活化的糖鏈衍生物的制備方法和活化的糖鏈衍生物的制作方法
【專利摘要】[問題]制備具有活化基團的糖鏈化合物時，在作為現有技術的碳酸銨法中，在向糖鏈的還原末端導入氨基的過程中，位于糖鏈還原末端的單元糖開環(huán)，出現了產生α端基異構體和β端基異構體的混合物的問題。[解決方案]本發(fā)明提供糖鏈化合物的制備方法包括：以具有糖鏈天冬酰胺結構的化合物為原料，從糖鏈肽中切斷糖鏈，使保持來自天冬酰胺側鏈的氮原子與糖鏈的還原末端結合的狀態(tài)，不僅保持了上述糖鏈的還原末端與上述氮原子之間的共價鍵、還保持了β立體構型不變，向上述氮原子上導入活化基團，制備β選擇性高、且具有活化基團的糖鏈化合物。另外，作為本發(fā)明的化合物，提供作為β端基異構體的新的具有活化基團的糖鏈化合物。
【專利說明】活化的糖鏈衍生物的制備方法和活化的糖鏈衍生物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及活化的糖鏈衍生物的制備方法和活化的糖鏈衍生物化合物。

【背景技術】
[0002] 糖鏈通常是指單糖與單糖通過糖苷鍵這種鍵結合成鏈狀的物質。在生物體內，已 知各種糖鏈發(fā)揮著重要的作用。在生物體內，糖鏈往往是作為與肽、蛋白質、脂質等結合的 復合糖質而存在。
[0003] 特別是，在存在于生物體內的糖肽或糖蛋白中，已知具有特定結構的糖鏈與肽的 特定氨基酸結合。已知這些糖鏈根據其結構的不同而對肽（蛋白質）的活性或活體內動力 學等產生各種影響。
[0004] 已知還有人將這種糖鏈或添加有糖鏈的肽用作藥品，但通過細胞系來制備添加有 糖鏈的肽時，糖鏈的結構不均一。若糖鏈的結構不均一，則在藥效上也會產生偏差，因此迫 切需要在肽上添加分離純化或化學合成的結構均一的糖鏈。但是，為了使分離純化或化學 合成的糖鏈與肽等其他物質結合，根據需要，需要在糖鏈上添加結合所需的官能團。
[0005] 作為在糖鏈上添加與其他物質結合所需的官能團（在本發(fā)明中，還稱作活化基 團）的方法，可以進行如下的方法：從天然的蛋黃等中分離純化在糖鏈的還原末端具有-OH 基的糖鏈，利用碳酸銨法向糖鏈的還原末端導入氨基，在該氨基上添加活化基團（例如參 照專利文獻1、2和非專利文獻1、2)。然而，在這種方法中，盡管天然存在的糖肽在糖鏈與肽 的結合中的立體構型是β型，但在向糖鏈中導入氨基的過程中，位于糖鏈還原末端的單元 糖是經過開環(huán)閉環(huán)而導入氨基的，因此出現了產生α端基異構體和β端基異構體的混合 物的問題。
[0006] 現有技術文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1 :國際公開第2005/010053號
[0009] 專利文獻 2 :ΕΡ0413675Α2
[0010] 非專利文獻
[0011] 非專利文獻 I :Biochemistry(1992)，第 31 卷，10724-10732 頁
[0012] 非專利文獻 2 :Biochemical J. (1993)，第 296 卷，817-825 頁


【發(fā)明內容】

[0013] 發(fā)明所要解決的課是頁
[0014] 在制備具有活化基團的糖鏈化合物時，在作為現有技術的碳酸銨法中，在向糖鏈 的還原末端導入氨基的過程中，位于糖鏈的還原末端的單元糖開環(huán)，出現了產生α端基異 構體和β端基異構體的混合物的問題。
[0015] 用于解決課題的方法
[0016] 為了解決上述課題，本發(fā)明人對β選擇性地制備在糖鏈的還原末端具有活化基 團的糖鏈化合物的方法進行了深入研究。其結果，本發(fā)明人發(fā)現了下述方法：以具有糖鏈 天冬酰胺結構的化合物為原料，從糖鏈肽中切斷糖鏈，使糖鏈的還原末端與來自天冬酰胺 側鏈的氮原子保持結合的狀態(tài)，不僅保持了上述糖鏈的還原末端與上述氮原子之間的共價 鍵、還保持了 β立體構型不變，向上述氮原子上導入活化基團，制備作為β端基異構體的、 具有活化基團的糖鏈化合物。另外，本發(fā)明人對上述制備方法進行了深入研究的結果，作為 本發(fā)明的化合物，發(fā)現了作為β端基異構體的新的具有活化基團的糖鏈化合物。
[0017] 即，本發(fā)明涉及下述式（Ia)所表示的化合物的制備方法，
[0018] G-NH-CO-CH2-Y1
[0019] (Ia)
[0020](其中，G表示糖鏈，Y1表示活化基團，G與NH結合，使NH的氮原子與上述糖鏈的 還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0021] 本發(fā)明的制備方法可以是上述式（Ia)所表示的化合物的制備方法，該方法包括 以下的步驟（a)?（b)。
[0022] 在本發(fā)明的制備方法中，步驟（a)可以是如下表示的步驟：
[0023] 步驟（a):在堿性條件下，使糖鏈天冬酰胺水解酶與具有下述式（2)所表示的糖鏈 天冬酰胺結構的化合物發(fā)生作用，得到下述式（3)所表示的化合物。
[0024] G-Asn
[0025] (2)
[0026] (其中，G表示糖鏈，Asn表示天冬酰胺，G與Asn結合，使上述天冬酰胺側鏈的氮 原子與上述糖鏈的還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0027] G-NH2
[0028] (3)
[0029] (其中，G表示糖鏈，NH2表示氨基，G與NH2結合，使來自上述天冬酰胺側鏈的氮原 子的氮原子與上述糖鏈的還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0030] 在本發(fā)明的制備方法中，步驟（b)可以是如下表示的步驟：
[0031] 步驟（b):使步驟（a)中得到的上述式（3)所表示的化合物與下述式（4)所表示 的化合物反應。
[0032] L1-CO-CH2-Y1
[0033] (4)
[0034] (其中，L1為離去基團，Y1為活化基團）。
[0035] 另外，在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，涉 及下述式（Ib)所表示的化合物的制備方法。
[0036] G-NH-CO-CH2-Y2
[0037] (Ib)
[0038] (其中，G表示糖鏈，Y2表示活化基團，G與NH結合，使NH的氮原子與上述糖鏈的 還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0039] 在本發(fā)明的制備方法中，上述式（Ib)所表示的化合物的制備方法可以包含以下 的步驟（a)?（C)。
[0040] 在本發(fā)明的式（Ib)所表示的化合物的制備方法中，步驟（a)可以是如下表示的步 驟：
[0041] 步驟（a):在堿性條件下，使糖鏈天冬酰胺水解酶與具有下述式（2)所表示的糖鏈 天冬酰胺結構的化合物發(fā)生作用，得到下述式（3)所表示的化合物。
[0042] G-Asn
[0043] (2)
[0044] (其中，G表示糖鏈，Asn表示天冬酰胺，G與Asn結合，使上述天冬酰胺側鏈的氮 原子與上述糖鏈的還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0045] G-NH2
[0046] (3)
[0047] (其中，G表示糖鏈，NH2表示氨基，G與NH2結合，使來自上述天冬酰胺側鏈的氮原 子的氮原子與上述糖鏈的還原末端以成為β型立體構型的方式進行結合）。
[0048] 在本發(fā)明的式（Ib)所表示的化合物的制備方法中，步驟（b)可以是如下表示的步 驟：
[0049] 步驟（b):使步驟（a)中得到的上述式（3)所表示的化合物與下述式（5)所表示 的化合物反應。
[0050] L1-CO-CH2-Z
[0051] (5)
[0052] (其中，L1為離去基團，Z為鹵原子）。
[0053] 在本發(fā)明的式（Ib)所表示的化合物的制備方法中，步驟（C)可以是如下表示的步 驟。
[0054] 步驟（c):使步驟（b)中得到的化合物與下述式（6a)或式（6b)所表示的化合物 反應。
[0055] L2-Y2
[0056] (6a)
[0057] (其中，L2為離去基團，Y2為活化基團）。
[0058] L3Y3
[0059] (6b)
[0060] (其中，L3為陽離子，Y3為上述活化基團Y2的陰離子，L3Y 3是L3與Y3的鹽）。
[0061] 在本發(fā)明的上述式（Ia)所表示的化合物的制備方法的一個實施方式中，Y1可以是 選自由溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、SHCH2CH 2NH2和CH(OMe) 2所構成的組的基團。
[0062] 在本發(fā)明的上述式（Ia)所表示的化合物的制備方法的一個實施方式中，Y1可以是 選自由溴原子、氯原子、碘原子和CH(OMe) 2所構成的組的基團。
[0063] 在本發(fā)明的上述式（Ib)所表示的化合物的制備方法的一個實施方式中，Z可以為 溴原子，Y 2可以是選自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2和SHCH2CH 2NH2所構成的組的基團。 [0064] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述步 驟（a)中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶可以是糖基天冬酰胺酶（GA)和/或肽：N-聚糖酶 (PNGase)。
[0065] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述步驟 (a)中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶可以是被固定在載體上的那些酶。
[0066] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述步驟 (a)中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶被固定在載體上，而且，在上述步驟（a)之后以及上述步 驟（b)之前可以包括以下的步驟（d)。
[0067] 步驟（d):從反應系統(tǒng)中分離被固定在載體上的上述糖鏈天冬酰胺水解酶。
[0068] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述步驟 (a)可以在0°C?40°C的溫度條件下進行。
[0069] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述步驟 (a)可以在0°C?KTC的溫度條件下進行。
[0070] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述糖鏈 可以是N-結合型糖鏈。
[0071] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述糖鏈 可以是N-結合型的復合型糖鏈。
[0072] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述糖鏈 可以是選自由二唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈和DiGlcNAc糖鏈所構成組的糖鏈。
[0073] 在本發(fā)明的具有活化基團的糖鏈化合物的制備方法的一個實施方式中，上述糖鏈 可以用下述的式（7)來表示。
[0074] [化學式1]
[0075]

【權利要求】
1. 下述式（la)所表示的化合物的制備方法， G-NH-CO-CH2-Y1 (la) 上述式（Ia)中，G表示糖鏈，Y1表示活化基團，G與NH結合，使NH的氮原子與上述糖 鏈的還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； 該制備方法包括下述的步驟（a)?（b): 步驟（a):在堿性條件下，使糖鏈天冬酰胺水解酶與具有下述式（2)所表示的糖鏈天冬 酰胺結構的化合物發(fā)生作用，得到下述式（3)所表示的化合物， G-Asn (2) 式（2)中，G表示糖鏈，Asn表示天冬酰胺，G與Asn結合，使上述天冬酰胺側鏈的氮原 子與上述糖鏈的還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； G-NH2 (3) 式⑶中，G表示糖鏈，NH2表示氨基，G與NH2結合，使來自上述天冬酰胺側鏈的氮原子 的氮原子與上述糖鏈的還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； 步驟（b):使步驟（a)中得到的上述式（3)所表示的化合物與下述式（4)所表示的化 合物反應， L1-CO-CH2-Y1 (4) (式⑷中，L1為離去基團，Y1為活化基團）。
2. 下述式（Ib)所表示的化合物的制備方法， G-NH-CO-CH2-Y2 (lb) 式（Ib)中，G表示糖鏈，Y2表示活化基團，G與NH結合，使NH的氮原子與上述糖鏈的 還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； 該制備方法包括下述的步驟（a)?（c): 步驟（a):在堿性條件下，使糖鏈天冬酰胺水解酶與具有下述式（2)所表示的糖鏈天冬 酰胺結構的化合物發(fā)生作用，得到下述式（3)所表示的化合物， G-Asn (2) 式（2)中，G表示糖鏈，Asn表示天冬酰胺，G與Asn結合，使上述天冬酰胺側鏈的氮原 子與上述糖鏈的還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； G-NH2 (3) 式⑶中，G表示糖鏈，NH2表示氨基，G與NH2結合，使來自上述天冬酰胺側鏈的氮原子 的氮原子與上述糖鏈的還原末端以成為P型立體構型的方式進行結合； 步驟（b):使步驟（a)中得到的上述式（3)所表示的化合物與下述式（5)所表示的化 合物反應， L1-CO-CH2-Z (5) 式（5)中，L1為離去基團，Z為鹵原子； 步驟（c):使步驟（b)中得到的化合物與下述式（6a)或式（6b)所表示的化合物反應， L2-Y2 (6a) 式（6a)中，L2為離去基團，Y2為活化基團； L3Y3 (6b) 式（6b)中，L3為陽離子，Y3為上述活化基團Y2的陰離子，L 3Y3是L3與Y3的鹽。
3. 根據權利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于=Y1選自由溴原子、氯原子、 碘原子、SH、N3、NHNH2、SHCH2CH2NH 2 和 CH(OMe)2 所構成的組。
4. 根據權利要求2所述的化合物的制備方法，其特征在于： Z為溴原子， Y2選自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2和SHCH2CH 2NH2所構成的組。
5. 根據權利要求1?4中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述步驟（a) 中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶為糖基天冬酰胺酶（GA)和/或肽：N-聚糖酶（PNGase)。
6. 根據權利要求1?4中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述步驟（a) 中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶被固定在載體上。
7. 根據權利要求1?4中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于： 上述步驟（a)中的上述糖鏈天冬酰胺水解酶被固定在載體上， 而且，在上述步驟（a)之后以及上述步驟（b)之前包括下述步驟（d): 步驟（d):從反應系統(tǒng)中分離被固定在載體上的上述糖鏈天冬酰胺水解酶。
8. 根據權利要求1?7中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述步驟（a) 在0°C?40°C的溫度條件下進行。
9. 根據權利要求1?7中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述步驟（a) 在0°C?KTC的溫度條件下進行。
10. 根據權利要求1?9中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述糖鏈為 N-結合型糖鏈。
11. 根據權利要求1?9中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述糖鏈為 N-結合型的復合型糖鏈。
12. 根據權利要求1?9中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述糖鏈是 選自由二唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈和DiGlcNAc糖鏈所構成的組的糖鏈。
13. 根據權利要求1?9中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述糖鏈是 用下述的式（7)來表示的糖鏈： [化學式1]

14. 根據權利要求1?9中任一項所述的化合物的制備方法，其特征在于：上述糖鏈 為二唾液酸糖鏈，構成上述二唾液酸糖鏈的唾液酸的側鏈羧酸通過酯化或酰胺化而得到保 護。
15. 下述式（Ic)所表示的化合物： [化學式8]
式（Ic)中，Y選自由溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、SHCH2CH 2NH2和CH(OMe)2所 構成的組， R和R'各自獨立地選自下述的式（8a)?式（8f)所表示的糖鏈： [化學式9]

16. 根據權利要求15所述的化合物，其中，Y選自由SH、N3、NHNH2、SHCH2CH 2NH2和 CH(OMe)2所構成的組。
17. 根據權利要求15所述的化合物，其中，Y選自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2 和 CH(OMe)2 所構成的組， R和R'相同，均為下述式（8b)或式（8c)所表示的糖鏈：
【文檔編號】C12P19/04GK104334737SQ201480001391
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權日:2013年4月19日
【發(fā)明者】村瀨健文 申請人:株式會社糖鎖工學研究所