本申請(qǐng)要求了2014年7月29日申請(qǐng)的大韓民國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第10-2014-0096693號(hào)(申請(qǐng)?zhí)?的優(yōu)先權(quán)，其說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容可作為本申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)。

本發(fā)明涉及一種加強(qiáng)提高免疫功效的酵素處理人參源多糖組分的制造方法及按照所述制造方法制造的多糖組分，具體來(lái)說(shuō)有關(guān)于一種提高免疫活性人參源多糖組分的制造方法及按照所述制造方法制造的多糖組分，包括在人參中添加淀粉酶和纖維素酶等2種以上酵素進(jìn)行酵素處理的步驟；以及從經(jīng)過(guò)所述酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量的多糖組分的步驟。

背景技術(shù)：

免疫是指人體內(nèi)，當(dāng)微生物同類(lèi)組織等異物從外部侵入，尤其是產(chǎn)生細(xì)胞時(shí)，免疫類(lèi)立即介入，識(shí)別這些抗原并做出特殊反應(yīng)，發(fā)揮產(chǎn)生抗體的作用，以此維持個(gè)體穩(wěn)定狀態(tài)的現(xiàn)象。有關(guān)免疫反應(yīng)的細(xì)胞有淋巴球、巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞等。近來(lái)，促進(jìn)活體免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的釋放，使癌細(xì)胞壞死的免疫方法備受矚目。免疫方法就是通過(guò)免疫反應(yīng)的增強(qiáng)及抑制誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)活體的防御能力，殺滅癌細(xì)胞，因而比以往依靠藥物進(jìn)行抗癌治療的方法具有更大的效果。所以，有很多人試圖從已通過(guò)安全性報(bào)告的天然物中尋找具有加強(qiáng)免疫活化功效的天然物。

人參(panaxginsengc.a.meyer)是屬于五加科植物的多年生草本，是多生長(zhǎng)于韓國(guó)、中國(guó)、西伯利亞?wèn)|部的植物。人參的主要生理活性成分有皂苷、聚乙炔、苯酚、煉油成分、肽、多糖體成分等，人們所了解的藥理活性如下：皂苷具有抑制中樞神經(jīng)、抗糖尿、抗壓力、抗疲勞的功效；聚乙炔具抗癌活性；苯酚具抗酸化、抗癌、美白、降血糖功效用。人們已經(jīng)了解，植物體源多糖體是可提高免疫的物質(zhì)，其中，從人參中分離出來(lái)的多糖體能抗糖尿、降血糖、促進(jìn)胰島素分泌，同時(shí)還能刺激淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞繁衍、激活抗補(bǔ)體等，提高免疫的活性。

人們已經(jīng)了解紅參源所含有的酸性多糖體具有提高免疫作用，但對(duì)紅參含有的人參源多糖體的生產(chǎn)技術(shù)的研究并不十分活躍，目前的生產(chǎn)是按照一般的植物源多糖體的分離工序。因此我們有必要在運(yùn)用酵素工學(xué)技術(shù)、糖鎖結(jié)構(gòu)的變形等附加技術(shù)大量生產(chǎn)功能性多糖體的同時(shí)，去尋找改善食品加工工序品質(zhì)的方法

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明者們一直在研究能更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠地制造加強(qiáng)免疫增強(qiáng)活性的多糖組分的方法，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了可以用淀粉酶和纖維素酶并行處理人參提取物來(lái)制造多糖組分，即使不通過(guò)高價(jià)的分離錠劑工程，也能制造免疫增強(qiáng)活性加強(qiáng)的多糖組分，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的就是提供一種方法，能制備具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分，包括對(duì)人參先后加入纖維素酶和淀粉酶處理的步驟和從所述經(jīng)過(guò)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲得10kda以上分子量的多糖組分的步驟。

本發(fā)明的另一目的是，根據(jù)所述方法制備的產(chǎn)品的特征是具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分。

本發(fā)明的另一目的是，提供一種含有上述多糖組分這一有效成分的用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的食品組合物。

本分明的另一目的是，提供一種含有上述多糖組分這一有效成分的用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的藥物組合物。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種能制造具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分的方法，包括對(duì)人參先后加入纖維素酶和淀粉酶處理的步驟和從所述經(jīng)過(guò)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲得10kda以上分子量的多糖組分的步驟。

為了達(dá)到本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明提供的按照所述方法制造的產(chǎn)品的特征是具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分。

為了達(dá)到本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明提供一種含有上述多糖組分這一有效成分的用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的食品組合物。

為了達(dá)到本分明的另一目的，本發(fā)明提供一種含有上述多糖組分這一有效成分的用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的藥物組合物。

以下是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明提供一種具有免疫功能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分的制備方法，包括(a)對(duì)人參先后加入纖維素酶和淀粉酶處理處理的步驟；(b)從所述經(jīng)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量的多糖組分的步驟。

以下是對(duì)本發(fā)明的制備方法的每一個(gè)步驟的說(shuō)明。

(a)對(duì)人參先后加入纖維素酶和淀粉酶處理處理的步驟；

(a)步驟是對(duì)人參進(jìn)行酵素處理。本發(fā)明進(jìn)行酵素處理的過(guò)程的特征是先后加入纖維素酶和淀粉酶處理處理。

人參(panaxginsengc.a.meyer)是屬于五加科的多年生草本植物，多長(zhǎng)于韓國(guó)、中國(guó)、西伯利亞?wèn)|部。人參的主要生理活性成分有皂苷、聚乙炔、苯酚、煉油成分、肽、多糖體成分等，人們所了解的人參的藥理活性如下：皂苷具有抑制中樞神經(jīng)、抗糖尿、抗壓力、抗疲勞的功效；聚乙炔具有抗癌活性；苯酚具有抗酸化、抗癌、美白、降血糖功效。根據(jù)加工形態(tài)，人參的名稱(chēng)有很多種。剛收獲的人參叫水參，把根連皮一塊用水蒸氣蒸干的叫紅參。干參是曬干的生鮮參，去皮后曬干的白參和不去皮曬干的白干參都屬于干參。本發(fā)明的人參與其之前的加工形態(tài)無(wú)關(guān)，包括所有人參(panaxginseng)，本發(fā)明的優(yōu)選人參可以是水參或白參，更合適的可以是加工而成的水參粉末或白參粉末。

淀粉酶(amylase)是指將淀粉(starch)進(jìn)行加水分解的酵素。淀粉酶的種類(lèi)有α-amylase(α-1，4-glucan-4-glucanohydrolase)，β-amylase(α-1，4-glucanmaltohydrolase)，γ-amylase(amyloglucosidase)，本發(fā)明并沒(méi)有限定淀粉酶的種類(lèi)，但優(yōu)選的是α-amylase。

纖維素酶(cellulase)是指將纖維素進(jìn)行加水分解的酵素。

淀粉酶和纖維素酶廣泛分布于高等植物、動(dòng)物及微生物等自然界，雖然本發(fā)明未對(duì)淀粉酶和纖維素酶的起源有特別的限定，但是來(lái)自微生物的淀粉酶和纖維素酶最為理想。本發(fā)明的加水分解酵素可直接從高等植物、動(dòng)物或微生物進(jìn)行分離或從商業(yè)銷(xiāo)售點(diǎn)采購(gòu)后使用。本發(fā)明優(yōu)選的淀粉酶來(lái)自于bacilluslicheniformis的spezymextra，而纖維素酶則來(lái)自于trichodermareesei的rohamentcl。

本發(fā)明中的酵素處理可以是兩種酵素并行處理，也可以是先后進(jìn)行處理。由于纖維素酶和淀粉酶顯現(xiàn)出活性的溫度相異，因此最好是先后進(jìn)行處理。酵素投入量及處理溫度、時(shí)間、ph值等反應(yīng)條件可能根據(jù)作為處理對(duì)象的人參提取物的量、投入的纖維素酶或淀粉酶的種類(lèi)、純度的不同而不同，未對(duì)顯現(xiàn)加水分解的目的和效果的限度并作特別限定。本發(fā)明的酵素處理可依據(jù)的優(yōu)選方法是先加入纖維素酶進(jìn)行12至24小時(shí)的酵素處理，之后加入淀粉酶進(jìn)行6至24小時(shí)的酵素處理。

此外，本發(fā)明中，為了提高酵素反應(yīng)的效率，可將人參切細(xì)或者研成粉末后使用，加入蒸餾水等合適的溶劑后進(jìn)行酵素處理。

(b)從經(jīng)過(guò)上述酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量多糖組分的步驟；

在(b)步驟中，從經(jīng)過(guò)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量的組分。

優(yōu)選的上述(b)步驟還可以包括：

(b1)從上述經(jīng)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中去除殘?jiān)牟襟E；

(b2)去除了殘?jiān)娜藚⑺猱a(chǎn)物中加入有機(jī)溶劑沉淀后，獲取粗多糖的步驟；以及

(b3)從上述粗多糖中分離獲取10kda以上分子量的多糖組分的步驟。

(b1)步驟中，從經(jīng)過(guò)酵素處理的人參水解產(chǎn)物中去除殘?jiān)?。去除殘?jiān)姆椒梢圆捎秒x心原理、過(guò)濾等廣為人知的如何從混合物中去除固體粉末的方法。采用過(guò)濾的方法最為理想。

最為理想的是，本發(fā)明的(b1)步驟中，將經(jīng)上述酵素處理的人參水解產(chǎn)物中所含有的酵素進(jìn)行鈍性處理，采用離心原理方法去除殘?jiān)?，分離并獲取優(yōu)等液體。上述鈍性處理的優(yōu)選方法可以是運(yùn)用熱處理的方法，即將水解產(chǎn)物維持在100℃至120℃的溫度下10至30分鐘。

(b2)步驟中，在去除了殘?jiān)娜藚⑺馕镏屑尤胗袡C(jī)溶劑后沉淀獲得粗多糖。上述有機(jī)溶劑可以是乙醇。乙醇的沉淀可以使用最常用的乙醇沉淀法，上述乙醇沉淀中使用的乙醇的濃度最好是與水混合后60％至95％(v/v)的乙醇，優(yōu)選的是70％至95％(v/v)。

(b3)步驟中，從上述(b2)中提取的粗多糖中提取10kda以上分子量的多糖組分。

上述組分的提取方法可以采用根據(jù)分子量分離物質(zhì)這一熟知的方法，例如透析、電泳及各種柱層析法等。去除時(shí)采用的上述色譜法可單獨(dú)或交叉采用離子交換色譜法、凝膠滲透色譜法、hplc、逆相-hplc、親和性柱層析法及超濾等技法。本發(fā)明中提取組分的優(yōu)選方法是采用利用透析膜的透析方法，從粗多糖中去除目標(biāo)分子量以下的物質(zhì)。

上述提取的組分是擁有10kda分子量的組分，擁有10kda以上和500kda以下分子量的組分比較理想。最理想的可能是分子量為50kda以上和400kda以下的組分。

此外，與上述所有提取的組分相比，中性多糖(neutralsugar)占比70至80重量％，糖醛酸(uronicacid)占20至30重量％。上述糖醛酸可由半乳糖醛酸(galacturonicacid)及葡萄糖醛酸(glucuronicacid)組成，上述多糖組分的中性多糖可由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖組成。

上述多糖組分中的中性多糖在上述人參源多糖組分中，鼠李糖占2至10mole％、阿拉伯糖占10至25mole％、半乳糖占15至45mole％、葡萄糖占40至70mole％，巖藻糖、木糖及甘露糖等殘量的中性多糖僅含微量。

按照本發(fā)明的制備方法可以制得免疫機(jī)能增強(qiáng)效果優(yōu)異的多糖組分。

因此，本發(fā)明的一個(gè)特征是，是按照所述本發(fā)明的方法制備的，可提供具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分。

本發(fā)明的一個(gè)特征是，多糖組分根據(jù)本發(fā)明的方法而制造，其免疫機(jī)能增強(qiáng)效能比按照故有的單純熱水抽取方法或酵素單獨(dú)處理方法制造的人參源多糖組分更加優(yōu)秀。

所謂免疫機(jī)能是指在生物體內(nèi)探知并殺死病原體和腫瘤細(xì)胞等，從而保護(hù)生命體遠(yuǎn)離疾病的機(jī)能。

免疫機(jī)能分天然免疫(innateimmune)機(jī)能和特異性免疫(adaptiveimmune)機(jī)能，天然免疫是指作為一項(xiàng)當(dāng)微生物和毒素成功進(jìn)入體內(nèi)時(shí)立即啟動(dòng)的免疫機(jī)能，采用的方式可以是先由模式識(shí)別受體去識(shí)別微生物之間廣泛保存的部分，探知外部微生物或是發(fā)出排放受損細(xì)胞等警示信號(hào)，然后同類(lèi)受體進(jìn)行識(shí)別，探知微生物的存在。

特異性免疫是指免疫記憶(immunologicalmemory)等，具有記住抗原標(biāo)示的機(jī)能，是一種很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其抗原比較特別，需要通過(guò)抗原提示(antigenpresentation)來(lái)識(shí)別非自身抗原。

本發(fā)明的多糖組分能促進(jìn)巨噬細(xì)胞no、tnf-α及il-16、il-12的產(chǎn)生，能同時(shí)提高天然免疫(innateimmune)和特異性免疫(adaptiveimmune)。

另外，本發(fā)明的多糖組分不具細(xì)胞毒性，易用于食品或醫(yī)藥品。

同時(shí)，本發(fā)明的效果在本發(fā)明的實(shí)施例中得到了很好的體現(xiàn)。

本發(fā)明的一實(shí)施例中，熱水抽取人參后，對(duì)未進(jìn)行酵素處理的多糖組分和人參粉末分別用淀粉酶、纖維素酶、果膠酶及蛋白酶處理，然后測(cè)定所制造的多糖組分的免疫機(jī)能增強(qiáng)活性。通過(guò)其結(jié)果確認(rèn)，對(duì)照組單純的熱水提取物與蛋白酶或制造多糖組分時(shí)普遍使用的果膠酶處理組進(jìn)行比較時(shí)，經(jīng)淀粉酶或纖維素酶處理的實(shí)驗(yàn)組的免疫機(jī)能增強(qiáng)活性更加優(yōu)秀。

本發(fā)明的另一實(shí)施例中，同時(shí)處理淀粉酶和纖維素酶制造多糖組分，將經(jīng)過(guò)淀粉酶或纖維素酶處理的多糖組分與淀粉酶和纖維素酶并行處理的多糖組分的免疫機(jī)能增強(qiáng)活性進(jìn)行比較。通過(guò)其結(jié)果確認(rèn)，與經(jīng)過(guò)淀粉酶或纖維素酶處理的多糖組分相比，淀粉酶和纖維素酶并行處理的多糖組分的免疫機(jī)能增強(qiáng)活性特別優(yōu)秀。

本發(fā)明的一實(shí)施例中，將本發(fā)明的多糖組分放在巨噬細(xì)胞中處理，用測(cè)定細(xì)胞存活率的方法測(cè)試，以判斷是否具有細(xì)胞毒性。通過(guò)其結(jié)果確認(rèn)，本發(fā)明的多糖組分不具有細(xì)胞毒性。

本發(fā)明的另一實(shí)施例中，將本發(fā)明的多糖組分放在巨噬細(xì)胞中處理，來(lái)測(cè)試其對(duì)氧化氮產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，本發(fā)明所述多糖組分處理的情況下，巨噬細(xì)胞的氧化氮的產(chǎn)生量增加。

本發(fā)明的另一實(shí)施例中，將本發(fā)明的多糖組分放在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行處理，來(lái)測(cè)試其對(duì)與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子(cytokine)的釋放所產(chǎn)生的影響。結(jié)果確認(rèn)，本發(fā)明所述多糖組分處理的情況下，tnf-α、il-6及il-12的細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加很多。

由此可以確定本發(fā)明的多糖組分的免疫機(jī)能增強(qiáng)活性十分突出。

因此，本發(fā)明提供含有本發(fā)明中多糖組分這一有效成分，用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的食品組合物。

本發(fā)明的食品組合物包括功能性食品(functionalfood)、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑(nutritionalsupplement)、健康食品(healthfood)及食品添加劑(foodadditives)等所有形態(tài)。上述各類(lèi)食品組合物可用業(yè)內(nèi)均知曉的普遍的方法制造成各種形態(tài)。

以健康食品舉例，本發(fā)明的人參源多糖組分自體可做成茶、果汁及飲料等飲用，或者制成果粒、膠囊及粉末等攝食。另外，本發(fā)明的人參源多糖組分也可以和已知的具有免疫機(jī)能增強(qiáng)效果的水質(zhì)或活性成分混合在一起，做成組合物。

再以功能性食品舉例，生產(chǎn)飲料(包括含酒精飲料)、果實(shí)及其加工食品(例如：罐裝水果、瓶裝水果、果子醬、果醬等)、魚(yú)類(lèi)、肉類(lèi)及其加工食品(例如：火腿、腌咸牛肉等)、面包類(lèi)及面類(lèi)(例如：烏冬面、蕎麥面、方便面、意大利面、通心粉等)、果汁、各種飲料、餅干、羊羹、乳制品(例如：黃油、奶酪等)、食用植物乳脂、人造黃油、植物性蛋白質(zhì)、軟罐頭食品、冷凍食品、各種調(diào)料(例如：大醬、醬油、調(diào)料汁等)等時(shí)，可添加本發(fā)明的人參源多糖組分。

本發(fā)明不對(duì)食品組合物中上述本發(fā)明的人參源多糖組分的優(yōu)選的含油量有所限制，但理想的是在最終生產(chǎn)的食品中所占的量為0.01-50％。

另外，為了將本發(fā)明的人參源多糖組分用作食品添加劑，可做成粉末或濃縮液在生產(chǎn)中加以使用。

本發(fā)明的組合物具有預(yù)防和改善因免疫機(jī)能低下而引起疾患的功效，因上述免疫機(jī)能低下引起的疾患并不限定于感冒等感染性疾病、炎癥疾病、過(guò)敏性皮膚等過(guò)敏疾病、慢性疲勞及癌癥等其中任何一個(gè)，而是包括業(yè)內(nèi)從業(yè)者所知道的因免疫機(jī)能低下所引起的所有疾病。

本發(fā)明可用于上述人參源多糖組分的免疫機(jī)能增強(qiáng)用制劑的制造。

本發(fā)明提供一種免疫機(jī)能增強(qiáng)法，包括對(duì)需要上述人參源多糖組分的個(gè)體投入有效用量的步驟。

上述內(nèi)容中提到的在個(gè)體中投入的‘有效用量’是能顯現(xiàn)免疫機(jī)能增進(jìn)功效以及癌或免疫力低下所引起的疾病的治療和預(yù)防等效果的量，上述‘個(gè)體(subject)’指動(dòng)物，優(yōu)選的可以是哺乳動(dòng)物，尤其是包括人類(lèi)在內(nèi)的動(dòng)物，也可以是來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官等。上述個(gè)體也可以是需要接受治療的患者(patient)。

另外，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的多糖組分這一有效成分的用于增強(qiáng)免疫機(jī)能的藥學(xué)組合物。

本發(fā)明所說(shuō)的藥學(xué)組合物是含有本發(fā)明的多糖組分或僅含有從藥學(xué)角度上可使用的一個(gè)或多個(gè)多糖組分，也可能含有從藥學(xué)上可以使用的載體、成型添加劑或稀釋劑。

藥學(xué)上可用的載體舉例來(lái)說(shuō)可包括口服載體或非口服載體?？诜妮d體可以包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。另外，非口服載體可以包括水、適當(dāng)?shù)挠?、生理鹽水、水溶性葡萄糖及二羥基醇等。還可以包括的是穩(wěn)定劑及保鮮劑。合適的穩(wěn)定劑有亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸類(lèi)抗酸化劑。合適的保鮮劑有苯扎氯銨、甲基或丙對(duì)苯及氯丁烷。此外，作為藥學(xué)上可用的載體可參考如下文獻(xiàn)的記載(remington’spharmaceuticalsciences，19thed.，mackpublishingcompany，easton，pa，1995)。

本發(fā)明中用于免疫機(jī)能增強(qiáng)的藥學(xué)組合物可以任意的方式用于以人類(lèi)為代表的哺乳動(dòng)物。例如，通過(guò)口服或非口服的方式投藥。非口服投藥的方式不被限定，可投藥到靜脈、肌肉、動(dòng)脈、骨髓、硬腦膜、腎臟、經(jīng)皮、皮下、腹腔、腸管、身體局部、舌下或直腸內(nèi)。優(yōu)選的是本發(fā)明的藥學(xué)組合物可通過(guò)經(jīng)皮投藥。上述內(nèi)容中提到的通過(guò)經(jīng)皮投藥是指本發(fā)明的藥學(xué)組合物通過(guò)細(xì)胞或皮膚投藥，將本發(fā)明組合物中含有的活性成分輸送到皮膚內(nèi)。例如，將本發(fā)明的藥學(xué)組合物做成注射劑，用注射器輕輕戳破皮膚注入30ga劑量的方式或是直接涂抹在皮膚上的方式投藥。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物可以根據(jù)如上所述的投藥途徑制成口服型或非口服型的藥劑。

如果是口服型藥劑，本發(fā)明的組合物可用業(yè)內(nèi)普遍所知的方法做成粉末、果粒、片劑、丸劑、糖衣片劑、膠囊、液體藥劑、凝膠劑、糖漿、漿狀藥劑、懸浮液等藥劑。例如，口服型制劑是將活性成分與固體賦形劑混合之后粉碎，添加合適的保鮮劑，加工成果?；旌衔锖罂傻玫狡瑒┗蛱且缕瑒：线m的賦形劑可以是包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇及麥芽糖醇的糖類(lèi)，包括玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉及土豆淀粉等的淀粉類(lèi)，包括纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、及羥丙基甲基纖維素等纖維素類(lèi)，還可以包括纖維素類(lèi)、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等填充劑。另外，不同情況下也可以添加架橋聚乙烯吡咯烷酮、石花膠、褐藻酸或褐藻酸鹽等分解劑。并且，本發(fā)明的藥學(xué)組合物還可能包括抗凝劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、香料、乳化劑及防腐劑等。

非口服型投藥用制劑可用業(yè)內(nèi)普遍使用的方法制成注射劑、霜?jiǎng)⑷橐褐苿?、外用軟膏劑、油性劑、保濕劑、膠狀劑、噴霧劑及鼻腔吸入劑等劑型。這些劑型記載于所有制藥化學(xué)領(lǐng)域都知道的處方文獻(xiàn)(remington’spharmaceuticalscience，15thedition，1975.mackpublishingcompany，easton，pennsylvania18042，chapter87：blaug，seymour)。

本發(fā)明的多糖組分的總有效劑量可以是根據(jù)每天給患者服用的方式?jīng)Q定投藥量(singledose)，也可以是根據(jù)成倍的劑量(multipledose)給患者長(zhǎng)期分批服用進(jìn)行治療的方式(fractionatedtreatmentprotocol)決定。根據(jù)疾病的輕重，本發(fā)明的藥學(xué)組合物有效成分的含有量也可能不同。優(yōu)選的是本發(fā)明的糖蛋白組分的優(yōu)選總量為每日患者體重每1kg藥量約0.01ug-1，000mg，最優(yōu)選的劑量是0.1ug-100mg。但是，上述本發(fā)明的多糖組分的用量不僅根據(jù)藥學(xué)組合物的投藥途徑及治療次數(shù)決定，同時(shí)還要考慮患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、疾病的輕重、飲食及排泄率等各種原因決定能對(duì)患者起效的藥量。在考慮這些要素時(shí)，具備業(yè)內(nèi)一般知識(shí)的人可以按照上述本發(fā)明的多糖組分作為免疫機(jī)能增強(qiáng)劑的特定用途來(lái)決定適當(dāng)?shù)挠行У挠盟巹┝?。本發(fā)明并不特別限定藥學(xué)組合物能發(fā)揮本發(fā)明功效的劑型投藥途徑及投藥方法。

本發(fā)明的組合物具有預(yù)防和改善因免疫機(jī)能低下而引起疾患的功效，因上述免疫機(jī)能低下引起的疾患并不限定于感冒等感染性疾病、炎癥疾病、過(guò)敏性皮膚等過(guò)敏疾病、慢性疲勞及癌癥等其中任何一個(gè)，而是包括業(yè)內(nèi)從業(yè)者所知道的因免疫機(jī)能低下引起的所有疾病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供制備具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的人參源多糖組分的方法及按照上述制備方法制造的多糖組分，包括在人參中加入包含淀粉酶和纖維素酶等2種以上酵素進(jìn)行酵素處理的步驟和從經(jīng)過(guò)上述酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量的多糖組分的步驟。本發(fā)明的制備方法是通過(guò)包括淀粉酶和纖維素酶的復(fù)合酵素處理工序，可經(jīng)濟(jì)實(shí)惠地制成免疫活性增強(qiáng)效果優(yōu)異的多糖組分，本發(fā)明的多糖組分與故有的人參源多糖相比，免疫增強(qiáng)效果更加顯著，在免疫增強(qiáng)食品生產(chǎn)上十分有用。

附圖說(shuō)明

圖1是用人參熱水浸提法制造粗多糖的工序圖；

圖2是本發(fā)明用酵素并行處理法制造人參源多糖組分的工序圖；

圖3是根據(jù)酵素單獨(dú)處理的人參源多糖樣品測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(mouseperitonealmacrophage)繁殖率變化的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez1：果膠酶處理多糖組分處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez4：內(nèi)切蛋白酶(endoprotease)處理多糖組分處理組；

圖4是根據(jù)酵素單獨(dú)處理人參源多糖樣品測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞il-6的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez1：果膠酶處理多糖組分處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez4：內(nèi)切蛋白酶處理多糖組分處理組；a，b，c，d，ab，bc：顯示出重要的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖5是根據(jù)酵素單獨(dú)處理人參源多糖樣品測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞il-12的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；ogwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez1：果膠酶處理多糖組分處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez4：內(nèi)切蛋白酶處理多糖組分處理組；a，b，c，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖6是根據(jù)酵素單獨(dú)處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-6白細(xì)胞介素的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez1：果膠酶處理多糖組分處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez4：內(nèi)切蛋白酶處理多糖組分處理組；a，b，c，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖7是根據(jù)酵素單獨(dú)處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-12白細(xì)胞介素的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez1：果膠酶處理多糖組分處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez4：內(nèi)切蛋白酶處理多糖組分處理組；a，b，c，d，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖8是根據(jù)hplc實(shí)驗(yàn)測(cè)定酵素單獨(dú)處理人參多糖樣品的分子量分布的結(jié)果(std：實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果；a：fgwo(酵素不處理多糖提取物處理組)的測(cè)定結(jié)果；b：fgez2(纖維素酶處理多糖組分處理組)的測(cè)定結(jié)果；c：fgez3(淀粉酶處理多糖組分處理組)的測(cè)定結(jié)果)；

圖9是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素il-6的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c，d：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖10是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素il-12的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖11是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-6的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖12是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-12的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖13是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-10的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c，ab：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖14是根據(jù)酵素單獨(dú)處理及并行處理人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子tnf-α的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgez2：纖維素酶處理多糖組分處理組；fgez3：淀粉酶處理多糖組分處理組；fgez2+3：同時(shí)處理纖維素酶和淀粉酶的多糖組分處理組；a，b，c，ab，bc：顯示出重要性的文字在結(jié)果中沒(méi)有相同的文字，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有重要性)；

圖15是按照本發(fā)明酵素并行處理法制備人參源多糖組分的工序圖；

圖16是根據(jù)hplc實(shí)驗(yàn)測(cè)定酵素并行處理法人參源多糖樣品的分子量分布比較的結(jié)果(std：測(cè)定實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果；a：fgwo(酵素不處理多糖提取物處理組)的測(cè)定結(jié)果；b：fgez0(纖維素酶和淀粉酶并行處理的多糖組分處理組)的測(cè)定結(jié)果)；

圖17是根據(jù)酵素并行處理法人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的繁殖率變化的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez0：纖維素酶和淀粉酶并行處理的多糖組分處理組)；

圖18是根據(jù)酵素并行處理法人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子il-6的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez0：纖維素酶和淀粉酶并行處理的多糖組分處理組)；

圖19是根據(jù)酵素并行處理法人參源多糖樣品測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子tnf-α的產(chǎn)生能力變化結(jié)果的圖表(con：不處理組；lps：內(nèi)毒素脂多糖處理組；fgwo：酵素不處理多糖提取物處理組；fgez0：纖維素酶和淀粉酶并行處理的多糖組分處理組)。

具體實(shí)施方式

以下是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明。

但，以下實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的列舉，本發(fā)明的內(nèi)容并不止限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1、粗多糖提取物的制造

1-1用熱水浸提法制造粗多糖提取物

本實(shí)驗(yàn)中使用的人參購(gòu)買(mǎi)的2013年產(chǎn)的4年根水參。

為分離多糖而采用的單純熱水浸提法如下：在100g水參中加入3倍的蒸餾水(w/v)并粉碎，在100℃的溫度下提取后，用調(diào)節(jié)為4℃的離心分離機(jī)(mega17r，hanilscienceindustrialco.ltd.，inchun，korea)在6,500×g進(jìn)行20分鐘的離心分離。為了使分離出的精華液的最終濃度達(dá)到80％，添加冷乙醇后放置一晚，回收生成的沉淀物，將其放在少量的蒸餾水中溶解，然后用透析膜(membranefilterationproducts，inc.，seguintexas，usa；mwco6,000～8,000)進(jìn)行透析，時(shí)間大約為2～3天，凍結(jié)干燥(tokoyorikakikaico.ltd.，fd-1000，tokyo，japan)后即制成熱水提取粗多糖提取物(fgwo，產(chǎn)出率3.2％)(圖1)。

1-2用酵素處理法制造多糖組分

用于酵素處理的加水分解酵素共有4種：rapidasec80max(果膠酶，源自黑曲霉，ez1)；rohamentcl(纖維素，源自里氏木霉，ez2)；spezymextra(α-淀粉酶，源自地衣形芽孢桿菌，ez3)；protex6l(蛋白酶，源自地衣形芽孢桿菌；ez4)，購(gòu)自bisionbiochem(bisioncorporation，京畿道)并投入使用。

用酵素處理的多糖組分的制造過(guò)程如下：將100g水參加入3倍(w/v)的蒸餾水后粉碎，在101℃的溫度下加熱20分鐘，之后將4種(ez1，ez2，ez3，ez4)加水分解酵素[表1]按照條件逐一進(jìn)行處理或同時(shí)用2種以上進(jìn)行處理。之后在90～100℃的溫度下再進(jìn)行20分鐘的加熱處理，使殘存的加水分解酵素鈍化后，在6,500×g進(jìn)行20分鐘的離心分離去除殘?jiān)瑸榱耸狗蛛x所得的精華液的最終濃度達(dá)到80％，添加冷乙醇放置一晚，使多糖沉淀。產(chǎn)生的沉淀物放入少量的蒸餾水進(jìn)行溶解，用透析膜(membranefilterationproducts，inc.，seguintexas，usa；mwco6,000～8,000)去除低分子物質(zhì)，凍結(jié)干燥后即得到酵素處理多糖組分(圖2)。此時(shí)，各加水分解酵素(4種；ez1～4)各自處理并制成的酵素處理多糖組分fgez1，fgez2，fgez3，fgez4的產(chǎn)出率依次是1.5，2.7，1.5，3.8％。

表1、酵素處理?xiàng)l件

實(shí)施例2、免疫活性的評(píng)價(jià)

用于本研究實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物是出生5～6周的雄性動(dòng)物，小白鼠在經(jīng)過(guò)了3天的適應(yīng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每一組飼養(yǎng)組有2只小白鼠，在保持一定溫度和濕度的飼養(yǎng)場(chǎng)內(nèi)飼養(yǎng)，水和飼料自由供給。

用于本實(shí)驗(yàn)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞是在小白鼠的腹腔內(nèi)注入1ml的5％巰基乙酸培養(yǎng)基，72～96小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞用pbs緩沖回收。之后，用rpmi1640medium清洗2～3次，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2.5×10⁶cells/ml，在96孔板(nuncco.，roskilde，denmark)上培養(yǎng)。培養(yǎng)基是將rpmi1640與10％(v/v)fbs和1％(v/v)penicillin-streptomycin混合后使用。之后，加入稀釋成各種濃度的樣品，在37℃，5％co2恒溫箱這一特定條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2-1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性檢測(cè)

對(duì)各細(xì)胞樣品是否存在毒性的檢測(cè)用了mttassay(hansenmb，nielsense，bergk.re-examinationandfurtherdevelopmentofapreciseandrapiddyemethodformeasuringcellgrowthcellkill.journalofimmunologicalmethods，1989，119：203-210.)方法。去除96孔板上的液體后，添加0.5mg/mlmtt溶液進(jìn)行4小時(shí)的培養(yǎng)，形成甲臜。然后，去除板面液體后在各孔中添加dmso，等甲臜融化后用elisa試劑盒在540nm中測(cè)定吸光度。

將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到一定個(gè)數(shù)后，在培養(yǎng)細(xì)胞中將多糖提取物樣品fgwo和fgez1～4各自處理至1、10、100ug/ml的濃度進(jìn)行培養(yǎng)，確認(rèn)細(xì)胞生存與否的結(jié)果如圖3所示。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的情況下，除了處理了fgez4100ug/ml的實(shí)驗(yàn)組以外，其他的存活率都在80％以上，在1～100ug/ml的濃度范圍內(nèi)，可知其對(duì)細(xì)胞毒性不產(chǎn)生大的影響。在fgez4100ug/ml中的存活率為78％，在誤差范圍之內(nèi)，所以被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞的生存不產(chǎn)生大的影響。

2-2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生能力的測(cè)定

培養(yǎng)基被稀釋后，將樣品按各種濃度在細(xì)胞中處理，在37℃、5％co2的恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，從巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分泌出的液體中細(xì)胞因子的量用elisa試劑盒并按照制造公司的要求測(cè)定。即，將逆細(xì)胞因子捕捉抗體在包被液(0.2msodiumphosphate，ph6.5)中稀釋后放入96孔盤(pán)，在4℃溫度下放置一晚。為了使tween20在pbs達(dá)到0.05％(v/v)，用pbs/tween溶液洗滌孔盤(pán)3遍。將檢測(cè)稀釋液((pbswith10％fbs)放入盤(pán)內(nèi)，在常溫下放置1小時(shí)。用pbs/tween洗滌3次后，將培養(yǎng)液放入各孔，2小時(shí)之后放置于常溫下。用pbs/tween洗滌5次后，將檢測(cè)抗體生物素基化抗體和酶制劑stretavidin-horseradishperoxidaseconjugate放入檢測(cè)稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)湃肟妆P(pán)后在常溫下放置1小時(shí)。用pbs/tween洗滌7次后，加入基質(zhì)溶液，在陰暗處放置30分鐘。加入終止液2n硫酸溶液終止反應(yīng)，用elasa試劑盒測(cè)試450nm的吸光度。

巨噬細(xì)胞分布于體內(nèi)幾乎所有組織，負(fù)責(zé)識(shí)別和去除體內(nèi)異物和廢物。大家知道，在此過(guò)程中分泌出各種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子作為在免疫細(xì)胞中生成的蛋白質(zhì)中介物，使免疫細(xì)胞間對(duì)外部抗原起到共同作用，其生成和分泌對(duì)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)來(lái)說(shuō)十分重要。巨噬細(xì)胞所分泌的最典型的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞因子已知的有studyusiil-1，il-6，il-10，il-12，tnf-α等(wangh，actorjk，indrigoj，olsenm，dasguptaa.2003.asianandsiberianginsengasapotentialmodulatorofimmunefunction：aninvitro細(xì)胞因子ngmousemacrophage.clinchimacta327：123-128)。在水參源多糖的刺激下，用elisa法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，結(jié)果顯示能促進(jìn)il-6、il-12的產(chǎn)生，顯示依賴(lài)所有濃度的活性都有所增加。il-6的所有樣品與對(duì)照組比較都提高了，酵素處理樣品組((fgez1～4))與fgwo相比顯示出更高的活性(圖4)。其中，在100ug/ml的濃度下，可以確認(rèn)fgez2和fgez3所顯示的活性比f(wàn)gwo高了2.2倍。尤其是fgez2的情況，確認(rèn)了在10ug/ml的濃度下顯示出很大的差異，具有有意義的價(jià)值，從較低的濃度中大大地體現(xiàn)了il-6的活性。

il-12的情況下，可以確認(rèn)的是和對(duì)照組(con)和fgwo相比，酵素處理樣品組(fgez1～4)的活性相對(duì)更高(圖5)。酵素之間并未顯示重大的差異，濃度相對(duì)較低的10ug/ml中，fgwo的數(shù)值是87pg/ml，與其相比，fgez2的數(shù)值是434pg/ml，fgez3是180pg/ml，fgez4是177pg/ml，顯示出較高的數(shù)值。尤其是我們可以推測(cè)fgez2從低濃度開(kāi)始顯示出很大的活性，即使是很少的量也能體現(xiàn)出較高的免疫機(jī)能。

2-3raw264.7在細(xì)胞刺激下測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生量

raw264.7細(xì)胞株(ktccno.40071)是從韓國(guó)細(xì)胞株銀行(ktcc，seoul)購(gòu)買(mǎi)并使用的。將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2.0×10⁵cells/ml并加以培養(yǎng)，培養(yǎng)基是在dmem培基中加入10％(v/v)fbs和1％(v/v)雙抗混合使用。然后，加入被稀釋成各種濃度的樣品在37℃，5％co2恒溫箱中培養(yǎng)。

raw264.7細(xì)胞中也用同樣的樣品，在10～150ug/ml的濃度范圍內(nèi)，可以確定測(cè)定細(xì)胞因子的結(jié)果是，如圖6所示，il-6中可以確認(rèn)，與fgwo相比，酵素處理樣品組(fgez1～4)顯示出更高的活性。其中，與fgwo相比時(shí)，fgez2和fgez3在il-6中顯出重大差異。fgez2的情況下，100、150ug/ml濃度中，il-6增加約達(dá)5～10倍以上；fgez3的情況下，100、150ug/ml濃度中增加約9～11倍以上。

il-12則顯示出與il-6同狀態(tài)，fgez4在150ug/ml中多多少少顯示出高活性，此外fgez2和fgez3在所有濃度中都顯示出比f(wàn)gwo重要的活性差異(圖7).

通過(guò)以上測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生能力的結(jié)果，可以確定與fgwo相比，酵素處理樣品組(fgez1～4)的活性變高，尤其是可以確定fgez2和fgez3的活性大體較高。因此，我們認(rèn)為需要確認(rèn)由兩個(gè)酵素并行處理法獲取的樣品與單一酵素處理獲取的樣品的活性差異是否顯現(xiàn)。

實(shí)施例3、分子量分布的測(cè)定

根據(jù)用經(jīng)過(guò)酵素處理的4種多糖組分樣品(fgez1～4)所做的免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以判定與熱水提取物(fgwo)相比，用纖維素(ez2)和α-amylase(ez3處理時(shí)的水參的免疫活性提升最有效果。因此，用hplc對(duì)熱水提取多糖提取物(fgwo)和酵素處理多糖組分(fgez2，fgez3)等的分子量分布進(jìn)行比較并分析。

為了測(cè)定分子量，取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和熱水及用加水分解酵素處理的多糖的樣品各20mg放在0.2mnacl1ml中溶解，然后用膜過(guò)濾紙過(guò)濾，用于hplc(jascoco.，japan)分析。使用的column用了gs520(7.5mm×300mml，showadenkoco.，toyko，japan)+gs320(8.0mm×300mml，showadenkoco.，toyko，japan)，過(guò)渡階段則使用0.2mnacl作為溶劑，樣品注入量為20ul，流速為0.4ml/min，用折光率檢測(cè)器(jascoco.，toyko，japan)檢出。片劑多糖的分子量是將普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)將fluka產(chǎn)品(molecularsize；10k，48.8k，366k)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后進(jìn)行比較。

其結(jié)果如圖8所示，熱水提取多糖提取物(fgwo)時(shí)，分子量是10k以上的3個(gè)高分子組分；纖維素(ez2)進(jìn)行酵素處理時(shí)，分子量是10k以上的2個(gè)高分子組分和1個(gè)以上的低分子組分，其分布與fgwo相似。反之，用α-amylase(ez3)進(jìn)行酵素處理時(shí)，分為10k以上的2個(gè)高分子組分和10k以下的3～4個(gè)以上的低分子組分。

實(shí)施例4、根據(jù)酵素并行處理法，水參源新型免疫增強(qiáng)多糖組分制劑

在100g水參粉末中加入5～20倍(w/v)的蒸餾水使其懸浮后，先后進(jìn)行2種(ez2，ez3)加水分解酵素處理。即，初期的懸浮液的溫度和ph值調(diào)整為50～60℃，4.5～6.0，然后添加ez2的酵素，產(chǎn)生了一天的反應(yīng)后，反應(yīng)物的溫度調(diào)整至85～90℃，調(diào)整之后添加ez3的酵素，發(fā)生了9～12小時(shí)的反應(yīng)之后，將最終反應(yīng)物在101℃的溫度下處理20分鐘，誘導(dǎo)酵素鈍性化之后，在6，500×g進(jìn)行20分鐘的離心分離后去除殘?jiān)?，分離后的精華液的最終濃度達(dá)到80％，然后再添加冷乙醇，放置一晚，使多糖沉淀。由此生成的沉淀物放入少量的蒸餾水中溶解，用透析膜(membranefilterationproducts，inc.，seguintexas，usa；mwc06,000～8,000)去除低分子物質(zhì)，凍結(jié)干燥后獲取酵素處理多糖組分。

實(shí)施例5、酵素并行處理法樣品在巨噬細(xì)胞刺激下的細(xì)胞因子的產(chǎn)生活性

用實(shí)施例2中，2-2和2-3中相同的方法測(cè)定酵素處理樣品的細(xì)胞因子的生成活性。

5-1在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞刺激下的細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力

在經(jīng)酵素并行處理法的水參源多糖的刺激下，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的生成用elisa方法測(cè)定的結(jié)果，確認(rèn)了il-6、il-12的分泌是依賴(lài)于濃度而增加的。圖9中，所有樣品的il-6的量都比對(duì)照組更高，與fgwo相比較，酵素處理樣品組fgez2、fgez3、fgez2+3顯示出更好地活性。尤其是，酵素并行處理法樣品fgez2+3在100ug/ml的濃度下的數(shù)值是2033pg/ml，該數(shù)值是fgez2的1.8倍，fgez3的1.1倍，顯示出十分重要的活性，可以確認(rèn)酵素并行處理法(fgez2+3)比單一酵素處理(fgez2，fgez3)的活性更高。il-12的情況如圖10所示，與fgwo相比，酵素處理樣品組fgez2、fgez3、fgez2+3顯示出更高的活性。尤其是酵素并行處理法樣品fgez2+3在100ug/ml的濃度下的數(shù)值是683pg/ml，該數(shù)值是fgez2的1.5倍、fgez3的1.2倍，顯示出十分重要的活性，從而確認(rèn)了酵素并行處理法樣品il-12比單一酵素處理樣品更能提高活性。

5-2raw264.7細(xì)胞刺激下的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力

在經(jīng)并行酵素處理的水參源多糖的刺激下，用elisa法測(cè)定raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子生成的結(jié)果確認(rèn)了il-6，il-12的分泌是依賴(lài)于濃度而增加的。

il-6的情況如圖11所示，所有樣品都比對(duì)照組高，與fgwo相比，酵素處理樣品組fgez2、fgez3、fgez2+3顯示出更高的活性。尤其是并行酵素處理樣品fgez2+3在150ug/ml的濃度下的數(shù)值是646pg/ml，該數(shù)值是fgez2的1.3倍和fgez3的1.2倍，顯示出十分重要的活性，從而確認(rèn)了酵素并行處理法樣品的il-12活性比單一酵素處理樣品更高。

il-12的情況如圖12所示，與fgwo相比，酵素處理樣品組fgez2、fgez3、fgez2+3顯示出更高的活性。尤其是并行酵素處理的樣品fgez2+3在濃度100ug/ml下的數(shù)值是563pg/ml，該高數(shù)值分別是fgez2(389pg/ml)和fgez3(483pg/ml)的1.45倍(45％)和1.16(16％)倍左右，在150ug/ml的濃度下，fgez2+3顯示出的數(shù)值是659pg/ml，該數(shù)值是fgez2(412pg/ml)的1.6倍，同時(shí)也比f(wàn)gez3(644pg/ml)要高一些。從以上結(jié)果可以看出，fgez2+3顯示出了最重要最大的活性，并行酵素處理比單一酵素處理更能提高活性。

il-10的情況如圖13所示，除了fgwo以外，均出現(xiàn)了濃度依賴(lài)性增加的現(xiàn)象，在100ug/ml以上的濃度下，與fgwo相比，fgez2、fgez3、fgez2+3顯現(xiàn)了高活性。尤其是，雖然fgez2和fgez2+3顯現(xiàn)了有意義的數(shù)值變化，但fgez2+3的數(shù)值則高了些許，所以可以確認(rèn)在并行酵素處理時(shí)，細(xì)胞因子的活性可以有一定水平的提升。

tnf-α的情況如圖14所示，fgwo和fgez2、fgez3各自進(jìn)行酵素處理的結(jié)果之間雖然沒(méi)有差異，但可以確認(rèn)用fgez2+3并行酵素處理時(shí)，活性增加。這一結(jié)果反映了通過(guò)單一的酵素處理不能達(dá)到的免疫活性增加卻可以通過(guò)并行酵素處理達(dá)到這一事實(shí)。

因此，通過(guò)并行酵素處理獲取的樣品fgez2+3的活性的變化體現(xiàn)在大部分的細(xì)胞因子中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純的熱水提取物fgwo以及通過(guò)單一酵素處理獲取的fgez2、fgez3的活性，其對(duì)消滅細(xì)胞不產(chǎn)生影響，可考慮作為有效的免疫活性材料加以開(kāi)發(fā)。

實(shí)施例6、進(jìn)行酵素并行處理法的水參源免疫增強(qiáng)多糖材料的制造和分析

6-1進(jìn)行酵素并行處理法的水參源免疫增強(qiáng)多糖材料的制造

綜合以上所有的研究結(jié)果，免疫活性較高的酵素并行處理法水參源免疫增強(qiáng)多糖材料(fgez0)的制造工序如圖15所示，據(jù)此，用酵素并行處理法制造了水參源免疫增強(qiáng)多糖材料(fgez0)。

在100g水參粉末中加入5～20倍(w/v)的蒸餾水使其懸浮后，先后進(jìn)行2種(ez2，ez3)加水分解酵素處理。即，初期的懸浮液的溫度和ph值調(diào)整為50～60℃，4.5～6.0，然后添加ez2的酵素，產(chǎn)生一天反應(yīng)后，反應(yīng)物的溫度調(diào)整至85～90℃，之后再添加ez3的酵素，發(fā)生了9～12小時(shí)的反應(yīng)之后，將最終反應(yīng)物在101℃的溫度下處理20分鐘，誘導(dǎo)酵素鈍性化之后，在6,500×g進(jìn)行20分鐘的離心分離后去除殘?jiān)?，分離后的液體進(jìn)行uf處理，獲取分子量10k以上的多糖組分，將其用凍結(jié)干燥或噴霧干燥等方法進(jìn)行干燥，獲取免疫力增強(qiáng)活性加強(qiáng)的水參多糖組分(fgez0)。

6-2從理化上進(jìn)行分析

根據(jù)前面提出的工序，通過(guò)所制造的酵素并行處理法多糖組分(fgez0)的理化成分特性和hplc比較分子量分布等和熱水浸取物(fgwo)。

分析上述理化成分特性所得出的結(jié)果如表2所示。fgwo的結(jié)構(gòu)中含中性糖67.7％、糖醛酸30.4％、蛋白質(zhì)1.4％以及kdo0.5％，酵素并行處理法組分(fgez0)中的中性糖是73.8％，比f(wàn)gwo的含量高，而24.9％的糖醛酸和0.8％的蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，而高碳糖含量仍然是0.5％，沒(méi)有變化。

表2、用酵素并行處理法生產(chǎn)的樣品成分的分析結(jié)果

6-3分子量分析

根據(jù)最恰當(dāng)?shù)墓ば?，?duì)所制造的酵素并行處理法多糖組分的分子量分布的分析采用了與實(shí)施例3相同的方法。

結(jié)果如圖16所示，在熱水浸取物多糖提取物(fgwo)的情況下，分子量10kda以上的是高分子組分有3個(gè)，400kda以上的多糖體具有較廣范圍的分子量，而酵素并行處理法后利用mwco50kcassette進(jìn)行uf處理的情況下(b)，10kda以上高分子組分有2個(gè)，10kda以下的低分子組分稍微被去除了一點(diǎn)。

6-4raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性及nitricoxide(一氧化氮)的產(chǎn)生能力

為了確認(rèn)用酵素并行處理法制造的新型多糖材料raw264.7細(xì)胞是否存在毒性，實(shí)施mttassay時(shí)采用了與實(shí)施例2中2-1相同的辦法。

結(jié)果如圖17所示，水參多糖樣品fgwo和fgez0在50、100、150ug/ml的濃度下進(jìn)行細(xì)胞處理時(shí)，不同的濃度中都出現(xiàn)了80％以上的存活率，說(shuō)明在50～150ug/ml的濃度范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞毒性未產(chǎn)生大的影響。反而，從所有濃度中顯示出100％以上的存活率可以推測(cè)，可能存在有助于細(xì)胞發(fā)育的因子。

6-5raw264.7細(xì)胞刺激下細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力

對(duì)用酵素并行處理法制造的新型多糖材料的raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力的測(cè)定采用了與實(shí)施例2～3相同的elisa法。

從這一結(jié)果可以確認(rèn)il-6、tnf-α的分泌依賴(lài)于濃度而增加。如圖18所示，il-6的情況下，所有樣品的都比對(duì)照組更高，與fgwo相比，新型多糖材料fgez0在所有濃度下都顯示出了很高的活性。尤其是，新型多糖材料fgez0在50、100、150ug/ml的濃度下的數(shù)值分別是169、363、1051pg/ml，與fgwo相比，在所有濃度范圍內(nèi)的活性增加都是2倍以上。另外，統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果表明，存在著有意義的差異，可以確認(rèn)通過(guò)酵素并行處理獲取的新型多糖材料的免疫活性比單純的熱水浸取法更具效果。

如圖19所示，tnf-α的情況也是如此，與fgwo相比，新型多糖材料fgez0在所有濃度下都顯示出了很高的活性。尤其是，新型多糖材料fgez0在50、100、150ug/ml的濃度下的數(shù)值分別是3340、3674、4332pg/ml，與fgwo相比，在所有濃度范圍內(nèi)的活性增加都是2倍以上。尤其是在低濃度下的活性增加達(dá)到了4倍以上，而高濃度150ug/ml下數(shù)值的增加之所以稍顯微弱，是因?yàn)闃悠返幕钚缘臋z測(cè)是以陽(yáng)性對(duì)照組lps所定的為標(biāo)準(zhǔn)，是最大限度的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)認(rèn)為在低濃度下活性增加反而更多則是因?yàn)橛昧松倭康臉悠凡湃〉昧烁蟮男Ч?。我們十分期待在產(chǎn)業(yè)化之后，能很好地利用這一材料，即使投入得經(jīng)濟(jì)實(shí)惠也能得到肯定的評(píng)價(jià)。

得出的結(jié)論是，水參源多糖被認(rèn)為是對(duì)人體有益的，具有激發(fā)免疫機(jī)能的效果。與單純的熱水浸取法相比，對(duì)水參采用酵素并行處理法分離多糖，能獲取更為優(yōu)質(zhì)的免疫活性多糖。

綜上所述，本發(fā)明提供一種制造具有免疫機(jī)能增強(qiáng)活性的經(jīng)酵素處理的人參源多糖組分的方法及根據(jù)上述制造方法制造的多糖組分，包括在人參中先后加入淀粉酶和纖維素酶等2種以上酵素進(jìn)行酵素處理的步驟和從經(jīng)過(guò)上述酵素處理的人參水解產(chǎn)物中獲取10kda以上分子量的多糖組分的步驟。本發(fā)明的制造方法是通過(guò)包括淀粉酶和纖維素酶的復(fù)合酵素處理工序，可經(jīng)濟(jì)實(shí)惠地制造免疫活性增強(qiáng)效果優(yōu)異的多糖組分，本發(fā)明的多糖組分與故有的人參源多糖相比，免疫增強(qiáng)效果更加顯著，在免疫增強(qiáng)食品生產(chǎn)上十分有用。