一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置制造方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，包括錐形培養(yǎng)瓶，所述的培養(yǎng)瓶的瓶口處設(shè)置有可拆卸的瓶口內(nèi)套，在錐形瓶中設(shè)置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內(nèi)套上，提斗掛桿的下端設(shè)置有空載提斗；在瓶口內(nèi)套上設(shè)置有用于密封瓶口內(nèi)套的上蓋。本裝置經(jīng)過清潔處理后高壓滅菌可反復(fù)使用，成本低廉；在工程細(xì)胞抗體制備及表達(dá)過程中，可配套CO2培養(yǎng)箱或細(xì)胞培養(yǎng)搖床進(jìn)行1L-10L規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)放大抗體制備，方法簡單便于操作；針對不同細(xì)胞種系在采用本裝置選用載體的同時(shí)，也可根據(jù)自身細(xì)胞特性，選擇其他商品化載體，大大擴(kuò)展了本裝置的應(yīng)用范圍，能夠?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供有力的支持。
【專利說明】一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，用于 各類貼壁生長的工程細(xì)胞，如CH0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞等。

【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)是組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。近來由于生物科學(xué)和技術(shù)科學(xué)相互滲 透、遺傳學(xué)和生物化學(xué)的相互結(jié)合，分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞工程等新型學(xué)科迅速發(fā) 展。這些新學(xué)科的形成與發(fā)展都與組織培養(yǎng)技術(shù)密切相關(guān)，目前的組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不僅 是用于研究生命科學(xué)理論的重要技術(shù)方法，同時(shí)也日益成為生物工程、基因工程制藥的生 產(chǎn)工具和手段。
[0003] 貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependent culture)是讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上進(jìn)行增殖 的培養(yǎng)方法，主要適用于一切貼壁細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。實(shí)際生產(chǎn)中具有貼壁生長 特性的細(xì)胞種類較多，如CH0細(xì)胞、BHK細(xì)胞和Vero細(xì)胞等。
[0004] 貼壁培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞可貼附于培養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)外表面，細(xì)胞將有效的表達(dá)產(chǎn) 品，同時(shí)容易進(jìn)行培養(yǎng)液的更換，容易采用灌流培養(yǎng)的模式，培養(yǎng)過程不段添加新鮮培養(yǎng) 液，去除代謝產(chǎn)物，從而使單位體積內(nèi)細(xì)胞密度較高，與懸浮培養(yǎng)相比可維持的培養(yǎng)周期相 對較長。而貼壁培養(yǎng)的不足之處是操作比較繁瑣，需要合適的貼附材料以及足夠的貼附面 積，培養(yǎng)條件不均一。由于貼壁細(xì)胞的貼壁要求，提高細(xì)胞密度的有效方法就是使反應(yīng)體系 中比表面積最大化。傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法包括轉(zhuǎn)瓶（roller bottle)、多層平板培養(yǎng) 如Nune公司、CellCube和Costar公司的細(xì)胞工廠（cell factories)，和攪拌式微栽體懸 浮培養(yǎng)。
[0005] 現(xiàn)有的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，存在相當(dāng)多的弊端，如勞動(dòng)、設(shè)備、耗材的消耗大大增 加了生產(chǎn)成本，如Costar公司的5L體積細(xì)胞工廠系統(tǒng)和GE公司的50mg規(guī)格disc碟形載 體等價(jià)值萬元的一次性耗材設(shè)備；大體積的轉(zhuǎn)瓶、細(xì)胞工廠因?yàn)榍鍧嵲螂y以重復(fù)使用，為 增加其貼壁面積，體積或數(shù)量也相應(yīng)增加，使得操作、污染防范變得更加困難；由于細(xì)胞貼 壁生長，在培養(yǎng)結(jié)束后，貼壁介質(zhì)表面會(huì)附著大量的粘連蛋白和細(xì)胞碎片，使得系統(tǒng)的清潔 和質(zhì)量控制變得更加困難，外源污染的控制又增加了額外的研發(fā)成本。所以這些因素大大 限制了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)在抗體研發(fā)過程中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本實(shí)用新型的目的在于，提供一種用于動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的裝置，可針對CH0細(xì) 胞、HEK293細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞等貼壁生長的動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)行中試規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行百毫 克級的目標(biāo)蛋白抗體的表達(dá)，提高前期抗體藥物開發(fā)效率，降低研發(fā)成本，同時(shí)為腫瘤或組 織細(xì)胞體外大量擴(kuò)增及DNA載體體外轉(zhuǎn)染等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供有力的支持。
[0007] 本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，包括錐形培養(yǎng)瓶，所述的培養(yǎng)瓶的瓶口處設(shè)置有可 拆卸的瓶口內(nèi)套，在錐形瓶中設(shè)置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內(nèi)套 上，提斗掛桿的下端設(shè)置有空載提斗；在瓶口內(nèi)套上設(shè)置有用于密封瓶口內(nèi)套的上蓋。
[0009] 進(jìn)一步地，所述的提斗掛桿包括彎桿，彎桿由相互平行的上段桿和下段桿以及連 接上段桿和下段桿的連接桿組成，為一體式結(jié)構(gòu)；上段桿的長度大于下段桿的長度，上段 桿的頂端固結(jié)有寬度大于上段桿直徑的卡片，在下段桿上加工有用于安裝空載提斗的外螺 紋。
[0010] 進(jìn)一步地，提斗掛桿安裝在瓶口內(nèi)套上時(shí)，提斗掛桿和空載提斗的下端均不與培 養(yǎng)瓶底面接觸。
[0011] 進(jìn)一步地，所述的空載提斗為空心的矩形體結(jié)構(gòu)，在空載提斗的側(cè)壁上均勻分布 有多個(gè)穿透側(cè)壁的圓孔，空載提斗通過其上部的上緊固螺母和下部的下緊固螺母安裝在提 斗掛桿的下段桿上。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的瓶口內(nèi)套包括環(huán)形套和與環(huán)形套同軸心線固結(jié)的套筒，環(huán)形套 的內(nèi)徑與套筒的內(nèi)徑相同，套筒的外徑小于培養(yǎng)瓶瓶口的內(nèi)徑，環(huán)形套的外徑大于培養(yǎng)瓶 瓶口的外徑。
[0013] 進(jìn)一步地，在環(huán)形套和套筒的內(nèi)壁上沿軸向加工有用于安裝提斗掛桿的卡槽，卡 槽長度小于瓶口內(nèi)套的軸向長度。
[0014] 進(jìn)一步地，所述的空載提斗中裝有載體，空載提斗位于培養(yǎng)瓶的中下部位置。
[0015] 進(jìn)一步地，所述的空載提斗在培養(yǎng)瓶中設(shè)置1?4個(gè)。
[0016] 本實(shí)用新型的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1)本裝置可應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，在細(xì)胞生物學(xué)及細(xì)胞工程領(lǐng)域，有廣泛的 應(yīng)用價(jià)值，適用于細(xì)胞增殖培養(yǎng)或工程細(xì)胞培養(yǎng)抗體制備等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究；
[0018] 2)本裝置可對振蕩器旋轉(zhuǎn)速率、提斗掛桿類型、貼壁載體類別進(jìn)行選、擇調(diào)整，以 優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞貼附能力，增加細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高細(xì)胞密度及產(chǎn)物產(chǎn)量；
[0019] 3)本裝置操作簡便、成本低廉，提斗及培養(yǎng)瓶可經(jīng)過堿液處理清潔后高壓后重復(fù) 使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是本裝置的整體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖2是提斗掛桿部分的正視圖；
[0022] 圖3是提斗掛桿部分的側(cè)視圖；
[0023] 圖4是瓶口內(nèi)套的軸向剖視圖；
[0024] 圖5是瓶口內(nèi)套的俯視圖；
[0025] 圖6是三種細(xì)胞方瓶及本裝置貼壁培養(yǎng)密度對比；
[0026] 圖7是三種細(xì)胞硼酸鹽玻璃纖維貼壁培養(yǎng)顯微觀察；
[0027] 圖8是293T細(xì)胞錐形瓶內(nèi)貼壁轉(zhuǎn)染eGFP-Nl質(zhì)粒綠色熒光蛋白表達(dá)；
[0028] 圖9是對比實(shí)例3的H18嵌合抗體表達(dá)制備對比圖；
[0029] 圖10是對比實(shí)例4的CypA抗體表達(dá)制備對比圖；
[0030] 圖11是對比實(shí)例5的H18嵌合抗體表達(dá)制備對比圖；
[0031] 圖中標(biāo)號(hào)代表：1 一上蓋，2-套筒，3-培養(yǎng)瓶，4一上段桿，5-連接桿，6-上緊固 螺母，7-蓋體，8-空載提斗，9-下段桿，10-下緊固螺母，11-環(huán)形套，12-卡槽，13-卡 片；
[0032] 以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 遵從上述技術(shù)方案，如圖1至圖3所示，一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，包括錐形培 養(yǎng)瓶3,所述的培養(yǎng)瓶3的瓶口處設(shè)置有可拆卸的瓶口內(nèi)套，在錐形瓶中設(shè)置有提斗掛桿， 提斗掛桿的上端可拆卸地安裝在瓶口內(nèi)套上，提斗掛桿的下端設(shè)置有空載提斗8 ;在瓶口 內(nèi)套上設(shè)置有用于密封瓶口內(nèi)套的上蓋1。
[0034] 本裝置的主體結(jié)構(gòu)為透明的錐形培養(yǎng)瓶3,培養(yǎng)瓶3的瓶口上設(shè)置有瓶口內(nèi)套。如 圖4所示，瓶口內(nèi)套包括環(huán)形套11和與環(huán)形套11同軸心線固結(jié)的套筒2,環(huán)形套11的內(nèi)徑 與套筒2的內(nèi)徑相同，套筒2的外徑小于培養(yǎng)瓶3瓶口的內(nèi)徑，環(huán)形套11的外徑大于培養(yǎng) 瓶3瓶口的外徑，使用時(shí)將瓶口內(nèi)套塞在培養(yǎng)瓶3的瓶口上，用來安裝提斗掛桿。為了保證 培養(yǎng)瓶3的密封性，套筒2的外徑宜略小于瓶口的內(nèi)徑。
[0035] 瓶口內(nèi)套上設(shè)置有上蓋1，上蓋1的縱向截面為倒梯形，當(dāng)瓶口內(nèi)套裝在培養(yǎng)瓶3 的瓶口上時(shí)，將上蓋1用以密封瓶口內(nèi)套。
[0036] 提斗掛桿包括彎桿，彎桿由相互平行的上段桿4和下段桿9以及連接上段桿4和 下段桿9的連接桿5組成，為一體式結(jié)構(gòu)；上段桿4的長度大于下段桿9的長度，上段桿4 的頂端固結(jié)有寬度大于上段桿4直徑的卡片13,卡片13的作用是卡在瓶口內(nèi)套中的卡槽 12中；在下段桿9上加工有用于安裝空載提斗8的外螺紋。提斗掛桿安裝在瓶口內(nèi)套上時(shí)， 提斗掛桿和空載提斗8的下端均不與培養(yǎng)瓶3底面接觸，保持一定的距離。
[0037] 空載提斗8為空心的矩形體結(jié)構(gòu)，其上部有蓋體7,在空載提斗8的側(cè)壁上均勻分 布有多個(gè)穿透側(cè)壁的圓孔，空載提斗8的上端和下端分別設(shè)置有上緊固螺母6和下緊固螺 母10,通過兩個(gè)螺母將其緊固安裝在提斗掛桿的下段桿9上，并可以進(jìn)行拆卸。
[0038] 在瓶口內(nèi)套的內(nèi)壁上，即環(huán)形套11和套筒2的內(nèi)壁上，沿其軸向加工有用于安裝 提斗掛桿的卡槽12,如圖5所示；卡槽12長度小于瓶口內(nèi)套的軸向長度，即卡槽12相對 于瓶口內(nèi)套的軸向是未通透的，將提斗掛桿的卡片13沿卡槽12的延伸方向放置在卡槽12 中，即可用于掛載空載提斗8 ;而將提斗掛桿從卡槽12中提出，即可實(shí)現(xiàn)提斗掛桿與瓶口內(nèi) 套的分離。空載提斗8優(yōu)選在培養(yǎng)瓶3中設(shè)置1?4個(gè)。
[0039] 瓶口內(nèi)套、提斗掛桿、空載提斗8及上緊固螺母6、下緊固螺母10均采用316L不銹 鋼制作，瓶口內(nèi)套、提斗掛桿與空載提斗8內(nèi)外表面均經(jīng)過拋光處理。
[0040] 本裝置采用懸掛設(shè)計(jì)將不銹鋼空載提斗8懸掛于培養(yǎng)瓶3的中下部，可通過過變 更掛桿類型調(diào)節(jié)空載提斗8距離錐形瓶中心的距離，從而調(diào)整液流湍動(dòng)程度。
[0041] 在空載提斗8中的載體在高壓滅菌前進(jìn)行清潔與填充，載體為硼酸鹽玻璃纖維 絲，使用多聚賴氨酸進(jìn)行表面處理，增加細(xì)胞貼附力度，同時(shí)本裝置可選擇填裝巨載體、碟 形載體等直徑大于2mm的商品化載體。
[0042] 本裝置的清潔及安裝
[0043] 1)使用5 % DeC〇n90清洗液浸泡培養(yǎng)瓶3、載體及各個(gè)部件過夜；
[0044] 2)分別使用自來水及純水充分沖洗瓶體、載體及各個(gè)部件；
[0045] 3)以當(dāng)日純水pH為標(biāo)準(zhǔn)，使用pH試紙檢測各部件殘水pH值，直至與純水pH相 等；
[0046] 4)稱取適量載體（硼酸鹽玻璃纖維或商品化載體），打開空載提斗8的蓋體7,將 載體裝入空載提斗8中；將空載提斗8的蓋體7由下端穿入提斗掛桿中，連接提斗掛桿與下 緊固螺母10,封閉空載提斗8,旋緊提斗掛桿上方的上緊固螺母6 ;
[0047] 5)將安裝完成的空載提斗8依次緩慢垂直放入錐形培養(yǎng)瓶3中；
[0048] 6)將瓶口內(nèi)套套裝入錐形培養(yǎng)瓶3中，將提斗掛桿上端卡口裝卡
[0049] 入瓶口內(nèi)套的卡槽12內(nèi)，蓋上錐形培養(yǎng)瓶3上蓋1 ;
[0050] 7)放入高壓滅菌器中，將錐形培養(yǎng)瓶3上蓋1旋開1/3,開始高壓滅菌，121 °C高壓 30min ；
[0051] 8)高壓滅菌完成后，封閉錐形培養(yǎng)瓶3的上蓋1，待用。
[0052] 硼酸鹽玻璃纖維載體處理
[0053] 通過多聚賴氨酸處理可提高硼酸鹽玻璃纖維的細(xì)胞貼附能力，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除雜交瘤 細(xì)胞及Vero細(xì)胞外，腫瘤細(xì)胞、CH0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞及BHK21細(xì)胞對硼酸鹽玻璃纖維有良 好的貼附能力。所以，可根據(jù)具體培養(yǎng)情況選擇是否進(jìn)行多聚賴氨酸處理。
[0054] 1)使用PBS配制100 μ g/ml多聚賴氨酸溶液,0. 22 μ m濾器過濾除菌；
[0055] 2)無菌PBS稀釋至25 μ g/ml，加入本裝置的無菌錐形培養(yǎng)瓶3中，液體應(yīng)浸沒空 載提斗8的上部；
[0056] 3)室溫過夜，PBS沖洗3遍后，待用；
[0057] 細(xì)胞培養(yǎng)生長實(shí)例1
[0058] 1.細(xì)胞接種
[0059] 將約IX 107cells數(shù)量的CH〇-kl、HEK293T、H18雜交瘤細(xì)胞接種至分別加裝玻璃 纖維及GE公司商品化disc碟形載體的錐形培養(yǎng)瓶3中，補(bǔ)加1640添加10%胎牛血清培養(yǎng) 基至500ml，放置于細(xì)胞搖床中；
[0060] 1)培養(yǎng)觀察
[0061] 每日顯微鏡觀察上清液中細(xì)胞懸浮狀況；
[0062] 2)細(xì)胞計(jì)數(shù)
[0063] 培養(yǎng)5天后，棄去上清液，50ml胰酶消化各提斗中細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì) 數(shù)；
[0064] 3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065] 接種24h后，細(xì)胞均貼附于載體中，上清取樣觀察基本無細(xì)胞懸浮，48_72h間可觀 察到上清液逐漸變黃，72h后上清液中脫落細(xì)胞及碎片逐漸增加；回收消化計(jì)數(shù)結(jié)果見圖 6,結(jié)果顯示應(yīng)用本裝置可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)大量擴(kuò)增，商品化載體disc貼壁載體培養(yǎng)效 果略優(yōu)于硼酸鹽玻璃纖維載體，玻璃纖維載體顯微圖片見圖7。
[0066] 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染實(shí)例2
[0067] 1)細(xì)胞接種
[0068] 將約IX 107cells數(shù)量HEK293T接種至加裝硼酸鹽玻璃纖維錐形培養(yǎng)瓶3中，補(bǔ) 加1640添加10%胎牛血清培養(yǎng)基至450ml，放置于細(xì)胞搖床中過夜培養(yǎng)；
[0069] 2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0070] i.按照PEI (sigma)使用說明書，以PEI/DNA1:2比例混勻eGFP-Nl質(zhì)粒DNA與PEI 溶液，質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)濃度2ug/ml，室溫放置lOmin ;
[0071] ii.棄去培養(yǎng)瓶3內(nèi)血清培養(yǎng)基，使用無菌PBS溶液輕輕沖洗1-2次，加入 450ml 1640 培養(yǎng)基；
[0072] iii.將質(zhì)粒DNA與PEI共聚物溶液加入培養(yǎng)瓶3中，放入細(xì)胞搖床中培養(yǎng)4h后， 加入10 %胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0073] 3)熒光蛋白表達(dá)觀察
[0074] 24h后，取出玻璃纖維載體，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)狀況；
[0075] 4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0076] 如圖8顯示，24h后293T細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染eGFP-Nl質(zhì)粒后，綠色熒光蛋白 正常表達(dá)，且具有較高的熒光強(qiáng)度。
[0077] H18抗體表達(dá)制備對比實(shí)例3
[0078] 1)細(xì)胞接種
[0079] i.將約lX107cells數(shù)量的H18雜交瘤細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補(bǔ)加1640添加10%胎牛血清培養(yǎng)基至500ml ;
[0080] ii.將培養(yǎng)瓶3放置于C02培養(yǎng)搖床中，旋轉(zhuǎn)振蕩，設(shè)置轉(zhuǎn)速50rpm/min，觀察培 養(yǎng)；
[0081] ^丨.4811后細(xì)胞工廠補(bǔ)加11^1640添加10%胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶3逐步調(diào)節(jié)振 蕩器轉(zhuǎn)速至80rpm/min ;
[0082] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統(tǒng)純化目標(biāo)抗體
[0083] 2)制備檢測
[0084] 經(jīng)過5天培養(yǎng)，細(xì)胞工廠回收上清約1.9L，獲得抗體85.8mg，得率為45. 16mg/ L ;本裝置回收上清0. 85L，獲得抗體38. 6mg，得率為45. 4mg/L，產(chǎn)量無明顯差別；經(jīng)過 SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖9所示。
[0085] CypA抗體表達(dá)制備對比實(shí)例4
[0086] 1)細(xì)胞接種
[0087] i.將約lX107cells數(shù)量的H18雜交瘤細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補(bǔ)加1640添加10%胎牛血清培養(yǎng)基至500ml ;
[0088] ii.將培養(yǎng)瓶3放置于C02培養(yǎng)搖床中，旋轉(zhuǎn)振蕩，設(shè)置轉(zhuǎn)速60rpm/min，觀察培 養(yǎng)；
[0089] iii. 48h后培養(yǎng)瓶3逐步調(diào)節(jié)振蕩器轉(zhuǎn)速至100rpm/min ;
[0090] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統(tǒng)純化目標(biāo)抗體。
[0091] 2)制備檢測
[0092] 經(jīng)過5天培養(yǎng)，Ge公司disc載體回收上清0. 45L，獲得抗體5. 15mg，得率為 11. 4mg/L ;玻璃纖維載體回收上清0. 45L，獲得抗體4. 28mg，得率為9. 5mg/L，產(chǎn)量無明顯差 另IJ ;經(jīng)過SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖10所示。
[0093] H18嵌合抗體表達(dá)制備對比實(shí)例5
[0094] 1)細(xì)胞接種
[0095] i.將約lX107cells數(shù)量的H18雜交瘤細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶3中，瓶中分別加載GE 公司disc載體及玻璃纖維載體，分別補(bǔ)加1640添加10%胎牛血清培養(yǎng)基至500ml ;
[0096] ii.將培養(yǎng)瓶3放置于C02培養(yǎng)搖床中，旋轉(zhuǎn)振蕩，設(shè)置轉(zhuǎn)速60rpm/min，觀察培 養(yǎng)；
[0097] iii. 48h后培養(yǎng)瓶3逐步調(diào)節(jié)振蕩器轉(zhuǎn)速至100rpm/min ;
[0098] iv. 5天后回收上清液，AKTA親和層析系統(tǒng)純化目標(biāo)抗體
[0099] 2)制備檢測
[0100] 經(jīng)過5天培養(yǎng)，Ge公司disc載體回收上清0. 45L，獲得抗體37. 26mg，得率為 82. 8mg/L ;玻璃纖維載體回收上清0. 45L，獲得抗體39. 42mg，得率為87. 6mg/L，產(chǎn)量無明顯 差別；經(jīng)過SDS-PAGE檢測，抗體純度及分子量無明顯差異，如圖11所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，包括錐形培養(yǎng)瓶（3)，其特征在于，所述的培養(yǎng)瓶（3) 的瓶口處設(shè)置有可拆卸的瓶口內(nèi)套，在錐形瓶中設(shè)置有提斗掛桿，提斗掛桿的上端可拆卸 地安裝在瓶口內(nèi)套上，提斗掛桿的下端設(shè)置有空載提斗（8);在瓶口內(nèi)套上設(shè)置有用于密 封瓶口內(nèi)套的上蓋（1)。
2. 如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述的提斗掛桿包括彎 桿，彎桿由相互平行的上段桿（4)和下段桿（9)以及連接上段桿（4)和下段桿（9)的連接桿 (5)組成，為一體式結(jié)構(gòu)；上段桿（4)的長度大于下段桿（9)的長度，上段桿（4)的頂端固 結(jié)有寬度大于上段桿（4)直徑的卡片（13)，在下段桿（9)上加工有用于安裝空載提斗（8) 的外螺紋。
3. 如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，提斗掛桿安裝在瓶口內(nèi) 套上時(shí)，提斗掛桿和空載提斗（8)的下端均不與培養(yǎng)瓶（3)底面接觸。
4. 如權(quán)利要求2所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)為空 心的矩形體結(jié)構(gòu)，在空載提斗（8)的側(cè)壁上均勻分布有多個(gè)穿透側(cè)壁的圓孔，空載提斗（8) 通過其上部的上緊固螺母（6)和下部的下緊固螺母（10)安裝在提斗掛桿的下段桿（9)上。
5. 如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述的瓶口內(nèi)套包括環(huán) 形套（11)和與環(huán)形套（11)同軸心線固結(jié)的套筒（2)，環(huán)形套（11)的內(nèi)徑與套筒（2)的內(nèi) 徑相同，套筒（2)的外徑小于培養(yǎng)瓶（3)瓶口的內(nèi)徑，環(huán)形套（11)的外徑大于培養(yǎng)瓶（3) 瓶口的外徑。
6. 如權(quán)利要求5所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，在環(huán)形套（11)和套筒 (2)的內(nèi)壁上沿軸向加工有用于安裝提斗掛桿的卡槽（12)，卡槽（12)長度小于瓶口內(nèi)套的 軸向長度。
7. 如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)中裝 有載體，空載提斗（8)位于培養(yǎng)瓶（3)的中下部位置。
8. 如權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，其特征在于，所述的空載提斗（8)在培 養(yǎng)瓶⑶中設(shè)置1?4個(gè)。
【文檔編號(hào)】C12M3/04GK203999636SQ201420408859
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】陳志南, 張陽, 王彬, 張征, 南剛, 孫秀璇, 馮飛, 王曄, 徐力清, 姚西英 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)