相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年5月2日提交的美國臨時(shí)申請第61/987,695號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請通過引用整體并入本文。

本公開通常涉及培養(yǎng)微藻(microalgae)的方法。尤其是，所述方法能夠用于微藻生物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的增產(chǎn)。本公開還涉及從本文描述的一種或多種方法所培養(yǎng)的微藻中分離的和/或純化的微藻生物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。

背景技術(shù)：

歷史上，電力生產(chǎn)和現(xiàn)代運(yùn)輸所需的能量主要由化石燃料提供。雖然人類已經(jīng)開發(fā)了其它能源(例如：風(fēng)能、太陽能、水力發(fā)電、核能等)并且在全球范圍中使用，但是我們?nèi)匀粐?yán)重依賴化石燃料(例如汽油、柴油、燃料油、原油、煤和天然氣)的燃燒以滿足我們對(duì)能源和運(yùn)輸需求。然而，隨著全球現(xiàn)代化對(duì)化石燃料能源的需求急劇增長，有些人預(yù)計(jì)全球能源需求在未來幾十年將翻一番。

全球經(jīng)濟(jì)對(duì)能源需求的增加，已經(jīng)對(duì)化石燃料及其產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锂a(chǎn)品的成本造成了越來越大的壓力。當(dāng)人們認(rèn)為能源生產(chǎn)只是碳?xì)浠衔锏亩喾N關(guān)鍵用途之一時(shí)，這種趨勢尤其令人擔(dān)憂。特別地，許多行業(yè)，包括基于生產(chǎn)或使用復(fù)合材料、塑料和工業(yè)化學(xué)品的那些工業(yè)，極大地依賴于作為其工藝和產(chǎn)品原料的碳?xì)浠衔锏目色@得性。因此，找到作為能源和燃料來源的化石燃料的有效替代品，不僅有助于滿足世界對(duì)能源日益增長的需求，而且還可以降低化石燃料帶來的產(chǎn)品成本。

生物質(zhì)中的能量提供了一種方法，既能潛在地減少了溫室氣體排放又能降低對(duì)基于化石燃料的基礎(chǔ)設(shè)施的需求，并且，生物能通常被認(rèn)為是解決可再生能源方案的重要資產(chǎn)。生物系統(tǒng)通過嚴(yán)格調(diào)節(jié)的代謝網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)一系列生化反應(yīng)，從而完成能量的利用。

微生物，例如微藻，有希望作為可再生原料，用于生產(chǎn)從乙醇到生物柴油的一系列生物燃料。藻類屬于一種種類繁多的水生光合生物，通常分為大型藻類(即海藻)和微藻類，微藻類通常是單細(xì)胞的。雖然藻類生物燃料領(lǐng)域仍處于起步階段，但微藻作為一種用于清潔、可持續(xù)燃料生產(chǎn)的資源是具有巨大潛力的。藻類是由太陽能生產(chǎn)化學(xué)能的有效光合生物，根據(jù)報(bào)道，當(dāng)今大量的化石燃料，特別是石油，起源于史前大量繁殖的藻類。作為單細(xì)胞生物，由于它們?nèi)狈χС趾妥甜B(yǎng)陸生植物所需的大分子結(jié)構(gòu)和維管束組織，因此，微藻能夠產(chǎn)生大量的生物質(zhì)作為小分子生物燃料前體。因此，藻類提供了將碳和其它有機(jī)底物轉(zhuǎn)化為生物燃料的一種最直接途徑。此外，這些水生微生物的大的表面積與體積比有利于吸收營養(yǎng)物質(zhì)，這反映在許多物種中觀察到的快速生長速率。

與陸地生物能源作物不同，微藻不需要肥沃的土地或大量的灌溉，而且它們可以被連續(xù)收獲。有幾種微藻甚至不需要淡水，可以在咸水、海水、甚至超鹽水中生長。此外，由于微藻通過光合作用消耗二氧化碳(co2)，因此大規(guī)模培養(yǎng)微藻甚至可以用于治理化石燃料燃燒排放的co2。藻類生物質(zhì)還能產(chǎn)生可供銷售的次級(jí)副產(chǎn)物，例如抗氧化色素、食用蛋白和其它替代燃料作物所缺乏的營養(yǎng)油。然而，藻類生物燃料的大規(guī)模商業(yè)化依然存在障礙。這些挑戰(zhàn)包括：(1)需要提高海藻油的生產(chǎn)力；和(2)需要改進(jìn)利用藻類產(chǎn)生的油所需的加工技術(shù)。

附圖說明

根據(jù)以下說明和所附權(quán)利要求，并結(jié)合附圖，本發(fā)明所公開的具體實(shí)施方式將變得更加顯而易見。

圖1是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧的情況下進(jìn)行培養(yǎng)之前或開始培養(yǎng)時(shí)微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第1天0900小時(shí)以400x的放大倍數(shù)獲得。

圖2是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并且引入氧的情況下培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第1天2000小時(shí)以1000x的放大倍數(shù)獲得。

圖3是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并且引入氧的情況下培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第2天0800小時(shí)以1000x的放大倍數(shù)獲得。

圖4是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并且引入氧的情況下培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第2天1000小時(shí)以1000x的放大倍數(shù)獲得。

圖5是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并且引入氧的情況下培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第2天1200小時(shí)以1000x的放大倍數(shù)獲得。

圖6是根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并且引入氧的情況下培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片在第3天0800小時(shí)以400x的放大倍數(shù)獲得。

圖7是描述根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)培養(yǎng)過程中指定時(shí)間點(diǎn)小球藻培養(yǎng)物生物質(zhì)的圖。

圖8是描述根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在另一異養(yǎng)培養(yǎng)過程中指定時(shí)間點(diǎn)小球藻培養(yǎng)物生物質(zhì)的圖。

發(fā)明詳述

本文描述了培養(yǎng)微藻的方法。在特定的具體實(shí)施方式中，本文描述的方法對(duì)于提供下述一種或多種物質(zhì)的良好生產(chǎn)是有用的：微藻生物質(zhì)、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。在某些此類具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可以從微藻培養(yǎng)物得到高水平的脂質(zhì)產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于生產(chǎn)微藻的培養(yǎng)物，其中微藻細(xì)胞含有高濃度的脂質(zhì)，并且顯著濃度的脂質(zhì)釋放至培養(yǎng)基中。例如，在某些具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可以提供微藻培養(yǎng)物，其中微藻積聚了至少是它們細(xì)胞重量的25％的脂質(zhì)，并且發(fā)酵液包括至少10％(v/v)的脂質(zhì)。如本文所描述，根據(jù)本發(fā)明的方法還可適合于提供用微藻培養(yǎng)物進(jìn)行的良好的或理想的生物質(zhì)生產(chǎn)和/或良好的或理想的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

本文還描述了實(shí)施所述方法的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)的具體實(shí)施方式可包括一個(gè)或多個(gè)用于培養(yǎng)微藻的生物反應(yīng)器。適合于實(shí)施本文描述的方法的生物反應(yīng)器系統(tǒng)可包括如下的一個(gè)或多個(gè)：一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器；一個(gè)或多個(gè)流體、氣體和/或其它介質(zhì)來源；循環(huán)管線(lines)或管道(conduits)，用于輸送流體、氣體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)的藻類，等等；端口(ports)，用于流體、氣體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)的藻類等的輸入或輸出；一個(gè)或多個(gè)閥門，用于控制流體、氣體和/或其它介質(zhì)的流量；一個(gè)或多個(gè)泵；一個(gè)或多個(gè)儲(chǔ)槽；和一個(gè)或多個(gè)壓力槽，用于容納加壓的流體、氣體和/或其它介質(zhì)。在某些具體實(shí)施方式中，本文描述的生物反應(yīng)器系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)過濾器，用于收集、分離、遞送和/或濃縮微藻、生長培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基的組分、一種或多種工藝氣體、和/或存在于或被引入至生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的其它材料。

各種不同種類的微藻可適合用于本文描述的方法。在一些具體實(shí)施方式中，可使用單一種類的微藻，但是在其它具體實(shí)施方式中，本文描述的方法中使用的培養(yǎng)物可包括兩種、三種、四種或更多種類的藻類。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，本文描述的方法中使用的培養(yǎng)物可包括兩種、三種、四種或更多種共同培養(yǎng)的藻類。使用的微藻可基于若干因素中的一種或多種來進(jìn)行選擇，所述因素包括，例如，期望的油產(chǎn)率、期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、接觸工藝條件時(shí)微藻的生長與穩(wěn)定性、和微藻提供可重復(fù)結(jié)果的能力，等等?？捎糜诒疚拿枋龅姆椒ǖ奈⒃宸N類的例子包括，但不限于，淡水和海洋微藻種類，諸如纖維藻屬(ankistrodesmus)，葡萄藻屬(botryococcus)，小環(huán)藻屬(cyclotella)，杜氏藻屬(dunaliella)，菱板藻屬(hantzschia)，微球藻屬(nannochloris)，菱形藻屬(nitzschia)，褐指藻屬(phaeodactylum)，柵列藻屬(scenedesmus)，裂絲藻屬(stichococcus)，扁藻屬(tetraselmis)，海鏈藻屬(thalassiosira)，隱甲藻屬(crypthecodinium)，新綠藻屬(neochloris)，或裂殖壺菌屬(schizochytrium)種類。在特定的具體實(shí)施方式中，微藻可以是小球藻屬(chlorella)的一種，例如，但不限于，小球藻(chlorellafusca)，原始小球藻(c.protothecoides)，蛋白核小球藻(c.pyrenoidosa)，凱氏小球藻(c.kessleri)，普通小球藻(c.vulgaris)，啤酒小球藻(c.saccharophila)，沙堆小球藻(c.sorokiniana)，或橢圓小球藻(c.ellipsoidea)。在某些具體實(shí)施方式中，微藻可選自海洋微藻種類，諸如微擬球藻(nannochloropsis)種類。

除非另有說明，否則本文描述的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)材料和設(shè)備來實(shí)施。例如，固體和液體生長培養(yǎng)基通?？蓮亩喾N來源購買，適合多種微生物菌株的特定培養(yǎng)基的制備說明可以從http://www.utex.org/在線找到，該網(wǎng)站是由德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校針對(duì)藻類的培養(yǎng)物保藏(utex)而進(jìn)行維護(hù)的。通過咨詢前面指出的url，或者通過咨詢保藏微生物培養(yǎng)物的其它組織，例如，sag、ccap或ccala，能夠確定本文描述的方法可使用的合適培養(yǎng)基。sag是指哥根廷大學(xué)(哥根廷，德國)的藻類培養(yǎng)物保藏中心(culturecollectionofalgae)，ccap是指由蘇格蘭海洋科學(xué)協(xié)會(huì)(蘇格蘭，聯(lián)合王國)管理的藻類和原生動(dòng)物培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，ccala是指捷克共和國植物研究所的海藻實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)。

雖然本領(lǐng)域先前描述的若干方法利用工程微藻或轉(zhuǎn)基因微藻來提高微藻脂質(zhì)產(chǎn)量，但是本文描述的方法不需要對(duì)微生物本身進(jìn)行這樣的修飾。如文本所描述以及實(shí)施例詳細(xì)介紹的，利用非工程微藻或未經(jīng)基因修飾的微藻，本文描述的方法的具體實(shí)施方式可快速獲得高密度微藻培養(yǎng)物，培養(yǎng)的微藻中具有高脂質(zhì)含量，并且發(fā)酵液中具有高濃度胞外脂質(zhì)。在一些其它的具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可利用工程微藻或轉(zhuǎn)基因微藻。

容易理解的是，本文通常描述的具體實(shí)施方式是示例性的。下面對(duì)各種具體實(shí)施方式的更詳細(xì)的描述并非意在限制本發(fā)明的范圍，而僅僅是代表各種具體實(shí)施方式。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明范圍的前提下可以改變本文描述的方法的步驟順序或操作。換言之，除非特定的步驟順序或操作對(duì)于具體實(shí)施方式的正確操作是必須的，否則特定步驟或操作的順序或使用可被修改。

除非另有說明，否則本文使用的技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域公知的正常含義。為了清楚起見，結(jié)合實(shí)例對(duì)下述術(shù)語進(jìn)行明確定義。

如本文所用，術(shù)語“生物質(zhì)”是指由細(xì)胞生長和/或增殖所產(chǎn)生的物質(zhì)。生物質(zhì)可包含細(xì)胞和/或細(xì)胞內(nèi)容物以及細(xì)胞外物質(zhì)。細(xì)胞外物質(zhì)包括，但不限于，細(xì)胞分泌的化合物(即，脂質(zhì))。

如本文所用，術(shù)語“生物反應(yīng)器”是指在其中培養(yǎng)(可選地，懸浮培養(yǎng))細(xì)胞的殼體(enclosure)或部分殼體。生物反應(yīng)器的類型包括光生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐。如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵罐”是指適合于異養(yǎng)培養(yǎng)和/或微藻培養(yǎng)物增殖的生物反應(yīng)器。本文描述的用于培養(yǎng)、繁殖和收獲藻類的系統(tǒng)包括至少一個(gè)生物反應(yīng)器，并且，在特定的具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)包括至少一個(gè)發(fā)酵罐。

如本文所用，術(shù)語“共培養(yǎng)”(co-culture)及其變型，例如“共同培養(yǎng)”(co-cultivate)，是指在相同培養(yǎng)物或生物反應(yīng)器中存在兩種或多種類型或種類的藻類細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“培養(yǎng)的”(cultivated)及其變型，是指通過使用預(yù)設(shè)的培養(yǎng)條件使一種或多種細(xì)胞有目的的生長(即細(xì)胞尺寸、細(xì)胞內(nèi)容物和/或細(xì)胞活性的增加)和/或繁殖(即通過有絲分裂使細(xì)胞數(shù)目增加)。生長與繁殖的組合可稱為增殖。所述一種或多種細(xì)胞可以是微生物例如微藻的細(xì)胞。預(yù)設(shè)條件的例子包括在生物反應(yīng)器中使用確定成分培養(yǎng)基(definedmedium)(具有已知的特征，例如ph、離子強(qiáng)度、碳源(即碳源的類型和/或水平))、規(guī)定的溫度、氧含量或水平、氧輸送速率、二氧化碳水平和生長。該術(shù)語并不指自然條件下或者其它沒有直接人為干預(yù)的條件下微生物的生長和繁殖，例如，最終石化產(chǎn)生地質(zhì)原油的有機(jī)體自然生長。

如本文所用，術(shù)語“固定碳源”是指在常溫常壓下以固體或液體形式存在的含碳分子。

如本文所用，術(shù)語“碳?xì)浠衔铩笔侵福?a)只含氫原子和碳原子的分子，其中碳原子共價(jià)連接形成線型的、分枝的、環(huán)狀或部分環(huán)狀主鏈，氫原子連接至主鏈上；或者(b)僅主要含有氫原子和碳原子的分子，和通過一至四個(gè)化學(xué)反應(yīng)能夠轉(zhuǎn)變?yōu)橹缓瑲湓雍吞荚拥姆肿印：笳叩姆窍拗菩詫?shí)例包括在碳原子和氫原子之間含有氧原子以形成醇分子的烴類，以及含有單一氧原子的醛類。將醇還原為只含有碳原子和氫原子的烴的方法是已知的。碳?xì)浠衔锏牧硪粋€(gè)例子是酯，其中有機(jī)基團(tuán)代替含氧酸的一個(gè)氫原子(或多于一個(gè)的氫原子)。碳?xì)浠衔锏姆肿咏Y(jié)構(gòu)從最簡單的結(jié)構(gòu)向大分子量復(fù)雜結(jié)構(gòu)變化，其中，最簡單的結(jié)構(gòu)是甲烷(ch4)形式，甲烷是天然氣的組成成分，大分子量復(fù)雜結(jié)構(gòu)例如是原油、石油和瀝青中發(fā)現(xiàn)的瀝青質(zhì)。烴類可以是氣體、液體或固體形式或者是這些形式的任意組合，并且在主鏈上具有一個(gè)或多個(gè)位于相鄰碳原子之間的雙鍵或三鍵。因此，術(shù)語“碳?xì)浠衔铩卑ň€型的、分枝的、環(huán)狀的或部分環(huán)狀的烷烴、烯烴、脂質(zhì)和石蠟。實(shí)例包括，但不限于，丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷、三油精和鯊烯。

如本文所用，術(shù)語“疏水部分”(hydrophobicfraction)是指與水相相比在疏水相中更易溶解的材料部分(portion)或部分(fraction)。疏水部分基本不溶于水中和通常的非極性液體。

如本文所用，術(shù)語“營養(yǎng)的限制性濃度”是指培養(yǎng)物中限制培養(yǎng)的有機(jī)體繁殖的濃度。“營養(yǎng)的非限制性濃度”是在給定的培養(yǎng)時(shí)期支持最大繁殖的濃度。因此，當(dāng)存在營養(yǎng)的限制性濃度時(shí)，給定的培養(yǎng)時(shí)期所產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)目低于營養(yǎng)是非限制性的時(shí)候。當(dāng)營養(yǎng)以大于支持最大繁殖所需要的濃度存在時(shí)，稱培養(yǎng)物中營養(yǎng)“過?！薄?/p>

如本文所用，術(shù)語“脂質(zhì)”和“脂類”是指一類碳?xì)浠衔?，它們在非極性溶劑(諸如乙醚和氯仿)中是可溶的并且在水中是相對(duì)或完全不溶的。脂質(zhì)分子具有這些性質(zhì)是因?yàn)樗鼈冎饕砷L的碳?xì)浠衔镂膊拷M成，這些長的碳?xì)浠衔镂膊吭谛再|(zhì)上是疏水的。脂質(zhì)的例子包括：脂肪酸(飽和的和不飽和的)；甘油酯或甘油糖脂(glycerolipids)(諸如單甘酯，雙甘酯，甘油三酸酯，或者中性脂肪，和甘油磷脂(phosphoglycerides)或甘油磷脂(glycerophospholipids))；非甘油酯(鞘脂類，包括膽固醇和甾類激素在內(nèi)的固醇脂類，包括萜類、脂肪醇、蠟和聚酮在內(nèi)的異戊烯醇脂類(prenollipids))；和復(fù)合脂質(zhì)衍生物(糖-連接的脂質(zhì)或糖脂，和蛋白質(zhì)-連接的脂質(zhì))。如本文所用，術(shù)語“脂肪”是指稱為“三?；视王ァ钡闹|(zhì)的亞組。

如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞溶解”(lysis)和“細(xì)胞溶解”(lysing)是指脂膜的破壞，并且，即便存在，有機(jī)體的細(xì)胞壁足以釋放至少一些細(xì)胞內(nèi)容物。由破壞靶細(xì)胞完整性的已知機(jī)械、病毒學(xué)或滲透學(xué)的機(jī)制能夠?qū)嵤┘?xì)胞溶解。在某些具體實(shí)施方式中，通過“細(xì)胞裂解”(cytolysis)來實(shí)施細(xì)胞溶解，“細(xì)胞裂解”是指在低滲環(huán)境中細(xì)胞的溶解。細(xì)胞裂解由如下引起：過度滲透，或者水向細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)動(dòng)(水化(hyperhydration))引起細(xì)胞破裂。如本文所用，術(shù)語“溶菌產(chǎn)物”(lysate)是指含有溶解的細(xì)胞的內(nèi)容物的溶液、懸浮液或分散體。

如本文所用，術(shù)語“微藻”是指含有葉綠體并且可選地能夠進(jìn)行光合作用的真核微生物，或者是指能夠進(jìn)行光合作用的原核微生物。微藻包括：專性光合自養(yǎng)生物，其不能夠?qū)⒐潭ㄌ荚创x為能量，以及異養(yǎng)生物，其能夠只依靠固定碳源生存。微藻可以是指細(xì)胞分裂之后不久就從姐妹細(xì)胞分離的單細(xì)胞生物，諸如衣藻屬(chlamydomonas)，并且，還可以是指例如團(tuán)藻屬(volvox)的微生物，其是兩種不同細(xì)胞類型的簡單多細(xì)胞光合微生物。術(shù)語“微藻”還可以是指諸如小球藻屬和杜氏藻屬的細(xì)胞。術(shù)語“微藻”還可以包括顯示細(xì)胞-細(xì)胞粘附的其它微生物光合生物，諸如阿格門氏藻屬(agmenellum)、項(xiàng)圈藻屬(anabaena)和?？霸?pyrobotrys)。術(shù)語“微藻”還可以包括專性異養(yǎng)微生物，其已經(jīng)喪失了進(jìn)行光合作用的能力，諸如某些腰鞭毛蟲藻類。

如本文所用，術(shù)語“培養(yǎng)基”(media)、“營養(yǎng)培養(yǎng)基”(culturemedia)和“生長培養(yǎng)基”(growthmedia)是指與微藻一起被包括在光生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中的物質(zhì)，有助于產(chǎn)生和/或保持一種環(huán)境，在該種環(huán)境中能夠獲得具有所期望性質(zhì)的微藻培養(yǎng)物。此種培養(yǎng)基可以是固體或液體，典型地提供所期望的海藻生長所必需的一種或多種營養(yǎng)或物質(zhì)，并且，通常能夠從多種來源獲得。如上所述，適合多種微藻菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基制備說明可以從http://www.utex.org/在線找到，該網(wǎng)站是由德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校針對(duì)其藻類的培養(yǎng)物保藏(utex)而進(jìn)行維護(hù)的。通過咨詢保藏微生物培養(yǎng)物的其它組織，例如，sag、ccap或ccala，能夠確定本發(fā)明的方法可使用的其它合適培養(yǎng)基。sag是指哥根廷大學(xué)(哥根廷，德國)的藻類培養(yǎng)物保藏中心(culturecollectionofalgae)，ccap是指由蘇格蘭海洋科學(xué)協(xié)會(huì)(蘇格蘭，聯(lián)合王國)管理的藻類和原生動(dòng)物培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，ccala是指捷克共和國植物研究所的海藻實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)。

微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)

本文描述的方法可以包括在異養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)微藻培養(yǎng)物。雖然微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的(參見，例如，miaoandwu,j.biotechnology,2004,11:85-93andmiaoandwu,biosourcetechnology(2006)97:841-846)，本文描述的方法向此類方法中引入了新的方面，并且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本文描述的異養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)微藻培養(yǎng)物為高密度微藻培養(yǎng)物的快速繁殖提供了有利條件，其中，能夠從前述高密度微藻培養(yǎng)物收獲、獲得、提取或分離到脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和海藻生物質(zhì)。雖然本文描述的方法和系統(tǒng)一般是在脂質(zhì)或產(chǎn)碳?xì)浠衔镌孱惖那闆r下進(jìn)行描述的，但是本發(fā)明的方法和系統(tǒng)并不限于此。如本文所詳細(xì)描述的，一系列微藻可以采用本文描述的方法和系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，并且，培養(yǎng)條件可以根據(jù)收獲的資源來進(jìn)行調(diào)整。特別地，在某些具體實(shí)施方式中，可以將培養(yǎng)條件調(diào)整為著重于生物質(zhì)、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的生產(chǎn)。在某些具體實(shí)施方式中，可以將微藻的培養(yǎng)條件調(diào)整為提高生物質(zhì)中選定的組分或物質(zhì)的產(chǎn)量。例如，包括但不限于ph、溫度、營養(yǎng)組成和/或營養(yǎng)濃度的條件可以被修改以調(diào)整或提高生物質(zhì)中選定的組分或物質(zhì)的產(chǎn)量。

通常，在本文描述的方法中，可以將微藻接種至盛裝于發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。接種之后，在細(xì)胞開始生長之前，有一段遲滯期(也稱為“遲滯階段”)。遲滯期之后，生長速率將穩(wěn)步提高，并進(jìn)入對(duì)數(shù)期(也稱為“指數(shù)期”)。反過來，指數(shù)期之后生長減慢，原因是營養(yǎng)減少和/或有毒物質(zhì)增加。在緩慢生長之后，生長停止，微藻細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期或穩(wěn)定狀態(tài)，這取決于提供給細(xì)胞的具體環(huán)境。培養(yǎng)物中的微藻細(xì)胞所進(jìn)行的脂質(zhì)生產(chǎn)可發(fā)生在對(duì)數(shù)期或之后，包括穩(wěn)定期，其中營養(yǎng)可被提供或可獲得以便在沒有細(xì)胞分裂時(shí)脂質(zhì)生產(chǎn)仍繼續(xù)。

可以從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到商業(yè)規(guī)模來大批量培養(yǎng)微藻。已知的發(fā)酵罐，例如已知的鋼制發(fā)酵罐，可用于調(diào)節(jié)出多種培養(yǎng)容積以用于根據(jù)本發(fā)明描述的微藻培養(yǎng)物的異養(yǎng)培養(yǎng)。與用于啤酒和/或葡萄酒生產(chǎn)的發(fā)酵罐類似的發(fā)酵罐是合適的，例如用于酒精生產(chǎn)的大型、商業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐。發(fā)酵可以是大規(guī)模液體發(fā)酵，例如在懸浮培養(yǎng)物中進(jìn)行，并且，如本文所描述，發(fā)酵步驟可以包括從細(xì)胞的少量培養(yǎng)物開始，所述少量培養(yǎng)物通過細(xì)胞的生長和繁殖能擴(kuò)大為大生物量。

適合微藻異養(yǎng)生長的培養(yǎng)基可以盛裝在用于本文描述的方法的發(fā)酵罐中。雖然生長培養(yǎng)基可包括固體和液體組分，但是生長培養(yǎng)基通常是為微藻培養(yǎng)提供有利環(huán)境的水溶液、懸浮液(suspension)、分散體(dispersion)、乳液(emulsion)或漿體(slurry)。一旦向包含在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基中接種微藻培養(yǎng)物并且微藻開始生長，就形成了發(fā)酵液。發(fā)酵液包括生長培養(yǎng)基以及非活細(xì)胞物質(zhì)，微藻排泄的廢產(chǎn)物，和微藻分泌的脂質(zhì)或其它物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵液”不包括發(fā)酵罐中包含的由微藻的完整活細(xì)胞組成的部分。

引入至發(fā)酵罐的微藻接種物可包括單一種類的微藻或者共培養(yǎng)的兩種或更多種。此外，多種不同種類的微藻可適合用于本文描述的方法，并且在特定的具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)的微藻可包括本文詳細(xì)描述的一種或多種微藻。在接種至發(fā)酵罐之前，可以先為異養(yǎng)繁殖制備或“準(zhǔn)備”微藻接種物。在一些具體實(shí)施方式中，用于接種發(fā)酵罐的微藻可通過首先在自養(yǎng)繁殖條件下(諸如光生物反應(yīng)器)培養(yǎng)需要的微藻種類而產(chǎn)生。在某些此類具體實(shí)施方式中，可以采用用于選定的微藻自養(yǎng)培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件。當(dāng)微藻接種物通過使用自養(yǎng)生長條件首先培養(yǎng)微藻而產(chǎn)生時(shí)，可以繁殖微藻自養(yǎng)培養(yǎng)物以提供具有1％至4％藻類固體含量的培養(yǎng)物。或者，可以繁殖自養(yǎng)培養(yǎng)物以提供具有大約0.5g/l至大約50g/l藻類固體含量的培養(yǎng)物。在特定的具體實(shí)施方式中，可以繁殖培養(yǎng)物以提供具有選自如下的藻類固體含量的培養(yǎng)物：大約1g/l至大約50g/l，大約1g/l至大約40g/l，大約1g/l至大約30g/l，大約1g/l至大約20g/l，大約1g/l至大約10g/l，和大約1g/l至大約6g/l。在某些具體實(shí)施方式中，藻類固體含量可以是生物質(zhì)的度量。一旦獲得具有所需固體含量的自養(yǎng)培養(yǎng)物，等份的培養(yǎng)物就可以被去除和濃縮(例如，通過離心或過濾(例如通過膜過濾))。如果需要，可對(duì)濃縮的微藻進(jìn)行洗滌與再次濃縮。為了形成加入到發(fā)酵罐中的接種物，可以將自養(yǎng)準(zhǔn)備和濃縮的微藻在選擇培養(yǎng)基中重新懸浮以提供所需體積和細(xì)胞密度的接種物。

一旦發(fā)酵罐中接種了所需的微藻，就可以在控制的培養(yǎng)條件下進(jìn)行微藻的培養(yǎng)或共培養(yǎng)(繁殖兩種或多種微藻)。隨著發(fā)酵罐中培養(yǎng)物成熟，可以監(jiān)控和調(diào)整培養(yǎng)條件。如本文所描述，可以控制培養(yǎng)基的溫度、ph、營養(yǎng)曲線和輸入到微藻培養(yǎng)物中的氧氣流量。

用于黑暗期發(fā)酵罐的培養(yǎng)基可包括適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)源供生長、繁殖和目標(biāo)資源(例如藻類生物質(zhì)、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))的生產(chǎn)。在某些具體實(shí)施方式中，黑暗期發(fā)酵罐可包括不透明或基本不透明的殼體(例如，儲(chǔ)槽(tank)或容器(vessel))。用于培養(yǎng)基的合適營養(yǎng)源可包括原材料，例如下述的一種或多種：固定碳源，諸如右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、n-乙酰葡糖胺、甘油、弗羅里多苷(floridoside)、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纖維素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清或糖蜜；脂肪源，諸如脂肪或植物油；氮源，諸如蛋白質(zhì)、大豆粉、玉米漿、氨(純的或鹽形式的)、硝酸酯或硝酸鹽、分子氮或酵母提取物；磷源，諸如磷酸鹽；和一種或多種輔酶或輔酶因子。培養(yǎng)基可利用的其它碳源，特別是葡萄糖源，包括小麥、土豆、稻和高粱。

在各種具體實(shí)施方式中，k(斯科特實(shí)驗(yàn)室)，一種混合的復(fù)合酵母營養(yǎng)物，可以被添加或引入至培養(yǎng)基。也可以使用其它混合的復(fù)合酵母營養(yǎng)。在一些具體實(shí)施方式中，所述混合的復(fù)合酵母營養(yǎng)可包括硫酸鎂、泛酸鈣、非活性酵母、硫胺素、葉酸、煙酸和/或磷酸氫二銨中的一種或多種。

在某些具體實(shí)施方式中，營養(yǎng)物酵素(ferm)(例如，營養(yǎng)物vitend^tm(斯科特實(shí)驗(yàn)室))，一種特定的非活性酵母，可以被添加或引入至培養(yǎng)基。也可以使用其它特定的非活性酵母。

在一些具體實(shí)施方式中，微量礦物滴(微量礦物研究)，一種微量礦物添加劑，可以被添加或引入至培養(yǎng)基。也可以使用其它微量礦物添加劑。在多種具體實(shí)施方式中，微量礦物添加劑可包括鈣(例如碳酸鈣)、鐵(例如甘氨酸螯合鐵)、碘、鎂(例如氧化鎂)、氯化物(例如氯化鉀)、硅、硒、磷、鉻、錳、銅、鉬、鋅、釩、其它離子微量元素和/或其它微量元素中的一種或多種。在多種其它的具體實(shí)施方式中，微量礦物添加劑可包括如下中的一種或多種：鋁、銻、砷(例如無機(jī)砷)、鋇、鈹、鉍、硼、溴化物、鎘、鈣、碳酸鹽、鈰、銫、氯化物、鉻、鈷、銅、鏑、鉺、銪、氟化物、釓、鎵、鍺、金、鉿、鈥、銦、碘、銥、鐵、鑭、鉛、鋰、镥、鎂、錳、汞、鉬、釹、鎳、鈮、鋨、鈀、磷、鉑、鉀、鐠、錸、銠、銣、釕、釤、鈧、硒、硅、銀、鈉、鍶、硫酸鹽/硫、鉭、碲、鋱、鉈、釷、銩、錫、鈦、鎢、釩、鐿、釔、鋅、鋯和/或其它自然產(chǎn)生的微量礦物(即在海水中發(fā)現(xiàn)的自然產(chǎn)生的微量礦物)。

以如下濃度的一種或多種外源提供的固定碳源來提供一種或多種碳源：至少大約50μm、至少大約100μm、至少大約500μm、至少大約5mm、至少大約50mm和至少大約500mm。當(dāng)用作固定碳源時(shí)，以選自大約2.5g/l至大約125g/l濃度范圍的濃度來提供右旋糖。在以右旋糖作為固定碳源的特定具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中右旋糖的濃度選自2.5g/l至100g/l、5g/l至100g/l和10g/l至100g/l。在其它此類具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中右旋糖的濃度可選自2.5g/l至75g/l、5g/l至75g/l和10g/l至75g/l。在進(jìn)一步的此類具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中右旋糖的濃度可選自15g/l至65g/l、20g/l至55g/l和25g/l至50g/l。培養(yǎng)基中包含的右旋糖的量可以隨著時(shí)間而增加，以確保足夠的營養(yǎng)用于所期望的生長或產(chǎn)品特點(diǎn)。例如，當(dāng)向發(fā)酵罐中接種微藻進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基可以包括濃度是2.5g/l至10g/l的右旋糖，隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行，右旋糖濃度會(huì)增加到50g/l至100g/l。

在一些具體實(shí)施方式中，可以確定用于微藻繁殖或在微藻繁殖期間使用的一種或多種碳源的總量或總體積。一種或多種碳源的總量可以是大約1000g/10l發(fā)酵液。在一些具體實(shí)施方式中，一種或多種碳源的總量可以是大約100g/10l發(fā)酵液至大約1000g/10l發(fā)酵液，大約250g/10l發(fā)酵液至大約1000g/10l發(fā)酵液，大約500g/10l發(fā)酵液至大約1000g/10l發(fā)酵液，大約750g/10l發(fā)酵液至大約1000g/10l發(fā)酵液，和大約900g/10l發(fā)酵液至大約1000g/10l發(fā)酵液。

在多種具體實(shí)施方式中，如前所述，總量的一種或多種碳源可以不是一次或在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入到培養(yǎng)基中。例如，總量的一種或多種碳源可以被分為不止一份(aliquot)。然后，一種或多種碳源的每一份在微藻繁殖過程中的不同時(shí)間點(diǎn)被加入到培養(yǎng)基和/或發(fā)酵液中。例如，在時(shí)間點(diǎn)零將一種或多種碳源的第一份加入到接種培養(yǎng)基中，在時(shí)間點(diǎn)零之后大約兩小時(shí)將一種或多種碳源的第二份加入到接種培養(yǎng)基中，在時(shí)間點(diǎn)零之后大約四小時(shí)將一種或多種碳源的第三份加入到接種培養(yǎng)基中，等等。換言之，在繁殖過程中每30分鐘，在繁殖過程中每小時(shí)，在繁殖過程中每兩小時(shí)，在繁殖過程中每三小時(shí)，等等，可將一種或多種碳源的一份加入到接種培養(yǎng)基中。在某些具體實(shí)施方式中，被分成若干份的一種或多種碳源可以在繁殖過程中的不同時(shí)間點(diǎn)加入。例如，在繁殖過程中可以改變一種或多種碳源的每一份加入的時(shí)間間隔。

在某些具體實(shí)施方式中，丙三醇(本文中也稱作“甘油”)可作為固定碳源。它可以被單獨(dú)加入，或者與一種或多種其它固定碳源一起被加入。當(dāng)它包含在培養(yǎng)基中時(shí)，它以大約0.05％至大約15％(v/v)的量包含在培養(yǎng)基中。在特定的具體實(shí)施方式中，包含在培養(yǎng)基中甘油的量選自大約1％至大約10％(v/v)。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，甘油以選自大約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(v/v)的量包含在培養(yǎng)基中。

發(fā)酵罐中培養(yǎng)物的溫度可被監(jiān)控并維持在所需的范圍。通常，溫度可以維持在例如大約15℃至大約40℃之間。在特定的具體實(shí)施方式中，溫度可以維持在選自如下的范圍：大約15℃至大約35℃之間，大約15℃至大約30℃之間，大約15℃至大約25℃之間，大約25℃至大約35℃之間，大約30℃至大約35℃之間，和大約30℃至大約32℃之間。

發(fā)酵罐中微藻培養(yǎng)物的ph值也可以被控制和維持在大約4.0至大約9.5。在特定的具體實(shí)施方式中，ph值可以維持在選擇下述之一的ph值范圍：大約4.5至大約7.5，大約5.0至大約7.0，大約5.5至大約6.5，大約6.0至大約9.5，大約7.0至大約9.5。微藻培養(yǎng)物的ph值可以通過使用含水緩沖體系來維持?？梢允褂眠m合微藻生長的任何緩沖體系，在特定的具體實(shí)施方式中，氨水(nh4oh)和磷酸(h3po4)可包含在培養(yǎng)基中以使培養(yǎng)物維持在所需要的ph。當(dāng)用作緩沖體系時(shí)，氨還可以作為氮源并且磷酸還可以作為磷源。例如，氨以足夠提供每100g藻類生物質(zhì)大約1.0g至大約10gn2的量包含在培養(yǎng)基中。此外，磷酸以足夠提供每100g藻類生物質(zhì)大約1.0g至大約5gp2o5的量包含在培養(yǎng)基中。在特定的具體實(shí)施方式中，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基可保持在包括足夠的氨以提供發(fā)酵液內(nèi)每100g藻類生物質(zhì)大約2g至大約7gn2的n2濃度，并且保持在包括足夠的磷酸以提供發(fā)酵液內(nèi)每100g藻類生物質(zhì)大約1.0g至大約3gp2o5的p2o5濃度。

在發(fā)酵過程中也可以控制發(fā)酵培養(yǎng)物內(nèi)氧的量。特別地，已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微藻在發(fā)酵罐內(nèi)生長和繁殖時(shí)，將氧(o2)輸送至微藻培養(yǎng)物中可以使脂質(zhì)產(chǎn)量增加。在一些具體實(shí)施方式中，氧可以是壓縮的氧氣。例如，氧氣可以是大約75％至大約100％氧，大約80％至大約100％氧，大約90％至大約100％氧，大約90％至大約98％氧，大約95％氧，和大約98％氧。在某些具體實(shí)施方式中，可以從氧氣發(fā)生器或氧呼吸袋中釋放。根據(jù)本發(fā)明的方法中，對(duì)于每10l總體積的發(fā)酵液，氧以大約0.1l/分鐘至大約2.5l/分鐘的速度輸送至培養(yǎng)物中。在特定的具體實(shí)施方式中，每10l總體積的發(fā)酵液，氧以選自如下的速度注入到培養(yǎng)物中：大約0.25l/分鐘至大約4.5l/分鐘，大約0.25l/分鐘至大約2.0l/分鐘，大約0.25l/分鐘至大約1.5l/分鐘，大約0.35l/分鐘至大約1.5l/分鐘?？梢允褂萌魏魏线m的方法將氧輸送至培養(yǎng)物中。例如，可以向發(fā)酵罐提供輸氣管道以將氧引入培養(yǎng)物中，這樣一來，氧會(huì)往上冒泡和/或在發(fā)酵液中擴(kuò)散。此外，可以連續(xù)不斷地將氧輸送至培養(yǎng)物中，或者，可以在發(fā)酵罐內(nèi)微藻培養(yǎng)物繁殖或保持期間在不同點(diǎn)在一個(gè)或多個(gè)選定的時(shí)期被輸入。

微藻培養(yǎng)物可以在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)最短停留時(shí)間，并且，使用本文描述的方法可快速(例如，小于48小時(shí))獲得發(fā)酵液內(nèi)高濃度的微藻。在特定的具體實(shí)施方式中，微藻培養(yǎng)物可以保持在發(fā)酵罐內(nèi)一段時(shí)間，其選自至少24小時(shí)、至少36小時(shí)、至少48小時(shí)和至少60小時(shí)。在某些此類具體實(shí)施方式中，微藻培養(yǎng)物可以保持在發(fā)酵罐內(nèi)一段時(shí)間，其選自至少20小時(shí)、至少30小時(shí)、至少40小時(shí)、至少50小時(shí)和至少60小時(shí)。這樣的最短停留時(shí)間，連同本文詳細(xì)描述的培養(yǎng)條件，可以產(chǎn)生高濃度微藻細(xì)胞。例如，在某些具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可以產(chǎn)生48小時(shí)內(nèi)顯示微藻濃度范圍是70-100g/l藻類，75-95g/l藻類和80-90g/l藻類的微藻培養(yǎng)物。

其它的組分和物質(zhì)可以引入至發(fā)酵罐中使用的培養(yǎng)基，以便保持和/或?qū)崿F(xiàn)所希望的微藻的生長、繁殖和/或脂質(zhì)生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將啤酒花加入培養(yǎng)基中對(duì)于避免培養(yǎng)物中有不需要的微生物生長或者培養(yǎng)物被不需要的微生物污染是有效的，其中不需要的微生物例如是酵母或細(xì)菌，它們會(huì)抑制微藻的生長、健康和繁殖。如果將啤酒花加入到培養(yǎng)基中，每升微藻培養(yǎng)物使用大約5克至500克的啤酒花(5-500g/l)。在特定的具體實(shí)施方式中，每升微藻培養(yǎng)物使用大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475和500克的啤酒花。

在特定的具體實(shí)施方式中，可以調(diào)整發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基和條件以產(chǎn)生適合藻類生物質(zhì)、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)生產(chǎn)的微藻培養(yǎng)物。當(dāng)需要可提供高密度藻類生物質(zhì)和高水平脂質(zhì)生產(chǎn)的微藻培養(yǎng)物時(shí)，在一些具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的ph值維持在大約5.4至7.0，溫度維持在大約18℃至27℃，氧以每10l發(fā)酵液大約1.5l/分鐘的速度輸送至培養(yǎng)物中。

當(dāng)需要可提供高密度藻類生物質(zhì)和高水平蛋白質(zhì)生產(chǎn)的微藻培養(yǎng)物時(shí)，在一些具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的ph值維持在大約6.8至9.2，溫度維持在大約21℃至33℃，氧以每10l發(fā)酵液大約0.35l/分鐘的速度輸送至培養(yǎng)物中。當(dāng)需要可提供提高的藻類生物質(zhì)的微藻培養(yǎng)物時(shí)，在一些具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的ph值維持在大約5.5至6.2，溫度維持在大約21℃至28℃，氧以每10l發(fā)酵液大約1.0l/分鐘的速度輸送至培養(yǎng)物中。在每一此類具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)條件不僅有利于生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物(即，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或生物質(zhì))，而且產(chǎn)生48小時(shí)內(nèi)顯示微藻濃度范圍是70-100g/l藻類，75-95g/l藻類和80-90g/l藻類的微藻培養(yǎng)物。

當(dāng)選擇工藝條件以有利于脂質(zhì)生產(chǎn)時(shí)，這些條件可使脂質(zhì)生產(chǎn)是微藻的一階函數(shù)。脂質(zhì)生產(chǎn)力的三個(gè)不同標(biāo)志(每升的干細(xì)胞重量，每升細(xì)胞外脂質(zhì)的克數(shù)，和干細(xì)胞重量相對(duì)于脂質(zhì)的百分比)可作為本文描述的方法的一部分被考慮和監(jiān)測。根據(jù)本發(fā)明的方法可以提供微藻培養(yǎng)物中每升細(xì)胞外脂質(zhì)的克數(shù)和干細(xì)胞重量相對(duì)于脂質(zhì)的百分比的理想改進(jìn)。在特定的具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可產(chǎn)生這樣的微藻培養(yǎng)物：微藻包括以干細(xì)胞重量計(jì)百分比至少是25％的脂質(zhì)。例如，本文描述的方法可產(chǎn)生這樣的微藻培養(yǎng)物：微藻包括以干細(xì)胞重量計(jì)百分比選自如下的脂質(zhì)：至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％和至少80％。此外，在一些具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法可產(chǎn)生包括至少10％(v/v)脂質(zhì)的發(fā)酵液。例如，本文描述的方法可產(chǎn)生微藻培養(yǎng)物，其分泌高水平的脂質(zhì)，產(chǎn)生發(fā)酵液，該發(fā)酵液包括選自至少10％(v/v)、至少15％(v/v)、至少20％(v/v)和至少25％(v/v)的量的脂質(zhì)。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，本文描述的方法可產(chǎn)生微藻培養(yǎng)物，其中微藻產(chǎn)生高水平的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)(即，以干細(xì)胞重量計(jì)包含在微藻內(nèi)的高水平脂質(zhì))和包含在發(fā)酵液內(nèi)的高水平細(xì)胞外脂質(zhì)。

在一些具體實(shí)施方式中，微藻生物質(zhì)的增加與微藻脂質(zhì)產(chǎn)量的增加相對(duì)應(yīng)。例如，隨時(shí)微藻培養(yǎng)物的生物質(zhì)增加，微藻培養(yǎng)物中微藻產(chǎn)生的脂質(zhì)的量也增加。在某些具體實(shí)施方式中，微藻培養(yǎng)物的生物質(zhì)以與微藻產(chǎn)生的脂質(zhì)增加速率大約相同的速率增加。在某些其它具體實(shí)施方式中，微藻培養(yǎng)物的生物質(zhì)以比微藻產(chǎn)生脂質(zhì)的速率更大的速率增加。在某些其它具體實(shí)施方式中，微藻培養(yǎng)物的生物質(zhì)以比微藻產(chǎn)生脂質(zhì)的速率更小的速率增加。

圖1-6是描繪普通小球藻(chlorellavulgaris)樣品的顯微照片，其中，在30l發(fā)酵液中在異養(yǎng)生長條件下并引入氧來培養(yǎng)普通小球藻樣品。發(fā)酵液的含量在下面的實(shí)施例1中進(jìn)行描述。圖1是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)之前或培養(yǎng)開始時(shí)微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第1天0900小時(shí)獲得，400x放大。如圖1所描繪，藻類細(xì)胞是可見的，包括與自養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)的微藻細(xì)胞所產(chǎn)生的脂質(zhì)水平差不多的脂質(zhì)水平。進(jìn)一步，周圍的發(fā)酵液基本是清澈的并且基本是無脂質(zhì)的。

圖2是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第1天2000小時(shí)獲得，1000x放大。圖2描繪了一簇細(xì)胞，其中單個(gè)細(xì)胞平均來說比圖1的單個(gè)細(xì)胞更大。由圖2還可看出，至少一些微藻細(xì)胞在尺寸上是異常的(即比正常的大)。進(jìn)一步，圖2中脂質(zhì)是可見的，其是分布在微藻細(xì)胞周圍基本清楚的點(diǎn)。

圖3是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第2天0800小時(shí)獲得，1000x放大。與圖1和2的微藻細(xì)胞相比，圖3描繪了分布在微藻細(xì)胞簇周圍的脂質(zhì)數(shù)量的增加。新的微藻細(xì)胞是可見的，這些細(xì)胞小而飽滿。

圖4是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第2天1000小時(shí)獲得，1000x放大。圖4顯示細(xì)胞間隙基本充滿了脂質(zhì)。此外，這些細(xì)胞比自養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)的微藻細(xì)胞更大，并且這些細(xì)胞也可包括大量的脂質(zhì)，其中至少一些細(xì)胞主要是由脂質(zhì)組成。

圖5是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第2天1200小時(shí)獲得，1000x放大。圖5中的微藻細(xì)胞也比自養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)的細(xì)胞更大，并且也包括大量的脂質(zhì)。另外，至少一些細(xì)胞主要是由脂質(zhì)組成。至少部分地由于存在脂質(zhì)，聚集或成簇的微藻細(xì)胞是可見的。

圖6是描繪根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式在異養(yǎng)生長條件并引入氧培養(yǎng)的微藻樣品的顯微照片。顯微照片是在第3天0800小時(shí)獲得，400x放大。在該時(shí)間點(diǎn)，可以確定至少有一些微藻細(xì)胞已經(jīng)停止生長。大約在該時(shí)間點(diǎn)，微藻細(xì)胞的生長已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定時(shí)期。

參考圖1-6，當(dāng)焦點(diǎn)通過微藻細(xì)胞膜時(shí)，包括脂質(zhì)的大體“發(fā)光的”中心是可見的。如果變換焦點(diǎn)，相同的細(xì)胞會(huì)因?yàn)榻裹c(diǎn)對(duì)著細(xì)胞壁而變暗。在整個(gè)時(shí)間進(jìn)程中，如圖1-6所描繪，隨著微藻培養(yǎng)的進(jìn)行，“發(fā)光的”中心的尺寸通常會(huì)增大。

在一些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中脂質(zhì)產(chǎn)生的方法可包括將微藻接種至培養(yǎng)基和在異養(yǎng)生長條件下繁殖微藻。異養(yǎng)生長條件可包括抑制、限制或減少接種的培養(yǎng)基暴露于光。在一些具體實(shí)施方式中，接種的培養(yǎng)基基本上處于暗環(huán)境中。例如，接種的培養(yǎng)基可以盛裝在不透明或基本不透明的殼體內(nèi)。在各種具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中脂質(zhì)產(chǎn)生的方法可進(jìn)一步包括將氧輸送或引入至接種的培養(yǎng)基中，以便使微藻以比標(biāo)準(zhǔn)生長條件或自養(yǎng)生長條件下生產(chǎn)速度更大的速度來產(chǎn)生脂質(zhì)。在某些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中脂質(zhì)產(chǎn)生的方法可進(jìn)一步包括在異養(yǎng)生長條件下繁殖微藻之前先在自養(yǎng)生長條件下培養(yǎng)微藻。

在各種具體實(shí)施方式中，對(duì)于每10l接種的培養(yǎng)基，按照大約0.1l/分鐘至2.5l/分鐘的速度將氧輸送或引入至接種的培養(yǎng)基中。上文中討論了輸送氧的其它合適的速度。此外，可以通過輸氣管線將氧輸送至接種的培養(yǎng)基，以便氧在接種的培養(yǎng)基中擴(kuò)散。在一些具體實(shí)施方式中，可以將氧基本上連續(xù)不斷地輸送至接種的培養(yǎng)基，而在另一些具體實(shí)施方式中，可以在微藻繁殖期間的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間段將氧輸送至接種的培養(yǎng)基。

在某些具體實(shí)施方式中，本文公開的方法可進(jìn)一步包括監(jiān)控接種的培養(yǎng)基的溫度和將接種的培養(yǎng)基的溫度保持在合適的溫度范圍內(nèi)(即大約15℃至大約40℃)。在各種具體實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括監(jiān)控接種的培養(yǎng)基的ph值和將接種的培養(yǎng)基的ph值保持在合適的ph值范圍內(nèi)(即大約4.0至大約9.5)。可以采用含水緩沖體系或者其它合適的機(jī)制或體系來保持ph值。另外，如上所述，其它合適的溫度和/或ph值范圍也在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。當(dāng)加入微藻接種物時(shí)(即，在時(shí)間零)，可以收集培養(yǎng)物并對(duì)其進(jìn)行處理以便確定各種條件(即，ph、溫度等)的起始數(shù)據(jù)點(diǎn)。在某些具體實(shí)施方式中，接種的培養(yǎng)基可以盛裝在黑暗期發(fā)酵罐(darkphasefermentor)中，其放置在黑暗或基本黑暗空間中。在某些具體實(shí)施方式中，可對(duì)黑暗期發(fā)酵罐進(jìn)行配置，以便發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基不暴露于光。在各種具體實(shí)施方式中，可對(duì)黑暗期發(fā)酵罐進(jìn)行配置，以便發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基只暴露于有限水平或較弱水平的光。放置黑暗期發(fā)酵罐的空間的溫度可調(diào)整至有助于黑暗期發(fā)酵罐保持所需要的溫度。如上所述，其它的機(jī)制也可用于將培養(yǎng)物調(diào)整或保持在所需的溫度。

在各種具體實(shí)施方式中，微藻可選自如下種類的至少一種：纖維藻屬(ankistrodesmus)，葡萄藻屬(botryococcus)，小球藻屬(chlorella)，隱甲藻屬(crypthecodinium)，小環(huán)藻屬(cyclotella)，杜氏藻屬(dunaliella)，菱板藻屬(hantzschia)，微球藻屬(nannochloris)，微擬球藻(nannochloropsis)，新綠藻屬(neochloris)，菱形藻屬(nitzschia)，褐指藻屬(phaeodactylum)，微球藻屬(nannochloris)，裂絲藻屬(stichococcus)，扁藻屬(tetraselmis)，海鏈藻屬(thalassiosira)，和/或，裂殖壺菌屬(schizochytrium)。在某些具體實(shí)施方式中，微藻可選自如下的至少一種：小球藻(chlorellafusca)，原始小球藻(chlorellaprotothecoides)，蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)，凱氏小球藻(chlorellakessleri)，普通小球藻(chlorellavulgaris)，啤酒小球藻(chlorellasaccharophila)，沙堆小球藻(chlorellasorokiniana)，和/或，橢圓小球藻(chlorellaellipsoidea)。

在一些具體實(shí)施方式中，可以在發(fā)酵罐內(nèi)處理培養(yǎng)基。如上所述，培養(yǎng)基可包括一種或多種碳源、脂肪源、氮源、磷源、和/或一種或多種輔酶或輔酶因子。碳源可選自如下的至少一種：右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、n-乙酰葡糖胺、甘油、弗羅里多苷(floridoside)、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纖維素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和/或糖蜜。

在一些具體實(shí)施方式中，脂肪源可選自脂肪和/或植物油的至少一種。同樣地，氮源可選自如下的至少一種：蛋白質(zhì)、大豆粉、玉米漿、氨、硝酸酯、硝酸鹽、分子氮和/或酵母提取物。如上所述，其它合適的脂肪源和氮源也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在各種具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法也可包括向培養(yǎng)基中接種微藻和在異養(yǎng)生長條件下繁殖微藻。如上所述，異養(yǎng)生長條件可包括抑制、限制或減少接種的培養(yǎng)基暴露于光。在各種具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法可進(jìn)一步包括將氧輸送至接種的培養(yǎng)基中，以便使微藻以比標(biāo)準(zhǔn)生長條件或自養(yǎng)生長條件下微藻生產(chǎn)速度更大的速度來產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

在某些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)微藻中蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法可進(jìn)一步包括將接種的培養(yǎng)基的ph值維持在6.8至9.2之間。該方法還包括將接種的培養(yǎng)基的溫度保持在大約21℃至大約33℃。在某些具體實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括每10l接種的培養(yǎng)基以大約0.5l/分鐘至大約4.0l/分鐘的速度將氧輸送至接種的培養(yǎng)基。

在一些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)產(chǎn)生增加的微藻生物質(zhì)的方法可包括將微藻接種至培養(yǎng)基和在異養(yǎng)生長條件下繁殖微藻。另外，如上所述，異養(yǎng)生長條件可包括抑制、限制或減少接種的培養(yǎng)基暴露于光。在某些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)產(chǎn)生增加的微藻生物質(zhì)的方法可進(jìn)一步包括將氧輸送至接種的培養(yǎng)基中，以便使微藻生物質(zhì)以比標(biāo)準(zhǔn)生長條件或自養(yǎng)生長條件下的速度更大的速度來增加。

在某些具體實(shí)施方式中，誘導(dǎo)產(chǎn)生增加的微藻生物質(zhì)的方法可進(jìn)一步包括將接種的培養(yǎng)基的ph值維持在大約5.5至大約6.2。該方法還可包括將接種的培養(yǎng)基的溫度維持在大約21℃至大約28℃。在各種具體實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括每10l接種的培養(yǎng)基以大約0.5l/分鐘至大約4.0l/分鐘的速度將氧輸送至接種的培養(yǎng)基。

在某些具體實(shí)施方式中，從采用本文公開的一種或多種方法培養(yǎng)的微藻中可以獲得、提取、分離和/或純化到一種或多種脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)。

在各種具體實(shí)施方式中，引入至黑暗期發(fā)酵罐的微藻接種物可以是綠藻(例如，微藻可具有綠色或者基本上是綠色)。在一些具體實(shí)施方式中，綠藻處于其執(zhí)行光合作用的狀態(tài)。當(dāng)在上述條件或方法下培養(yǎng)時(shí)，綠藻可以轉(zhuǎn)變成白皙藻(blondealgae)。例如，白皙藻可具有大體上的白色。

在某些具體實(shí)施方式中，白皙藻可轉(zhuǎn)變成或回變?yōu)榫G藻。白皙藻存活不會(huì)超過56小時(shí)，并且可能會(huì)在56小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)變成或回變?yōu)榫G藻。大約56小時(shí)之后，如果不恢復(fù)到自養(yǎng)生長條件下繁殖，那么白皙藻可能會(huì)死。在一些具體實(shí)施方式中，白皙藻向綠藻的轉(zhuǎn)變或回變可包括收集白皙藻樣品和將白皙藻樣品引入或回送至光生物反應(yīng)器。例如，白皙藻樣品可接觸或被供給營養(yǎng)，營養(yǎng)包括但不限于二氧化碳、磷酸氫二銨和/或日光(或其它合適的光源)。白皙藻向綠藻的轉(zhuǎn)變或回變可在大約兩周內(nèi)發(fā)生。在一些具體實(shí)施方式中，白皙藻向綠藻的轉(zhuǎn)變可在如下時(shí)間段發(fā)生：大約一周至大約四周內(nèi)，大約1.5周至大約3.5周內(nèi)，大約1.5周至大約3周內(nèi)，或大約2周至大約2.5周內(nèi)。在各種具體實(shí)施方式中，二氧化碳的引入和/或曝氣(aeration)可引發(fā)或重啟白皙藻樣品或培養(yǎng)物中的光合作用過程。在某些具體實(shí)施方式中，綠藻可在將氧引入至培養(yǎng)基中大約兩個(gè)小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榘尊?，如上所述。在某些其它的具體實(shí)施方式中，在將氧引入至培養(yǎng)基中大約兩個(gè)小時(shí)至大約4小時(shí)內(nèi)或者在將氧引入至培養(yǎng)基中大約兩個(gè)小時(shí)至大約6小時(shí)內(nèi)，綠藻可轉(zhuǎn)變?yōu)榘尊濉?/p>

在一些具體實(shí)施方式中，將綠藻轉(zhuǎn)變?yōu)榘尊宓倪^程可對(duì)藻類加壓。將綠藻轉(zhuǎn)變?yōu)榘尊宓倪^程可使藻類的生長被抑制、停止，或者減弱光合作用的機(jī)制或過程。在某些具體實(shí)施方式中，不產(chǎn)生或生成糖和/或氧，藻類細(xì)胞會(huì)接觸或過度接觸它們的天然副產(chǎn)物，并且一些藻類細(xì)胞會(huì)死亡而另一些藻類細(xì)胞存活。在一些具體實(shí)施方式中，至少一部分存活的藻類細(xì)胞會(huì)放棄自然過程(即光合作用)并利用碳和/或氧來產(chǎn)生或生成脂質(zhì)。這一過程可被稱為“超產(chǎn)”(hyperproduction)。例如，白皙藻可進(jìn)入超產(chǎn)的條件或狀態(tài)。在一些具體實(shí)施方式中，當(dāng)白皙藻開始或進(jìn)入超產(chǎn)時(shí)，白皙藻可高速率(高于野生型的速率)產(chǎn)生一種或多種類型的脂質(zhì)。在發(fā)酵期間，白皙藻可受壓以便白皙藻產(chǎn)生相較于未受壓的藻類水平得到提高的脂質(zhì)。在某些具體實(shí)施方式中，脂質(zhì)的超產(chǎn)最終會(huì)達(dá)到穩(wěn)定期或基本停止。例如，白皙藻過度受壓或者一大部分白皙藻細(xì)胞被加壓并且白皙藻細(xì)胞不能繼續(xù)存活。

在一些具體實(shí)施方式中，白皙藻的生長速度或者異養(yǎng)生長條件下并引入了氧所培養(yǎng)的微藻的生長速度可迅速加快(即溶液中藻類細(xì)胞的數(shù)量會(huì)成倍增加)。在同一時(shí)間或者基本在同一時(shí)間，白皙藻細(xì)胞或者異養(yǎng)生長條件下并引入了氧所培養(yǎng)的微藻細(xì)胞以增加的速度產(chǎn)生脂質(zhì)。例如，白皙藻中或者異養(yǎng)生長條件下并引入了氧所培養(yǎng)的微藻中脂質(zhì)產(chǎn)生的速度大于綠藻中或自養(yǎng)生長條件培養(yǎng)的微藻中脂質(zhì)產(chǎn)生的速度。當(dāng)白皙藻產(chǎn)生脂質(zhì)時(shí)，脂質(zhì)可以從白皙藻細(xì)胞釋放或排放至周圍的溶液。類似地，當(dāng)異養(yǎng)生長條件并引入氧所培養(yǎng)的微藻產(chǎn)生脂質(zhì)時(shí)，脂質(zhì)可以從微藻細(xì)胞釋放或排放至周圍的溶液。脂質(zhì)的增產(chǎn)一直繼續(xù)，直到白皙藻轉(zhuǎn)化過程停止或者停止在異養(yǎng)生長條件并引入氧來培養(yǎng)微藻。在某些具體實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的總體積是大于10％至大約20％脂質(zhì)，并且培養(yǎng)基中的白皙藻細(xì)胞或者異養(yǎng)生長條件并引入氧所培養(yǎng)的微藻細(xì)胞可包括大約60％至大約80％脂質(zhì)含量。相反，自養(yǎng)生長條件下繁殖的小球藻屬通常包括大約5％至大約14％脂質(zhì)含量并且通常不排放大量的脂質(zhì)。白皙藻中或者異養(yǎng)生長條件并引入氧所培養(yǎng)的微藻中脂質(zhì)的這種增產(chǎn)可在大約48小時(shí)內(nèi)發(fā)生。

回收微藻產(chǎn)生的脂質(zhì)

培養(yǎng)過程完成之后，微藻可從發(fā)酵液中分離，并且可收獲微藻產(chǎn)生的生物質(zhì)和/或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。采用任何合適的方法可以收獲或者收集根據(jù)本文描述的方法由微藻產(chǎn)生的脂質(zhì)(例如，碳?xì)浠衔?、脂肪酸、醛、醇和?。一旦收集了，脂質(zhì)和/或碳?xì)浠衔锟杀贿M(jìn)一步精制以生產(chǎn)例如油、燃料或油脂化學(xué)品。

當(dāng)收集存在于發(fā)酵液中的細(xì)胞外脂質(zhì)時(shí)，可以通過過濾將發(fā)酵液與微藻及其它有機(jī)物質(zhì)分離，然后對(duì)含有脂質(zhì)的過濾的發(fā)酵液進(jìn)行離心。離心分離了疏水層中的脂質(zhì)，疏水層不同于含水層，親水污染物在其中易于分開，如果過濾之后固體微粒仍存在于發(fā)酵液中，那么離心也可將這類物質(zhì)以沉淀物的形式與脂質(zhì)物質(zhì)分離。另外，可使用蛋白酶處理含有細(xì)胞或細(xì)胞碎片的物質(zhì)以便在離心之前或之后降解污染蛋白質(zhì)。在某些情況下，污染蛋白質(zhì)可共價(jià)地與碳?xì)浠衔锘蛱細(xì)浠衔锴绑w連接，其中碳?xì)浠衔锴绑w在去除蛋白質(zhì)之后可形成碳?xì)浠衔?。在其它情況下，碳?xì)浠衔锓肿涌纱嬖谟谝埠械鞍踪|(zhì)的制劑中?？蓪⒌鞍酌讣尤氲教?xì)浠衔镏苿┲幸越到獾鞍踪|(zhì)(例如，可使用來自灰色鏈霉菌的蛋白酶(西格瑪-奧德里奇，產(chǎn)品目錄號(hào)p5147))。分解之后，純化碳?xì)浠衔?，去除剩余蛋白質(zhì)、肽片段和氨基酸。可以采用離心和過濾來完成該純化。

因?yàn)楸疚拿枋龅姆椒〞?huì)產(chǎn)生高濃度的細(xì)胞外脂質(zhì)，所以在一些具體實(shí)施方式中，可以采用如下方法來回收脂質(zhì)：細(xì)胞外脂質(zhì)可以在體內(nèi)與活微藻細(xì)胞分離，然后微藻細(xì)胞返回生物反應(yīng)器繼續(xù)用于根據(jù)本文描述的方法(例如，用作制備加入到發(fā)酵罐的微藻培養(yǎng)物的起點(diǎn))。在特定的具體實(shí)施方式中，將微藻與生長培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞外脂質(zhì)分離可以采用如下方法來實(shí)現(xiàn)：在其它無菌環(huán)境中，使細(xì)胞接觸無毒提取溶劑，隨后將活細(xì)胞與提取溶劑的疏水部分及脂質(zhì)分離，其中分離的活細(xì)胞隨后返回培養(yǎng)容器，例如發(fā)酵罐或光生物反應(yīng)器(參見biotechnolbioeng.2004dec.5；88(5):593-600andbiotechnolbioeng.2004mar.5；85(5):475-81)。

根據(jù)本文描述的方法生產(chǎn)的脂質(zhì)也可采用全細(xì)胞提取而分離。首先破碎細(xì)胞，可以采用上面描述的離心來從整個(gè)細(xì)胞物質(zhì)(cellmass)中收集細(xì)胞內(nèi)碳?xì)浠衔?、?xì)胞膜/細(xì)胞壁相連的碳?xì)浠衔镆约凹?xì)胞外碳?xì)浠衔铩Ａ呀?lysing)微生物的步驟可以采用任何合適方法來實(shí)現(xiàn)，包括熱誘導(dǎo)裂解，加入堿，加入酸，使用例如蛋白酶的酶和例如淀粉酶的多糖降解酶，使用超聲波，機(jī)械裂解，使用滲壓震擾，用裂解病毒感染，和/或，表達(dá)一種或多種裂解基因?？梢赃M(jìn)行裂解以釋放微生物產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)分子。裂解微生物的這些方法可以單獨(dú)使用，或者同時(shí)或依次相結(jié)合使用。在一些具體實(shí)施方式中，在培養(yǎng)結(jié)束之后，通過離心將微藻與發(fā)酵液分離以產(chǎn)生濃縮的糊狀物。離心可能不會(huì)從微生物中去除大量的細(xì)胞內(nèi)水并且不是干燥步驟。然后，使用洗滌液(例如，d1水)洗滌生物質(zhì)以去掉發(fā)酵液的生物質(zhì)和碎片?？蛇x地，在細(xì)胞破碎前干燥(烘干、凍干等)洗滌的微藻生物質(zhì)?；蛘?，發(fā)酵完成時(shí)，細(xì)胞不與一些或全部發(fā)酵液分離而直接裂解。例如，當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，細(xì)胞的比例是細(xì)胞:細(xì)胞外流體的比例小于1:1(v:v)。

多種方法可用于將碳?xì)浠衔锖椭|(zhì)與細(xì)胞裂解物分離。例如，可以使用疏水溶劑，例如己烷，來提取脂質(zhì)(參見frenzetal.1989,enzymemicrob.technol.,11:717)。典型地，有機(jī)溶劑無需先分離裂解組分，可直接被加入到裂解物中。在一種具體實(shí)施方式，上述的一種或多種方法所產(chǎn)生的裂解物可與有機(jī)溶劑接觸一段時(shí)間，該時(shí)間足以使脂質(zhì)和/或碳?xì)浠衔锝M分與有機(jī)溶劑形成溶液。一些情況下，溶液可被進(jìn)一步精制以回收具體需要的脂質(zhì)或碳?xì)浠衔锝M分。溶劑提取方法，例如使用己烷作為溶劑，是本領(lǐng)域公知的。也可以使用如下方法來提取脂質(zhì)：液化(參見，例如，sawayama,etal.1999,biomassandbioenergy17:33-39和inoue,etal.1993,biomassbioenergy6(4):269-274)；油液化(參見，例如，minowa,etal.1995,fuel74(12):1735-1738)；和超臨界co2萃取(參見，例如，mendes,etal.2003,lnorganicachimicaacta356:328-334)。

實(shí)施例

通過以下實(shí)施例對(duì)上述公開的方法和成分進(jìn)行說明。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，這些實(shí)施例的變型和本發(fā)明公開的方法及成分的其它實(shí)施例可通過有限實(shí)驗(yàn)而得到。

實(shí)施例1

根據(jù)本文公開的方法制備微藻的各種培養(yǎng)物。在每一種培養(yǎng)物中，將5-50ml的微藻接種物懸浮在培養(yǎng)基體積是10l至30l的發(fā)酵罐中。使用自養(yǎng)培養(yǎng)的微擬球藻與卜列東小球藻(chlorellaplethocoides)的濃縮漿體制備微藻接種物，其中微藻固體含量為2g/l至4g/l。對(duì)于體積為30l的培養(yǎng)基，其包括：

在每個(gè)情況中，將培養(yǎng)基和微藻培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中混合，并在溫度為18-35℃、ph為3.5-9.5的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。在繁殖期間(20-30小時(shí))，以每10l培養(yǎng)的微藻大約0.1-1.0l/分鐘的速率將氧氣鼓泡通入微藻培養(yǎng)物中。所得微藻生物質(zhì)的范圍為大約45g/l至大約85g/l，其中脂質(zhì)占微藻干細(xì)胞的重量多達(dá)40％-70％，并且至少占發(fā)酵液的13％-21％(v/v)。

實(shí)施例2

準(zhǔn)備十組(10)小球藻繁殖物，以優(yōu)化微藻生物質(zhì)的生產(chǎn)。表1描述了在不同時(shí)間點(diǎn)(例如：0h、4h、6h等)這10組繁殖物的接種培養(yǎng)基的平均體積(以升計(jì)量)。還示出了在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)引入到接種培養(yǎng)基中的平均糖量(以克計(jì))。糖作為微藻的營養(yǎng)源而被引入。還示出了在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)引入到接種培養(yǎng)基中的氨量(以ml計(jì)，在溶液中稀釋至100g/l)。引入氨以調(diào)節(jié)接種培養(yǎng)基的ph。

繼續(xù)參考表1，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的起始ph被描述，隨后是終止ph(即，用氨調(diào)節(jié)ph之后)。“ctmm”列表示樣品離心后15ml離心管內(nèi)的微藻物質(zhì)或生物質(zhì)的高度。每個(gè)樣品的體積約15ml，并以約5000rpm的速度離心或旋轉(zhuǎn)約10分鐘。特定時(shí)間點(diǎn)的華氏溫度(°f)也被表明。最后一列(ctmla75)表示，在離心管底部收集的微藻物質(zhì)由高度向體積的換算。a75指離心分離后，微藻物質(zhì)作為離心管底部藻類的收集物，其是約75％的藻類(即a75)和25％的水分?？俛75ml＝以ml計(jì)量的總發(fā)酵罐體積。

圖7是描述如表1所示的以ml值計(jì)的總a75的曲線圖。如圖所示，顯示了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)以ml(毫升)表示的微藻生物質(zhì)。該圖顯示了a75的總體積。每個(gè)樣品首先在不加入氧氣的異養(yǎng)生長條件下繁殖大約10小時(shí)。大約10小時(shí)后，將氧引入微藻的每組繁殖物中，并在整個(gè)剩余的繁殖過程中引入氧。因此，表1中的0小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，是在以上所述的不引入氧的10小時(shí)培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)測量的。如圖7所示，在大約28小時(shí)時(shí)間點(diǎn)至大約30小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，微藻生物質(zhì)的增加減慢和/或趨于穩(wěn)定。

表1:小球藻繁殖物平均-生物質(zhì)

*稀釋溶液得到100g/l

13.5mm＝0.5ml

0.037037a75/ctmm

實(shí)施例3

準(zhǔn)備十組(10)小球藻繁殖物，以優(yōu)化蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。表2描述了這10組繁殖物的接種培養(yǎng)基在不同時(shí)間點(diǎn)(例如0小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)等)以升計(jì)量的體積。還示出了在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)引入到接種培養(yǎng)基中的平均糖量(以克計(jì))。如上所述，糖作為微藻的營養(yǎng)源而被引入。還示出了在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)引入到接種培養(yǎng)基的氨量(以ml計(jì)，在溶液中稀釋得到100g/l)。與上述相同，引入氨以調(diào)節(jié)接種培養(yǎng)基的ph。

繼續(xù)參考表2，描述了終止ph(即，使用氨調(diào)節(jié)ph之后)?！癱tmm”列表示樣品離心后15ml離心管內(nèi)的微藻物質(zhì)的高度。每個(gè)樣品的體積大約為15ml，并以大約5000rpm的速度離心或旋轉(zhuǎn)大約10分鐘。特定時(shí)間點(diǎn)以華氏溫度計(jì)量的最高溫度也被表明。最后一列表示在離心管的底部收集的微藻物質(zhì)由高度向體積的換算，如實(shí)施例2所描述。

表2:小球藻繁殖物平均-蛋白質(zhì)

*稀釋溶液得到100g/l

13.5mm＝0.5ml

0.037037a75/ctmm

圖8為描述如表2所示的以ml值計(jì)的總a75的曲線圖。如圖所示，顯示了在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)以ml(毫升)表示的微藻生物質(zhì)。此圖顯示了a75的總體積。每個(gè)樣品首先在異養(yǎng)生長條件、不引人氧的情況下繁殖大約10小時(shí)。大約10小時(shí)后，將氧氣引入每組微藻繁殖物中，并在整個(gè)剩余的繁殖過程中引入氧。因此，表1中的0小時(shí)時(shí)間點(diǎn)是從如上所述不引入氧的10小時(shí)培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)測量的。因此，0小時(shí)時(shí)間點(diǎn)是在異養(yǎng)生長條件開始約10小時(shí)后。如圖8所示，在約28小時(shí)時(shí)間點(diǎn)至約30小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，微藻生物質(zhì)的增加減慢和/或趨于平穩(wěn)。

如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，本發(fā)明公開的每個(gè)具體實(shí)施方式可以包括其具體陳述的元素，步驟，成分或組分，其中每個(gè)方案基本上由其組成或由其組成。如本文所用，過渡術(shù)語“包括”指包括但不限于并且允許甚至大量包含未指定的元素，步驟，成分或組分。過渡短語“由...組成”排除任何未指定的元素，步驟，成分或組分。過渡短語“基本上由...組成”將具體實(shí)施方式的范圍限制為指定的元素，步驟，成分或組分，和那些對(duì)具體實(shí)施方式?jīng)]有實(shí)質(zhì)影響的部分。

除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)的表示成分的量、性質(zhì)(如分子量)、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字，在所有情況下應(yīng)理解為由術(shù)語“大約”修飾。因此，除非特別指出，否則說明書和所附權(quán)利要求中所述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其值可以根據(jù)本發(fā)明尋求獲得的期望性質(zhì)而變化。至少，為了不限制權(quán)利要求的范圍，每個(gè)數(shù)值參數(shù)應(yīng)當(dāng)至少被理解為根據(jù)普通舍入法則對(duì)發(fā)明中的有效數(shù)字進(jìn)行計(jì)算而得到的。當(dāng)需要進(jìn)一步明確時(shí)，在結(jié)合使用規(guī)定的數(shù)值和范圍時(shí)，術(shù)語“大約”對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員具有合理的數(shù)值均歸屬于它的含義，即，表示稍微多于或略小于所述值或范圍，在所述值的±20％范圍內(nèi)；所述值的±19％范圍內(nèi)；所述值的±18％范圍內(nèi)；所述值的±17％范圍內(nèi)；所述值的±16％范圍內(nèi)；所述值的±15％范圍內(nèi)；所述值的±14％范圍內(nèi)；所述值的±13％范圍內(nèi)；所述值的±12％范圍內(nèi)；所述值的±11％范圍內(nèi)；所述值的±10％范圍內(nèi)；所述值的±9％范圍內(nèi)；所述值的±8％范圍內(nèi)；所述值的±7％范圍內(nèi)；所述值的±6％范圍內(nèi)；所述值的±5％范圍內(nèi)；所述值的±4％范圍內(nèi)；所述值的±3％范圍內(nèi)；所述值的±2％范圍內(nèi)；或所述值的±1％范圍內(nèi)。

盡管闡述本發(fā)明寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實(shí)施例中闡述的數(shù)值會(huì)盡可能地精確報(bào)道。然而，任何數(shù)值固有地必然包含由在它們各自的測試測量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差導(dǎo)致的某些誤差。

除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾外，在本發(fā)明的上下文中(特別是在所附權(quán)利要求的上下文中)使用的術(shù)語“一”(a)、“一個(gè)”(an)、“該”(the)和類似的術(shù)語都應(yīng)被解釋為單數(shù)和復(fù)數(shù)。本文中引用的數(shù)值范圍僅僅用作每個(gè)落在該范圍內(nèi)的數(shù)值的簡寫方法。除非本文另有說明，否則每個(gè)單獨(dú)的值被并入本說明書中，如同其在本文中被單獨(dú)引用一樣。除非本文另有說明或上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行。本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用僅旨在更好地闡明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的所要求保護(hù)的范圍構(gòu)成限制。說明書中的語言不應(yīng)被解釋為對(duì)實(shí)踐本發(fā)明有必要的但未要求保護(hù)的元素。

本發(fā)明替代元素的分組或?qū)嵤├姆纸M不應(yīng)被解釋為限制。每個(gè)群組成員可以單獨(dú)地被引用和要求保護(hù)，也可以與本文中其它的群組成員或其它元素結(jié)合起來被引用和要求保護(hù)?？梢灶A(yù)期的是，為了方便和/或?qū)＠?，群組中的一個(gè)或多個(gè)成員可以包括在組中或者被刪除。當(dāng)任何這樣的包括或刪除發(fā)生時(shí)，說明書被認(rèn)為包括該修飾后的群組，從而能夠滿足所附權(quán)利要求中使用的所有馬庫什群組(markushgroups)的書面描述。

本文中描述了本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式，包括發(fā)明人已知的用于實(shí)施本發(fā)明的最佳方式。當(dāng)然，在閱讀上述描述后，這些所描述的實(shí)施例的變型對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見。申請人預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠視情況采用這樣的變型，并且申請人打算以不同于本文具體描述的方式實(shí)施本文公開的各種具體實(shí)施方式。因此，本發(fā)明包括附在權(quán)利要求書中所述主題的并且法律所允許的所有修改和等同物。此外，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本發(fā)明包括上述元素在其所有可能變型中的任何組合。

此外，整個(gè)說明書已經(jīng)對(duì)許多專利和印刷出版物進(jìn)行了參考。以上引用的每一個(gè)參考文獻(xiàn)和印刷出版物都通過整體引用并入本文。

最后，應(yīng)當(dāng)理解的是，本文公開的具體實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明原理的說明。其它可以采用的變型也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，作為示例而非限制，可以根據(jù)本文的教導(dǎo)利用本發(fā)明的替代配置。因此，本發(fā)明不限于被精確地示出和描述的內(nèi)容。

本文所示的細(xì)節(jié)僅是示例性的，并且僅對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式進(jìn)行了說明性討論，并且被認(rèn)為是理解本發(fā)明的原理和各種實(shí)施例概念方面最有用的描述。

在本發(fā)明中使用的定義和解釋旨在控制未來的任何解釋，除非在以下實(shí)施例中清楚明確地修改，或者當(dāng)應(yīng)用該含義呈現(xiàn)任何無意義或基本上無意義的解釋時(shí)，該術(shù)語將使其無意義或基本上無意義，該定義應(yīng)取自webster'sdictionary，第3版或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的字典，例如oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology(ed.anthonysmith，oxforduniversitypress，oxford，2004)。

在不脫離本發(fā)明基本原理的情況下，對(duì)上述實(shí)施例的細(xì)節(jié)進(jìn)行多處改變，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅由所附權(quán)利要求書來確定。