一種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法及其試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法，步驟為，提取種公?；蚪MDNA，測(cè)定公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g.478A>G，根據(jù)種公牛第478堿基的等位基因預(yù)測(cè)種公牛的精液品質(zhì)：當(dāng)種公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g.478A>G為GG基因型時(shí)，種公牛精液品質(zhì)最好；當(dāng)種公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g.478A>G為AA基因型時(shí)，種公牛精液品質(zhì)最差。此外，PRM2基因SNP位點(diǎn)g.478A>G，使氨基酸序列發(fā)生變化，該位點(diǎn)氨基酸由精氨酸(R)變?yōu)楦拾彼?G)。本發(fā)明還提供了用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的引物及其含有該引物的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明首次闡明了公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)與公牛精液品質(zhì)的相關(guān)性，減少種公牛飼養(yǎng)的盲目性，節(jié)約成本，增加經(jīng)濟(jì)效益。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法及其試劑盒，具體涉及一種 早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的PRM2基因SNP位點(diǎn)、應(yīng)用方法及試劑盒，屬于家畜繁殖育 種分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛業(yè)發(fā)展水平是一個(gè)國(guó)家畜牧業(yè)發(fā)展水平高低的重要標(biāo)志。加快奶牛種群改良 是促進(jìn)奶牛事業(yè)發(fā)展的重要舉措。隨著人工授精和冷凍精液的日益普及，在現(xiàn)代奶牛群體 改良體系中，種公牛是影響奶牛群遺傳品質(zhì)的主要因素。而種公牛精液品質(zhì)的優(yōu)劣直接影 響牛群的繁殖效率。公牛的采精量、鮮精活力、凍精解凍后活力、鮮精密度和精子畸形率是 國(guó)際公認(rèn)的衡量種公牛精液品質(zhì)的重要指標(biāo)。公牛的精液品質(zhì)是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，也是復(fù) 雜的數(shù)量性狀，在受微效多基因控制的同時(shí)，也受一個(gè)或幾個(gè)主基因控制，因此，篩選鑒定 影響公牛精液品質(zhì)性狀的主基因并闡明其對(duì)精子發(fā)育的調(diào)控作用和作用機(jī)制，對(duì)于篩選優(yōu) 良精液品質(zhì)的公牛具有重要的意義。通過(guò)標(biāo)記輔助選擇（markerassistedselected,MAS) 育種，可以為培育優(yōu)良精液品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)種公牛提供參考。
[0003] 魚(yú)精蛋白（Pr〇te〇miCS，PRMS)是精細(xì)胞中主要的核蛋白，存在于精子頭部，對(duì)精 子表型分化起到重要的遺傳調(diào)控作用，對(duì)精子DNA的正確包裹和精子正常功能的維持至關(guān) 重要。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠PRM表達(dá)量不足會(huì)導(dǎo)致染色體異常包裹和雄性不育。表明PRM基因 可作為候選基因用來(lái)選擇公畜精液品質(zhì)的優(yōu)劣。但目前尚沒(méi)有針對(duì)種公牛的PRM2基因進(jìn) 行研究以篩選具有優(yōu)良精液品質(zhì)的種公牛的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用公牛PRM2基因SNP分子標(biāo)記篩 選精液品質(zhì)優(yōu)劣的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是通過(guò)此分子標(biāo)記與種公牛精液品質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)而提供一種新 的篩選優(yōu)質(zhì)精液品質(zhì)種公牛的試劑盒，可對(duì)優(yōu)良精液品質(zhì)的種公牛進(jìn)行早期篩選。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的SNP位點(diǎn)，所述SNP位點(diǎn)為g. 478A>G，位 于公牛PRM2基因第478位堿基，公牛PRM2基因第478位為A等位基因。核苷酸位置的編 號(hào)基于GenBank索引號(hào)：GenBankAccessionNoNC_007326.5(11051633-11052382)，起始 密碼子ATG作為+1。
[0008] 本發(fā)明提出的新的公牛PRM2基因的功能性分子標(biāo)記g. 478A>G，是檢測(cè)公牛自 GenBankAccessionNoNC_007326. 5 (11051633-11052382,起始密碼子ATG作為+1)中的 第478位脫氧核糖核苷酸是A還是G，并且采用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒別種公牛在這個(gè)位點(diǎn) 的基因型。利用該SNP與種公牛精液品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析表明該SNP與種公牛精液品質(zhì)性 狀有關(guān)，選擇有利的GG基因型個(gè)體留種。
[0009]該種公牛的SNP位點(diǎn)可以應(yīng)用于制備篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒。
[0010] 一種應(yīng)用公牛PRM2基因SNP分子標(biāo)記早期篩選精液品質(zhì)優(yōu)劣的方法，提取種公牛 基因組DNA，測(cè)定公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G，根據(jù)種公牛第478堿基的等位基因預(yù) 測(cè)種公牛的精液品質(zhì)：當(dāng)種公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G為GG基因型時(shí)，種公牛精液 品質(zhì)最好；當(dāng)種公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G為AA基因型時(shí)，種公牛精液品質(zhì)最差。 [0011] 一種用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的引物，具有如序列表SEQIDNO. 2和SEQ IDNO. 3所示的堿基序列；所述引物可以特異性擴(kuò)增出含PRM2基因的SEQIDNO. 1所示序 列。
[0012] 一種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的試劑盒，該試劑盒含有可以特異性擴(kuò)增出含 PRM2基因的引物序列。
[0013] 所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液和限制性?xún)?nèi)切酶；所述PCR反應(yīng)液為T(mén)aqPCR MasterMix，所述限制性?xún)?nèi)切酶為PstI。該限制性?xún)?nèi)切酶PstI酶切位點(diǎn)是通過(guò)人工創(chuàng)造的 方法獲得的，當(dāng)?shù)?74位點(diǎn)A變?yōu)镃后新產(chǎn)生的。
[0014] 具體的，用于早期篩選種公牛精子活力高低的試劑盒，為100頭牛檢測(cè)劑量，試劑 盒的保存溫度為-20°c，試劑盒的組成如下：
[0015]lOOymol/L的上游引物 20μL;
[0016]lOOymol/L的下游引物 20μL;
[0017] 2XTaqPCRMasterMixImL；
[0018] ddH20I. 2mL；
[0019] 所述上游引物序列為序列表中SEQIDNO. 2所示的堿基序列；
[0020] 所述下游引物序列為序列表中SEQIDNO. 3所示的堿基序列；
[0021] 所述試劑盒中還包括PRM2基因中SNP位點(diǎn)g. 478A>G通過(guò)創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法（第 474位點(diǎn)A變?yōu)镃)產(chǎn)生的限制性?xún)?nèi)切酶PstI。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G篩選分型方法，包括以下步 驟：
[0023] (1)采集種公牛血液或精液，利用高鹽法提取血液或精液基因組DNA，DNA樣品被 稀釋成50ng/μL，備用；
[0024] (2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：g. 478A>G，其中，核苷酸位置 編號(hào)基于GenBank索引號(hào)：GenBankAccessionNoNC_007326. 5(11051633-11052382)，起 始密碼子ATG作為+1)。
[0025] (3)針對(duì)478堿基單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A/G，設(shè)計(jì)公牛PRM2基因特異性引物，進(jìn)行 PCR反應(yīng)，得到特定片段（如序列表SEQIDNO:1所示）的擴(kuò)增產(chǎn)物1;所述的基因特異性 引物具有如序列表SEQIDNO:2和序列表SEQIDNO:3所示的序列，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 為 241bp。
[0026] (4)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物1的PstI單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A/G的多態(tài)性：限制性?xún)?nèi)切核酸 酶PstI酶切所述擴(kuò)增產(chǎn)物1，若得到216bp和25bp片段，其基因型為AA純合體；若得到 241bp、216bp和25bp三個(gè)酶切片段時(shí)，其基因型為AG雜合體；若得到241bp片段，其基因 型為GG純合體。（其中25bp片段在瓊脂糖凝膠中未能顯現(xiàn)出來(lái)）
[0027] 本發(fā)明的有益效果：
[0028] (1)本發(fā)明在公牛PRM2基因478位鑒定出1個(gè)突變位點(diǎn)，經(jīng)國(guó)際基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和 文獻(xiàn)專(zhuān)利檢索，證明為新的SNP位點(diǎn)。
[0029] (2)經(jīng)將上述的SNP位點(diǎn)g. 478A>G與500頭中國(guó)荷斯坦種公牛個(gè)體的精液品質(zhì) 性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，GG基因型個(gè)體的種公牛精液品質(zhì)性狀高于其他基因型個(gè)體，因此可 以用于種公牛的早期篩選，從而減低飼養(yǎng)成本，增加產(chǎn)品的附加值。
[0030] (3)公牛PRM2基因的SNP位點(diǎn)g. 478A>G，導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生變化，該位點(diǎn)氨基 酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼帷?br> [0031] (4)本發(fā)明還提供了一種新型的應(yīng)用性試劑盒，利用公牛PRM2基因第478位SNP 位點(diǎn)對(duì)種公牛精子活力的高低進(jìn)行篩選，可用于種公牛的早期檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，降低 了檢測(cè)成本，減少種公牛飼養(yǎng)的盲目性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PstI酶切結(jié)果；
[0033] 圖2公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G氨基酸變化結(jié)果，該突變導(dǎo)致原編碼的精 氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?br>
【具體實(shí)施方式】
[0034] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0035] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等 人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述 的條件或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0036] 實(shí)施例1 :突變位點(diǎn)的確定
[0037] 本發(fā)明采用PCR測(cè)序和PCR-RFLP技術(shù)對(duì)奶牛PRM2基因突變進(jìn)行篩查，通過(guò)酶切 電泳條帶及測(cè)序結(jié)果比對(duì)，確定了第478位突變位點(diǎn)。
[0038] 1. 1采集種公牛精液
[0039] 本發(fā)明所使用的種公牛精液取自北京奶牛中心、上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司、 山東奧克斯種公牛站等，依照高鹽法提取精液基因組DNA，DNA樣品被稀釋成50ng/μL備 用。實(shí)驗(yàn)牛共500頭。
[0040] 1.2引物設(shè)計(jì)
[0041] 根據(jù)GenBank登陸號(hào)為NC_007326. 5(11051633-11052382)的PRM2 的基因序列， 用PrimerPremier5. 0軟件設(shè)計(jì)引物，以公牛精液DNA為模板，擴(kuò)增PRM2基因的編碼區(qū)。所 設(shè)計(jì)引物的序列如下
[0042] F:GATGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGC(如序列表中SEQIDNO. 2 所示）
[0043] R:CCCGTGGGGAACAGAAGCTA(如序列表中SEQIDNO. 3 所示）
[0044] 1.3PCR擴(kuò)增
[0045] 25 4 1^的反應(yīng)體系：模板（50叩/^1^)14 1^，1(^111〇1/1上下游引物各14 1^2\丁&9 PCRMasterMix12. 5μL,ddH20 4. 5μL。
[0046] ?〇?反應(yīng)條件：941：變性51^11，941：變性308,571：退火308,721：延伸148,35個(gè)循 環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0047]I. 4SNP的檢測(cè)和分型
[0048]PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用ABI3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。通過(guò)創(chuàng) 造酶切位點(diǎn)法（第474位點(diǎn)A變?yōu)镃)，478位點(diǎn)的A/G突變產(chǎn)生PstI單核苷酸多態(tài)。酶切 反應(yīng)體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL;10XFastDigestBuffer2μL;FastDigest限制酶PstI lyL;ddH20 12yL，酶切反應(yīng)條件為：37°C消化30min。478位點(diǎn)的PstI單核苷酸多態(tài)發(fā)現(xiàn) 3 種基因型，分別為AA(216bp+25bp)型、AG(241bp+216bp+25bp)型和GG(241bp)型。
[0049] 采用3. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用UVP凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)進(jìn)行基因分型，根據(jù) 瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶區(qū)分不同的基因型，結(jié)果如圖1所示，分析位點(diǎn)的多態(tài)性情況 (其中25bp片段較小，在瓊脂糖凝膠中未顯示出）。
[0050] 實(shí)施例2PRM2基因SNP分子標(biāo)記g. 478A>G與種公牛精液品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析
[0051] 試驗(yàn)公牛均具有完整的精液品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)指標(biāo)包括：鮮精活力、鮮精密度、 凍后活力以及精子畸形率等。
[0052] 采用SAS 9. 0統(tǒng)計(jì)軟件，調(diào)用GLM程序，運(yùn)用最小二乘法擬合線(xiàn)性模型，比較公牛 基因型與精液性狀（鮮精密度、鮮精活力、凍后活力）的相關(guān)性。其模型為：
[0053] Yijk = Ii +Gi+Yj+Hk+eiJk
[0054]Yijk為公牛精子各種性狀的觀(guān)察值；μ為群體平均值；Gi:基因型的固定效應(yīng)；Hk: 場(chǎng)次的固定效應(yīng)；Yy季節(jié)的固定效應(yīng)；eiA :隨機(jī)殘差效應(yīng)。
[0055] 對(duì)PRM2基因的SNP位點(diǎn)g. 478A>G不同基因型與公牛精液品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分 析，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明：g. 478A>G位點(diǎn)AA基因型個(gè)體的鮮精活力、凍后活力和鮮精密度 顯著低于GG和AG(P< 0. 05)，GG基因型畸形率顯著低于A(yíng)A和AG(P< 0. 05)，GG基因型為 精液品質(zhì)優(yōu)良基因型。
[0056] 表1PRM2基因不同基因型的精液品質(zhì)的最小_乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的引物，其特征在于，引物具有如序列表SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的引物，其特征在于， 所述引物可以特異性擴(kuò)增出含PRM2基因的SEQ ID NO. 1所示序列。
3. -種用于早期篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有 權(quán)利要求1或2所述的用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的引物。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種用于早期篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液和限制性?xún)?nèi)切酶；所述PCR反應(yīng)液為T(mén)aq PCR MasterMix， 所述限制性?xún)?nèi)切酶為限制性?xún)?nèi)切酶PstI。
5. 如權(quán)利要求3所述的一種用于早期篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒為100頭牛檢測(cè)劑量，試劑盒的組成如下： 100. ii mol/L 的上游引物 20 ii L ; 100. ii mol/L 的下游引物 20 ii L ; 2XTaq PCR MasterMix lmL ； ddH20 1. 2mL ； 所述上游引物序列為序列表中SEQ ID NO. 2所不的喊基序列； 所述下游引物序列為序列表中SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種用于早期篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒中還包括PRM2基因中SNP位點(diǎn)g. 478A>G通過(guò)創(chuàng)造酶切位點(diǎn)法產(chǎn)生的限制 性?xún)?nèi)切酶PstI。
7. -種早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法，其特征在于，提取種公牛基因組DNA，測(cè) 定公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G，根據(jù)種公牛第478堿基的等位基因預(yù)測(cè)種公牛的精液 品質(zhì)：當(dāng)種公牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G為GG基因型時(shí)，種公牛精液品質(zhì)最好；當(dāng)種公 牛PRM2基因SNP位點(diǎn)g. 478A>G為AA基因型時(shí)，種公牛精液品質(zhì)最差。
8. 如權(quán)利要求7所述的早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的方法，其特征在于，確定種公 牛第478位堿基基因型的具體步驟為： (1) 提取種公?；蚪MDNA，DNA樣品被稀釋成50ng/ y L，備用； (2) 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性：g. 478A>G ; (3) 針對(duì)478堿基單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A/G，設(shè)計(jì)公牛PRM2基因特異性引物，進(jìn)行PCR反 應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列如序列表SEQ ID NO :1所示；所述的基因特異性引物具有如序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的序列，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為241bp ; (4) 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的PstI單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A/G的多態(tài)性：限制性?xún)?nèi)切核酸酶PstI酶 切所述擴(kuò)增產(chǎn)物，若得到216bp和25bp片段，其基因型為AA純合體；若得到241bp、216bp和 25bp三個(gè)酶切片段時(shí)，其基因型為AG雜合體；若得到241bp片段，其基因型為GG純合體。
9. 一種用于早期篩選優(yōu)良精液品質(zhì)種公牛的SNP位點(diǎn)，其特征在于，所述SNP位點(diǎn)為 g. 478A>G，位于公牛PRM2基因第478位堿基。
10. 權(quán)利要求9所述的SNP位點(diǎn)在制備篩選種公牛精液品質(zhì)優(yōu)劣的試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357579SQ201410748811
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】王長(zhǎng)法, 范利娟, 尹苗, 黃金明, 鞠志花, 王秀革, 孫艷, 姜強(qiáng), 楊春紅, 仲躋峰, 侯明海 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心