H3n8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括引物組和探針組；引物組有引物1至4，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的堿基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.3和6的堿基序列。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)敏感性高且特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)和鑒別H3亞型AIV和N8亞型AIV兩種病原體，并對(duì)其相應(yīng)病原含量進(jìn)行定量，可用于H3N8亞型AIV的快速診斷和監(jiān)測(cè)，因此本發(fā)明對(duì)H3N8亞型禽流感病毒的防治有重要意義。
【專利說(shuō)明】H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于PCR檢測(cè)病毒【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí) 時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian influenza, Al)是危害禽類養(yǎng)殖的一類重要傳染病，其病原 體AIV為單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，其中血凝素（Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase，NA)是兩個(gè)比較重要的基因節(jié)段，Susan等的研宄表明HA和NA基因之間 存在某種平衡對(duì)病毒的致病性有很大關(guān)系。H3是目前已知的人類流行的主要亞型之一，血 清學(xué)分析顯示，從馬等頻繁分離到的H3N8亞型早在18世紀(jì)的人類中間流行，同時(shí)馬可以通 過實(shí)驗(yàn)感染H3N8亞型AIV這一事實(shí)，說(shuō)明不應(yīng)低估H3N8亞型AIV在自然界中的作用，應(yīng)注 意防止馬、禽及人類H3亞型AIV的感染，對(duì)于H3N8亞型AIV的防控應(yīng)予以高度重視。目 前，針對(duì)AIV的檢測(cè)方法為傳統(tǒng)血清學(xué)試驗(yàn)，存在檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等 缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量，而且具有敏感、特異、準(zhǔn)確可靠、能實(shí)現(xiàn) 多重反應(yīng)和實(shí)時(shí)性好等特點(diǎn)。實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)樣品量非常大時(shí)，單重?zé)晒釶CR在成本和時(shí) 間方面就存在一定的劣勢(shì)，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來(lái)進(jìn)行批量快速檢 測(cè)。多重?zé)晒釶CR采用多對(duì)引物擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)模板，克服了單重?zé)晒釶CR的不足。但是， 建立多重?zé)晒釶CR方法比單重的要復(fù)雜得多，其對(duì)試劑和引物的要求更高，同時(shí)需要保證 不同探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光基團(tuán)間無(wú)相互干擾，使用的熒光定量PCR儀具有相應(yīng)的多個(gè)檢測(cè)通 道。目前，針對(duì)H3N8亞型AIV-步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種敏感性好、特異性高、準(zhǔn)確可靠、快速方便 的H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)并定量 H3N8亞型禽流感病毒，為H3N8亞型AIV的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí) 時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物組，包括兩對(duì)特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4,它們分 別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿基序列。
[0006] H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括引物組和探 針組；引物組有引物1至4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿 基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 3和6的堿基序列。
[0007] 探針A的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料ECLIPSE ;探 針B的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料R0X，3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料ECLIPSE。
[0008] 引物1、引物2、探針A、引物3、引物4和探針B的摩爾比為3 :3 :3 :2 :2 :2。
[0009] 該試劑盒含有以下試劑：
[0010] A液：PCR擴(kuò)增緩沖液、引物1、引物2、探針A、引物3、引物4、探針B ;
[0011] B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作為陽(yáng)性對(duì)照；
[0012] C液：ddH20,作為陰性對(duì)照。
[0013] A液中引物1、引物2、探針A終濃度均為0. 6 μ M，引物3、引物4、探針B終濃度均 為 0· 4 μΜ。
[0014] 針對(duì)目前缺乏對(duì)Η3Ν8亞型AIV進(jìn)行檢測(cè)和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人研宄篩 選了兩套特異性的探針和引物，并通過進(jìn)行不同濃度的配比，獲得最佳引物和探針的濃度 組合，據(jù)此建立了 Η3Ν8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法，并制備了 相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 1)檢測(cè)時(shí)間短
[0016] 應(yīng)用本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)一管二檢的目的，并且反轉(zhuǎn)錄和PCR -步完成，僅需約30分鐘， 并且反應(yīng)結(jié)果可以直接通過電腦觀察，而常規(guī)的RT-PCR方法起碼需要3. 5小時(shí)來(lái)完成擴(kuò)增 反應(yīng)，然后還得花2小時(shí)進(jìn)行凝膠電泳來(lái)觀察結(jié)果；
[0017] 2)檢測(cè)敏感性高且特異性強(qiáng)
[0018] 當(dāng)Η3亞型AIV和Ν8亞型AIV同時(shí)存在時(shí)，本發(fā)明對(duì)其檢測(cè)的CT值與單個(gè)病毒檢 測(cè)的CT值比較，結(jié)果基本一樣，并未影響對(duì)Η3亞型AIV和Ν8亞型AIV的檢出及檢出的敏 感性。另外，利用本發(fā)明還可對(duì)樣品中相應(yīng)病原含量進(jìn)行定量，并且檢測(cè)敏感性非常高，均 能檢測(cè)到100個(gè)拷貝的Η3Ν8亞型AIV，比常規(guī)PCR方法敏感性高100倍，可用于Η3Ν8亞型 AIV的快速診斷和監(jiān)測(cè)，因此本發(fā)明對(duì)Η3Ν8亞型禽流感病毒的防治有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是熒光定量PCR檢測(cè)Η3亞型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）結(jié)果圖，圖中： 1?7分別為I X IO8?I X 10 2拷貝/ μ 1，8陰性對(duì)照。
[0020] 圖2是熒光定量PCR檢測(cè)Η3亞型禽流感病毒的敏感性（FAM通道）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 圖3是熒光定量PCR檢測(cè)Ν8亞型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）結(jié)果圖，圖中： 1?7分別為I X IO8?I X 10 2拷貝/ μ 1，8陰性對(duì)照。
[0022] 圖4是熒光定量PCR檢測(cè)Ν8亞型禽流感病毒的敏感性（ROX通道）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023] 圖5是熒光定量PCR檢測(cè)Η3亞型禽流感病毒的特異性（FAM通道）結(jié)果圖，圖中： 1-12 分別為 Η3Ν8、HlNl、Η3Ν2、Η3Ν6、Η4Ν2、Η4Ν5、Η5Ν1、Η6Ν1、Η6Ν6、Η6Ν8、Η7Ν2、Η9Ν2 亞型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白對(duì)照。
[0024] 圖6是熒光定量PCR檢測(cè)N8亞型禽流感病毒的特異性（ROX通道）結(jié)果圖，圖中： 1-12 分別為 H3N8、HlNl、H3N2、H3N6、H4N2、H4N5、H5N1、H6N1、H6N6、H6N8、H7N2、H9N2 亞型 AIV ; 13. NDV ; 14. IBV ; 15. ILTV ; 16. MG ; 17. ARV ; 18.空白對(duì)照。
[0025] 圖7是熒光定量PCR檢測(cè)H3亞型禽流感病毒的批內(nèi)重復(fù)性（FAM通道）結(jié)果圖， 圖中：1-3為IXlO 8拷貝/yL;4.陰性對(duì)照。
[0026] 圖8是熒光定量PCR檢測(cè)N8亞型禽流感病毒的批內(nèi)重復(fù)性（ROX通道）結(jié)果圖， 圖中：1-3為IXlO 8拷貝/yL;4.陰性對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑 等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下：
[0028] LightcyCler2· 0熒光定量PCR儀（Roche)。膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 廣州東盛生物科技有限公司；pGEM-T Easy試劑盒購(gòu)自Promega公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 購(gòu)自 Fermengtas 公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit 購(gòu)自大連寶生物公司；DNA/RNA 抽提試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0029] H3N2、H6N8 亞型禽流感病毒記載在 "Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay"，Virol J, 2011，8:337,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0030] HlNl亞型禽流感病毒記載在"利用RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)Hl亞型禽流感 病毒及NI、N2亞型的分型"，病毒學(xué)報(bào)，2013, 29(2) : 154-159,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸 醫(yī)研宄所獲得；
[0031] H3N6亞型禽流感病毒記載在基因庫(kù)NCBI中，登錄號(hào)為"KM186122-KM186129"，公 眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0032] H3N8 亞型禽流感病毒記載在 "Genetic Characterization of a Natural Reassortant H3N8Avian Influenza Virus Isolated from Domestic Geese in Guangxi, Southern China"，Genome Announc. 2014, 2(4) :e00747_14,公眾可從廣西壯族自 治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0033] H4N2亞型禽流感病毒記載在基因庫(kù)NCBI中，登錄號(hào)為"KJ881013-KJ881020"，公 眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0034] H4N5、H5N1、H7N2亞型禽流感病毒記載在"H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)方法的建立"，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013, 34 (12) : 1-5,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī) 研宄所獲得；
[0035] H6N1 記載在"Complete genome sequence analysis of an H6Nlavian influenza virus isolated from Guangxi pockmark ducks"，J. Virol. 2012, 86:13868 - 13869,公眾 可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0036] H6N6亞型禽流感病毒和雞毒霉形體（MG) S6株記載在"Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from Po μ Ltry in Guangxi Province, Southern ChinaT3LOS ONE, 2013,8(10) :1_6,公眾可從廣西壯族自治區(qū) 獸醫(yī)研宄所獲得；
[0037] H9N2 禽流感病毒記載在 "Characterization of an avain influenza virus H9N2strain isolated from a wild bird in southern China. Genome Announc''， 2014, 2: e00600-14,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0038] 新城疫病毒（NDV F48E9株）記載在"新城疫病毒強(qiáng)弱毒株LAMP鑒別檢測(cè)方法的 建立"中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41 (09) : 917-922,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得；
[0039] 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV H52株）記載在"雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP可 視化檢測(cè)方法的建立"，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012, 28 (20) : 83-87,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī) 研宄所獲得；
[0040] 雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV北京株）記載在"雞傳染性喉氣管炎病毒LAMP檢測(cè) 方法的建立獸醫(yī)科技，2012, 44(11) :52-55,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研宄所獲得； [0041] 禽呼腸孤病毒（ARV S1733株）記載在"禽呼腸孤病毒S1733株單克隆抗體的制備 及夾心ELISA檢測(cè)方法的建立"，畜牧與獸醫(yī)，2013, 45(5)，49-52,公眾可從廣西壯族自治區(qū) 獸醫(yī)研宄所獲得。
[0042] 實(shí)施例1、引物與Taqman探針的設(shè)計(jì)與合成
[0043] 根據(jù)GenBank中H3亞型AIV和N8亞型AIV病毒的保守序列，米用Primer Express 3.0軟件，設(shè)計(jì)了多套探針和引物，通過分析其引物之間的二聚體，選定兩對(duì)特異性引物和 兩條Taqmam探針（表1)。
[0044] 表1引物和TaqMan探針序列（5' -3'）
[0045]

【權(quán)利要求】
1. H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物組，其特征在于包括兩 對(duì)特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿基序列。
2. -種H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于 包括引物組和探針組；引物組有引物1至4,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和2、SEQ. ID. No. 4和5的堿基序列；探針組有探針A和探針B，它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 3和 6的堿基序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試 劑盒，其特征在于：所述探針A的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料 ECLIPSE ;所述探針B的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料R0X，3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料ECLIPSE。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探針A、引物3、引物4和探針B的摩爾比為3 :3 :3 :2 : 2 ：2〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑： A液：PCR擴(kuò)增緩沖液、引物1、引物2、探針A、引物3、引物4、探針B ; B液：AIV-H3+AIV-N8模板，作為陽(yáng)性對(duì)照； C液：ddH20,作為陰性對(duì)照。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的H3N8亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑 盒，其特征在于：所述A液中引物1、引物2、探針A終濃度均為0.6 yM，引物3、引物4、探針 B終濃度均為0. 4yM。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104498627SQ201410734982
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】謝芝勛, 劉婷婷, 謝志勤, 鄧顯文, 羅思思, 劉加波, 謝麗基, 黃莉, 黃嬌玲, 曾婷婷, 王盛, 張艷芳 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所