mousetumornecrosisfactor(TNF-α)ELISAKit、Mousematrixmetalloproteinase1(MMP-1)ELISAKit、Mousematrixmetalloproteinase3(MMP-3)ELISAKit(武漢華美生物工程有限公司)、進口戊二醛、引物(上海生工生物工程股份有限公司)、甲醛、氯仿、無水乙醇、異丙醇均為分析純(上海化學(xué)試劑公司)；實驗儀器：AEU-210電子分析天平(長沙湘儀天平儀器公司)、紫外交聯(lián)儀(英國UVP)、UV-120-02型紫外-可見分光光度計(日本島津)、F6/10超細勻漿機(德國FLUKO)、多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司)、ROTINA35R冷凍離心機(德國Heraeus公司)、EG1150C組織包埋機、TP1020自動脫水機、RM2235石蠟切片機(德國Leica公司)、DMILLED2000倒置顯微鏡(德國Leica公司)、Roter-GeneqPCR儀、動物飼養(yǎng)設(shè)備、灌胃針、留置針、解剖器械、剃須刀等。實施例1、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按100:5:1:2比例混合配制而成。實施例2、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按80:5:1:2比例混合配制而成。實施例3、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按150:4:2:3比例混合配制而成。實施例4、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按120:6:1:2比例混合配制而成。實施例5、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按100:4:1:1.5比例混合配制而成。實施例6、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按150:7:5:4比例混合配制而成。實施例7、紅石榴濃縮汁(4倍濃縮)、枸杞濃縮汁(2倍濃縮)、沙棘濃縮汁(2倍濃縮汁)、楊梅濃縮汁(3倍濃縮)由無限極(中國)有限公司提供，受試復(fù)配果汁由這4種果汁按100:5:1:2比例混合配制而成。試驗例1、1、實驗樣品實施例1制得的復(fù)配果汁，復(fù)配果汁的人體劑量為21.6mL/d.60kg，換算成小鼠的劑量約為216mL/d.60kg。設(shè)定216mL/d.60kg劑量為給藥小鼠的中劑量組，108mL/d.60kg和648mL/d.60kg兩個劑量分別為低、高劑量組。2、皮膚光老化小鼠模型建立實驗分組及處理見表1所示，各組動物在實驗開始前一天背部剃毛，整個實驗過程中每天進行背部剃毛，范圍2cm×3cm大??；除空白對照組外，其余各組均給予400mJ/cm2UVB輻射，每日1次，連續(xù)1個月。Vc處理組和水果復(fù)配處理組先給小鼠灌胃20min后，再接受等量的UVB輻射。實驗結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，取其背部皮膚。實驗過程中，空白對照組和復(fù)配中劑量組沒有老鼠死亡，其余各組老鼠有極少量死亡?？紤]個體差異，應(yīng)屬于實驗正常現(xiàn)象。老鼠整體狀態(tài)：與空白對照組相比，隨著時間的推移，由于紫外UVB輻射的作用，模型組老鼠的活力較差，而灌胃水果復(fù)配的各給藥劑量組小鼠活力狀態(tài)均呈現(xiàn)不同程度的改善作用。表1實驗動物組別設(shè)計及狀態(tài)3、皮膚一般形態(tài)UVB輻射期間觀察各組動物皮膚形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。與空白對照組相比，UVB輻射模型組大部分小鼠裸露背側(cè)由早期輕度紅斑形成，逐漸發(fā)展為顏色加深、脫屑、增厚，嚴重者出現(xiàn)粗糙變硬，失去彈性和光澤。與UVB輻射模型組相比，各給藥組大部分小鼠背側(cè)表皮脫屑、增厚、顏色加深現(xiàn)象有所改善。尤其是復(fù)配中、高劑量組效果最為明顯，皮膚紅斑很少，且有彈性和光澤，與陽性藥物組幾乎相當(dāng)。4、皮膚組織形態(tài)學(xué)實驗結(jié)束后取各組動物背部皮膚，觀察皮膚組織形態(tài)，結(jié)果如圖2所示?？瞻讓φ战M小鼠表皮細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量適中，細胞分層清晰，厚度正常，表皮與真皮分界清楚；真皮層可見波浪狀纖維組織，分布均勻，排列有序，疏密有致。與空白對照組相比，UVB輻射模型組小鼠表皮層增厚明顯并伴有角質(zhì)層變厚，分層不清；真皮層纖維組織發(fā)生變性、破壞，纖維排列紊亂，分布不均，真皮層纖維組織出現(xiàn)斷裂、破碎，甚至消失。與UVB輻射模型組相比，各給藥組小鼠皮膚組織的受損程度得到明顯緩解，表皮層稍有增厚，真皮層纖維組織少見斷裂、破碎，尤其復(fù)配中、高劑量組改善效果最為明顯，高劑量組甚至優(yōu)于VC陽性組。這些結(jié)果進一步表明了灌服一定濃度的本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)能夠有效地改善由過多紫外線照射引起的小鼠皮膚纖維組織的病變，延緩皮膚光老化的形成。5、免疫組化染色對各組動物背部皮膚進行免疫組織化學(xué)法染色，顯微鏡下觀察皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白的表達變化情況，結(jié)果如圖3所示。Ⅰ型膠原蛋白的表達在模型組中較正常組減少，而通過各劑量本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)處理尤其高劑量能夠較為明顯地增加其表達，從而有效修復(fù)了皮膚組織結(jié)構(gòu)的損傷。通過免疫組化染色結(jié)果再次表明了，與正常對照組相比，UVB輻射模型組小鼠表皮層增厚明顯，各個給藥組能一定程度上逆轉(zhuǎn)UVB造成的表皮增厚、角質(zhì)化，從而緩解皮膚損傷。6、超微結(jié)構(gòu)---掃描電鏡結(jié)果利用掃描電鏡對各組動物背部皮膚的超微結(jié)構(gòu)進行觀察。如圖4所示，空白對照組小鼠其膠原纖維分布均勻，排列緊密，膠原直徑大小相等，可見膠原周期性橫紋；UVB輻射模型組膠原纖維排列紊亂，分布不均勻，膠原纖維束邊緣散開；與UVB輻射模型組相比，各個給藥組中膠原纖維邊緣離散現(xiàn)象明顯減輕，膠原纖維分布狀況有所改善，排列較緊密。7、生化比色法檢測MDA、SOD、GSH-Px和Hyp含量將各組動物背部皮膚勻漿后，生化比色法檢測各組動物背部皮膚液中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp含量，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，連續(xù)一個月每天給予小鼠裸露皮膚400mJ/cm2UVB照射，使得小鼠皮膚勻漿液中MDA含量較正常水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)灌胃后，再接受UVB照射的給藥組小鼠皮膚勻漿液中MDA含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，尤其高劑量優(yōu)于正常水平，說明本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)可以一定程度上緩解紫外線輻射引起的脂質(zhì)過氧化損傷。與正常對照組相比，UVB輻射模型組中SOD活力水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與UVB輻射模型組相比，各給藥組均使得小鼠皮膚組織勻漿液中SOD活力顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。UVB輻射模型組小鼠皮膚勻漿液中GSH-Px活性較正常對照組極顯著下降，(P＜0.01)。與模型組相比，各給藥組小鼠皮膚勻漿液中GSH-Px活力顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)的攝入可有效提高皮膚內(nèi)部SOD和GSH-Px活力，從而有效抵抗UVB紫外線損傷。表2本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)對UVB照射小鼠皮膚勻漿液中MDA、SOD和GSH-Px和含量的影響注：*表示同一列各組與正常組比較在P<0.05水平差異顯著，**表示在P<0.01水平差異顯著；#表示與模型對照組比較在P<0.05水平差異顯著，##表示在P<0.01水平差異顯著。在皮膚組織中羥脯氨酸(Hyp)絕大多數(shù)且穩(wěn)定存在于膠原蛋白中，其含量可以直接反應(yīng)膠原蛋白的多少。如圖5所示，與正常對照組相比，每天接受UVB照射的模型對照組小鼠其皮膚勻漿液中Hyp含量明顯下降，具有顯著性差異(P＜0.01)。從而表明過量紫外線照射會影響皮膚組織中膠原蛋白的含量。而灌胃各劑量本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)后，再接受紫外線照射的小鼠，其皮膚組織勻漿液中Hyp含量有不同程度的提高；隨著藥物濃度的增大，均呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系；其中，復(fù)配中、高劑量組小鼠皮膚勻漿液中Hyp含量顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。表明本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)有效的緩解紫外線輻射引起的膠原蛋白合成能力下降或減少膠原蛋白的降解。8、小鼠皮膚組織中TNF-α、MMP-1和MMP-3含量測定皮膚光老化的形成是UVA和UVB共同作用的結(jié)果。首先，UVA和UVB誘導(dǎo)表皮層角質(zhì)形成細胞和真皮層成纖維細胞表達和分泌MMPs，對真皮的細胞外基質(zhì)進行降解，導(dǎo)致皮膚結(jié)締組織的受損，形成皮膚光老化外觀，并且在其家族中，MMP-1為降解膠原蛋白的起始酶，降解產(chǎn)物由MMP-3進一步處理；其次，更為重要的是，UVB可誘導(dǎo)表皮層角質(zhì)形成細胞合成和分泌大量的細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，其通過旁分泌機制促進真皮層成纖維細胞表達和分泌MMPs，并且TNF-α在UVB誘導(dǎo)皮膚細胞凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本實驗建立小鼠皮膚光老化動物模型，應(yīng)用ELISA法檢測小鼠皮膚勻漿液中MMP-1、MMP-3及TNF-α的含量，進一步闡述本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)抗皮膚光老化的作用及可能機理。如表3所示，連續(xù)1個月每天給予400mJ/cm2UVB輻射，與正常對照組相比，模型組小鼠皮膚勻漿液中MMP-1、MMP-3和TNF-α的含量顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明造模成功。而灌服各劑量水果復(fù)配后，小鼠皮膚勻漿液中MMP-1、MMP-3和TNF-α含量均有所降低；但是對于TNF-α含量，復(fù)配低劑量組較模型組未達到顯著水平，而其他劑量組的各個指標(biāo)較模型組都達到了顯著水平(P＜0.05或P＜0.01)，尤其高劑量組與陽性藥物組效果相當(dāng)。結(jié)果表明本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)可有效預(yù)防和改善紫外線輻射引起的小鼠皮膚光老化癥狀。表3本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)對UVB照射小鼠皮膚勻漿液中MMP-1、MMP-3和TNF-α含量的影響組別MMP-1(ng/ml)MMP-3(ng/ml)TNF-α(ng/ml)空白對照組2.913±0.5347.048±0.4156.006±0.613模型對照組5.954±0.522**12.167±0.934**10.649±0.315**陽性藥物組2.853±0.592##8.294±1.125##8.532±0.461#復(fù)配低劑量3.608±0.815##6.729±0.423##9.905±0.872復(fù)配中劑量2.565±0.352##9.050±0.295#9.293±0.667#復(fù)配高劑量3.053±0.734##9.373±1.482#8.021±1.425##注：*表示同一列各組與正常組比較在P<0.05水平差異顯著，**表示在P<0.01水平差異顯著；#表示與模型對照組比較在P<0.05水平差異顯著，##表示在P<0.01水平差異顯著。9、小鼠皮膚組織RNA抽提及qPCR檢測與皮膚光老化相關(guān)基因(MMP-1、MMP-3和TNF-α)的表達9.1小鼠皮膚組織RNA抽提及熒光定量PCR擴增曲線提取的小鼠皮膚總RNA，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖6所示。圖6結(jié)果顯示，紫外燈下可見28S、18S兩條非常清晰的RNA條帶和一條5S暗條帶，表明總RNA提取的質(zhì)量較高，可用于后續(xù)qPCR實驗，且其特性比值A(chǔ)260/A280在1.99～2.08之間，基本符合要求。各基因擴增曲線平滑，有明顯的指數(shù)擴增曲線，均在15～30個循環(huán)數(shù)內(nèi)起峰，可準確的反應(yīng)基因的相對差異表達。9.2熒光定量PCR檢測皮膚光老化相關(guān)基因(MMP-1、MMP-3和TNF-α)的表達取小鼠皮膚組織放入研缽，加入液氮后迅速研磨致粉末狀；加入適量Trizol試劑，按操作說明提取總RNA，瓊脂糖電泳檢測總RNA質(zhì)量與完整性；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；蛞镌O(shè)計采用PrimerPremier5軟件，引物設(shè)計結(jié)果如表4。qPCR檢測脂質(zhì)代謝基因相對表達量，反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10min；然后95℃變性10s，57℃退火15s，72℃延伸20s，重復(fù)反應(yīng)45個循環(huán)。各組的基因相對表達差異用2-ΔΔCt表示。表4小鼠皮膚光老化相關(guān)基因引物通過檢測MMP-1mRNA、MMP-3mRNA和TNF-αmRNA的合成，觀察本發(fā)明所述組合物(復(fù)配果汁)對經(jīng)過量紫外線UVB輻射的小鼠皮膚的干預(yù)作用，實驗結(jié)果如圖7所示。與正常對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中MMP-1、MMP-3和TNF-α的mRNA的表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，MMP-1、MMP-3及TNF-αmRNA的表達量分別上升為正常水平的10.2、7.1和2.9倍，表明造模成功。與模型組相比，各給藥組基本都能逆轉(zhuǎn)上述三個基因的表達，尤其是復(fù)配中、高劑量組改善效果都達到了顯著水平(P＜0.05或P＜0.01)，與陽性藥物組效果相當(dāng)。取實施例2至實施例7制備的組合物進行上述實驗，實驗結(jié)果與實施例1制備的組合物效果相同或相近，無顯著差異(P＞0.05)。表明本發(fā)明實施例1至實施例7制備的組合物均具有延緩皮膚光老化和抗輻射的作用。當(dāng)前第1頁1 2 3