一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明將UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶KfoA和軟骨素合成酶KfoC編碼基因整合于枯草芽孢桿菌基因組上完善了其代謝合成軟骨素途徑，同時，對枯草芽孢桿菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途徑的基因，進(jìn)行模塊化組裝表達(dá)分析，通過控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc濃度，分析了枯草芽孢桿菌產(chǎn)軟骨素合成途徑上的關(guān)鍵基因及節(jié)點。本發(fā)明為食品級微生物高效生產(chǎn)制備軟骨素奠定了一定的基礎(chǔ)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 軟骨素（chondroitin)為糖胺聚糖（GAG)的多糖家族。糖胺聚糖是一類由重復(fù) 的二糖單元組成的無支鏈的、帶負(fù)電荷的多糖鏈，由于其獨特的非柔性的性質(zhì)和高的負(fù)電 荷，GAG表現(xiàn)出高度延展的構(gòu)象，占用大量空間，吸收陽離子和水并在細(xì)胞外基質(zhì)中形成 多孔的凝膠，在大多數(shù)動物中被發(fā)現(xiàn)的GAG幫助水合和擴(kuò)展組織，并使基質(zhì)能夠承受壓力 (compressive force)。因此，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應(yīng)用潛力的化合物。軟骨 素一種構(gòu)為4-GlcA-i3-l，3-GalNAc-i3-UGlcUA:葡糖醛酸，GalNAc:乙酰半乳糖胺）二糖 單體以β-1,3鍵交替連接而成的聚多糖。硫酸軟骨素 （chondroitin sulfate, CS),是軟 骨素糖鏈生成后由磺基轉(zhuǎn)移酶在GalNAc的碳4位或碳6位進(jìn)行硫酸化。根據(jù)其化學(xué)組成 和結(jié)構(gòu)差異可分為A、B、C、D、E、F、H等多種，通常從哺乳動物組織中提取得到的硫酸軟骨素 以CS-A、CS-C為主。一般硫酸軟骨素約含有50-70個雙糖單位，分子量在10000-50000道 爾頓之間。
[0003] 硫酸軟骨素是一類重要的生物高分子，具有廣泛的生物活性，具有多種藥理作用 與生理功能。研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素具有抗動脈粥樣硬化作用，鎮(zhèn)痛抗炎作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞 增生，誘導(dǎo)新骨形成；抗腫瘤作用，免疫調(diào)節(jié)作用，抗氧化、清除自由基和廷緩衰老的作用， 還具有抗炎、抗病毒、抗過敏和加速傷口愈合的作用，如抗HIV活性。隨著對硫酸軟骨素生 理功能及生化性質(zhì)的深入研究，在歐、美、日等發(fā)達(dá)國家，硫酸軟骨素作為流行的保健品長 期應(yīng)，用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動脈機(jī)能不全、心肌缺血等疾病，無明顯的 毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率，也做為膳食補(bǔ)充用于保護(hù)關(guān)節(jié)。
[0004] 硫酸軟骨素主要存在于動物的軟骨組織中，硫酸軟骨素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是采用 酶法與堿法相結(jié)合等傳統(tǒng)的提取工藝，從氣管、鼻中隔、雞龍骨及鯊魚軟骨等動物軟組織中 提取硫酸軟骨素。傳統(tǒng)的提取方法造成軟骨素的收率低，成本較高，且堿解產(chǎn)生的大量工業(yè) 廢水易對環(huán)境產(chǎn)生較大影響。同時，原材料的短缺和下游純化工藝的復(fù)雜程度限制了該活 性成分的全球利用度，因此市場受限于不能滿足不斷增長的需求。而且，從長遠(yuǎn)來看，由于 不斷頒布對動物來源藥物的安全性日益嚴(yán)格的管理條例，動物組織提取獲得的硫酸軟骨素 可能將被限制在生藥市場之外。為此，采用安全有效的方法制備硫酸軟骨素已成為需要首 要解決的問題。這就迫切需求人們開始尋求新的替代途徑。
[0005] 根據(jù)軟骨素的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞合成代謝途徑，以微生物發(fā)酵合成軟骨素及其衍生物的 研究成為近幾年的研究熱點。通過培養(yǎng)微生物細(xì)胞而獲得大量的軟骨素是最具經(jīng)濟(jì)效益和 開發(fā)潛力的生產(chǎn)工藝。發(fā)酵法生產(chǎn)軟骨素的優(yōu)點體現(xiàn)在：1)不受原料限制，微生物培養(yǎng)成 本低，生產(chǎn)強(qiáng)度大；2)工藝條件溫和；3)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定安全；4)環(huán)境友好、無污染等。
[0006] 自然界中許多真菌和細(xì)菌等微生物均能合成低聚合度的軟骨素或其類似物，目前 研究發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)軟骨素的微生物主要集中在巴斯德桿菌Pasteurella multocida、大腸桿菌 Escherichia coli K4。但作為工業(yè)生產(chǎn)菌株需具備：1)人畜安全；2)能利用廉價的糖質(zhì)原 料；3)生長迅速，發(fā)酵周期短；4)遺傳背景清楚；5)能大量合成軟骨素或其類似物等條件。 由于上述菌株都存在一定的致病性及大腸桿菌產(chǎn)內(nèi)毒素及熱源物質(zhì)等，不能滿足現(xiàn)在的食 品醫(yī)療安全要求。
[0007] 本發(fā)明應(yīng)用食品安全級的枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素。本發(fā)明通過基因重組技 術(shù)，完善了枯草芽孢桿菌代謝合成軟骨素的途徑，并且對軟骨素的兩個前體物質(zhì)的合成途 徑進(jìn)行模塊化調(diào)控表達(dá)，進(jìn)而引起胞內(nèi)兩個前體物MF-Gal-NAc和UDP-GlcA濃度的變化， 最終引起軟骨素產(chǎn)量的變化該發(fā)明操作過程簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)制備軟骨 素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌中導(dǎo)入 UDP-N-乙酰氨基葡糖C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶，構(gòu)建枯草芽孢桿菌代謝合成軟骨素的途 徑。
[0009] 所述重組枯草芽孢桿菌，還可以以模塊化組裝調(diào)控方式，分別對胞內(nèi)軟骨素的兩 個前體物UDP-N-乙酰氨基葡糖（UDP-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途徑的 基因進(jìn)行調(diào)控，提高軟骨素產(chǎn)量。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述m)P-GlcNAc C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶，是來源 于大腸桿菌 K4(E. coli serotype 05:K4(L):H4，E. coli K4)的 KfoA 和 KfoC 基因。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述軟骨素合成酶的編碼基因是來源于巴斯德菌F 型（Pasteurella type F)的 pmCS。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶，是來源 于大腸桿菌 K4(E. coli serotype 05:K4 (L):H4，E. coli K4)的 KfoA 和 KfoC 基因，KfoA 的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，KfoC的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述UDP-N-GlcNAc的合成途徑包括編碼UDP-N-乙 酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU，編碼磷酸葡萄糖變位酶的基因 glmM ;所述UDP-GlcUA 的合成途徑包括編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD，編碼尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶 的基因 gtaB。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，表達(dá)兩個前體物UDP-N-乙酰氨基葡糖和UDP-葡糖 醛酸的合成途徑基因以調(diào)控軟骨素的合成，包括表達(dá)基因 glmU，或glmU及glmM，或tuaD，或 tuaD 及 gtaB。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶的gtaB、 編碼Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD、編碼磷酸葡萄糖變位酶的基因 glmM和UDP-N-乙酰氨 基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU可以來源于巴斯德菌屬（Pasteurella type F)、大腸桿菌 (Escherichia coli)或芽抱桿菌（Bacillus) 〇
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼上述所述途徑酶的基因來源于枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)，編碼所述UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD、尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷 酸化酶的基因 gtaB、磷酸葡萄糖變位酶的基因 glmM和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的 基因 glmU的核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 3-6所示。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶的基因 重組整合在基因組上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，啟動子為木糖誘導(dǎo)型啟動子Pxly。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以表達(dá)載體PP43NMK表達(dá)UDP-N-乙酰氨基葡糖 (UDP-N-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸（UDP-GlcUA)合成途徑的基因，啟動子為組成型強(qiáng)啟動子 P43。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述重組枯草芽孢桿菌的方法，是以表達(dá)載體PP43NMK 重組表達(dá)m)P-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸合成途徑的基因，并在枯草芽孢桿菌基因 組上整合表達(dá)編碼m)P-GlcNAc C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶的基因。
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以PP43NMK為表達(dá)載體表達(dá)glmU，或glmU和glmM ; KfoA和KfoC整合在枯草芽孢桿菌基因組上串聯(lián)表達(dá)，啟動子為木糖誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子Pxyl。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以pP43NMK為表達(dá)載體表達(dá)tuaD，或tuaD和gtaB， KfoA和KfoC整合在枯草芽孢桿菌基因組上串聯(lián)表達(dá)，啟動子為木糖誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子Pxyl。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)軟骨素的方法，培養(yǎng)基： 酵母粉20g/L，蔗糖或葡萄糖50g/L，磷酸二氫鈉15. 6g/L，；硫酸鉀3. 9g/L。在37°C下，發(fā) 酵48h獲得平均分子量在20-40kDa左右的軟骨素。
[0024] 在本發(fā)明的一種實施方式中，碳源采用蔗糖。
[0025] 本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)軟骨素，與其他菌相比，該發(fā)明具有非常大的應(yīng)用優(yōu) 勢。首先，本發(fā)明過程中使用的宿主為食品級，完全滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要求，無內(nèi) 毒素和病原感染的風(fēng)險，不會對產(chǎn)物的醫(yī)用食品安全帶來隱患；其次，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成 本簡單，生產(chǎn)強(qiáng)度大，同時通過分別調(diào)控合成途徑的兩個前體物m)P-GlcNAc和UDP-GlcUA 濃度的變化，可以獲得產(chǎn)量不同的生產(chǎn)菌株?；趹?yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備 特定分子量范圍的軟骨素具有潛在而非常廣泛的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1所示為模塊化重組UDP-GlcNAc和UDP-GlcA合成途徑基因順序示意圖。
[0027] 圖2所示為含有不同組合基因重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌對軟骨素的產(chǎn)量影響： I, ZHchol68 ；2, ZHcho 168/pP43NMK/tuaD ；3, ZHcho 168/pP43NMK/tuaD-gtaB ；4, ZHchol68/ pP43NMK/glmU ;5, ZHchol68/pP43NMK/glmU-glmM。

【具體實施方式】
[0028] 序列表所示為本發(fā)明所述核苷酸序列信息：
[0029] (I)SEQ ID NO. 1 序列信息為來源于大腸桿菌 K4(E. coli 05:K4(L) :H4, E. coli K4)的UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶編碼基因 KfoA編碼序列；
[0030] (2)SEQ ID NO. 2 序列信息為來源于大腸桿菌 K4(E. coli 05:K4(L) :H4, E. coli K4)的軟骨素合成酶編碼基因 KfoC編碼序列；
[0031] (3) SEQ ID NO. 3序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶基因 tuaD編 碼序列；
[0032] (4) SEQ ID NO. 4序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因 gtaB編碼序列；
[0033] (5) SEQ ID NO. 5序列信息為枯草芽孢桿菌來源的變位酶的基因 glmM的編碼序 列；
[0034] (6) SEQ ID NO. 6序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化 酶的基因 glmU的編碼序列；
[0035] (7) SEQ ID NO. 7序列信息為枯草芽孢桿菌組成型啟動子P43的基因序列；
[0036] (8) SEQ ID NO. 8序列信息為枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型啟動子Pxyl的基因序列。
[0037] 實施例1整合重組質(zhì)粒pAXOI-KfoC-KfoA構(gòu)建
[0038] 本實施例所用的UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶KfoA和軟骨素合成酶KfoC，來源于大腸桿 菌K4(E.coli serotype 05:K4(L):H4，E.coli K4)，E.coliK4 菌株接種于 5ml LB 液體培養(yǎng) 基，在37°C 200rpm培養(yǎng)16h。收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取E. coliK4菌株的 基因組DNA。
[0039] 根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計引物Kf〇A-F/R、Kf〇C-F/R，以提取的基因 組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取KfoC和KfoA基因。
[0040] 引物序列信息：5' -3'方向
[0041] KfoC-F:CGGGATCCATGAGTATTCTTAATCAAGC
[0042] KfoC-R:TCCCCGCGGACTTCGGGTACCTTATAAATCATTCTCTATTTTTTCC
[0043] KfoA-F:CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAATATATTAGTTACAGGTGG
[0044] KfoA-R:TCCCCGCGGTTAAATATAACCATTTGGGTTTTTC
[0045] 在KfoC上下游引物兩端分別引入BamHI和KpnI、SacII限制性酶切位點。PCR 擴(kuò)增獲取的KfoC片段和質(zhì)粒pAXOl分別采用BamHI和SacII進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖凝 膠核酸電泳進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系Ι0μ 1:1 μ 1雙切的載體，4μ 1雙切的 目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR 驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，比對正確，重組質(zhì)粒PAXOl-KfoC構(gòu)建成功。在KfoA引物上下 游引入KpnI和SacII限制性酶切位點，PCR擴(kuò)增獲得KfoA后，與pAXOl-KfoC質(zhì)粒分別進(jìn) 行KpnI和SacII雙酶切，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體 系10 μ 1 :1 μ 1雙切的載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過夜， 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，比對正確，重組質(zhì)粒 pAXOI-KfoC-KfoA 構(gòu)建成功。
[0046] 重組質(zhì)粒 pAXOl-KfoC-KfoA 轉(zhuǎn)化 Bacillus subtilis 168，以 20 μ g/ml 的紅 霉素平板進(jìn)行篩選整合重組子，并對重組菌株進(jìn)行PCR驗證和測序驗證，對成功整合 Pxyl-KfoC-KfoA構(gòu)建成功的枯草芽孢桿菌菌株命名為ZHcho 168。
[0047] 實施例 2 重組質(zhì)粒 pP43NMK/tuaD，pP43NMK/tuaD_gtaB 的構(gòu)建
[0048] Bacillus subtilis 168 菌株接種于 5ml LB 培養(yǎng)基，37°C，200rpm 培養(yǎng) 16h。收集 菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取獸疫鏈球菌株的基因組DNA。根據(jù)已公布的Bacillus subtilisl68基因組信息序列，分別設(shè)計引物tuaD-F/tuaD-R、gtaB-F/gtaB-R。在上游引 物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位點和P43RBS序列，在下游引物tuaD-R的5端引 入XhoI和SacI限制性酶切位點；在上游引物gtaB-F的5端引入SacI限制性酶切位點和 P43RBS序列，在下游引物gtaB-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點。
[0049] 引物信息如下：
[0050] tuaD-F ： CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG
[0051] tuaD-R ： CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG
[0052] gtaB-F ：
[0053] CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAGTACGTAAAGC
[0054] gtaB-R :CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAACC 以提取的 枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，分別擴(kuò)增獲取tuaD、 gtaB基因。
[0055] 質(zhì)粒pP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時PCR擴(kuò)增獲得的tuaD基因產(chǎn)物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物進(jìn)行 連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ ISolution連接酶，16°C連 接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，比對正確， pP43NMK/tuaD質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0056] 同理，按上述操作將重組質(zhì)粒pP43NMK/tuaD進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切，gtaB片段 PCR產(chǎn)物也進(jìn)行SacI和XhoI雙酶切?；厥盏膬蓚€片段進(jìn)行連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切的 載體，4 μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，結(jié)果比對正確，pP43NMK/tuaD-gtaB質(zhì)粒構(gòu) 建成功。上述構(gòu)建的2個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化ZHCH0168宿主，獲得2個重組枯草芽孢桿菌菌 株：ZHCHO168/pP43NMK/tuaD ;ZHCHO 168/pP43NMK/tuaD-gtaB。
[0057] 實施例 3 重組質(zhì)粒 pP43NMK/glmU，pP43NMK/glmU-glmM 的構(gòu)建
[0058] 根據(jù)已公布的Bacillus subtilis 168基因組信息序列，分別設(shè)計引物glmU-F/ glmU-R、glmM-F/glmM-R。在上游引物glmU-F的5端引入KpnI限制性酶切位點和P43RBS序 列，在下游引物glmU-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點，后續(xù)幾個基因均采用SpeI 和XbaI同尾酶進(jìn)行連接；在上游引物glmM-F的5端引入SpeI限制性酶切位點和P43RBS 序列，在下游引物glmM-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位點。
[0059] 引物信息如下：
[0060] glmU-F ：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG
[0061] glmU-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC
[0062] glmM-F ：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGG
[0063] glmM-R ：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGACCGGAC
[0064] 以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，分別 擴(kuò)增獲取glmU、glmM基因。
[0065] 質(zhì)粒PP43NMK采用KpnI和XhoI雙酶切，同時PCR擴(kuò)增獲得的glmU基因產(chǎn)物也 采用KpnI和XhoI雙酶切，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，回收產(chǎn)物進(jìn)行 連接，體系1〇μ 1 :1μ 1雙切的載體，4μ 1雙切的目的片段，5μ ISolution連接酶，16°C連 接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，比對正確， pP43NMK/glmU質(zhì)粒構(gòu)建成功。在pP43NMK/glmU質(zhì)?；A(chǔ)上，按上述操作分別進(jìn)行g(shù)lmM、 glmS和pgi基因的組裝：pP43NMK/glmU質(zhì)粒采用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切，而glmM片段的 PCR產(chǎn)物采用SpeI和XhoI雙酶切，此步采用一對同尾酶進(jìn)行連接，體系10 μ 1 :1 μ 1雙切 的載體，4μ 1雙切的目的片段，5 μ I Solution連接酶，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單菌落PCR驗證，陽性重組子進(jìn)行測序，結(jié)果比對正確，pP43NMK/glmU-glmM質(zhì)粒構(gòu) 建成功。
[0066] 上述所有質(zhì)粒進(jìn)行測序比對，結(jié)果正確。分別轉(zhuǎn)化ZHCH0168菌株，獲得2個重組 枯草芽孢桿菌菌株：ZHCH0168/pP43NMK/glmU，ZHCH0168/pP43NMK/glmU-glmM。
[0067] 實施例4重組枯草芽孢桿菌菌株的搖瓶發(fā)酵
[0068] 挑取上述構(gòu)建的 5 個重組菌株：ZHCH0168、ZHCH0168/pP43NMK/tuaD、ZHCH0168/ pP43NMK/tuaD-gtaB、ZHCH0168/pP43NMK/glmU、ZHCH0168/pP43NMK/glmU-glmM，單克隆接 種于5ml LB培養(yǎng)基，置于200rpm 37°C過夜培養(yǎng)。16h后接種于250ml三角搖瓶（裝液量 25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為無機(jī)鹽培養(yǎng)基：2%酵母粉，5%蔗糖，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫酸鉀 3.9g/L。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于搖瓶，置于200rpm 37°C培養(yǎng)，在接種后第2h添加2g/L的 木糖進(jìn)行誘導(dǎo)KfoA和KfoC基因表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)48h。
[0069] 發(fā)酵液中軟骨素的收集，取適量發(fā)酵液，加入0. 5 %終濃度的SDS與發(fā)酵液成分混 合，釋放細(xì)胞膜表面的軟骨素多糖，隨后5000rpm下室溫離心20min。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另 一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的軟骨素多糖。室溫下靜置 Ih,再IOOOOrpm下室溫離心20min，去除干凈液體，沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液 充分溶解，適當(dāng)稀釋后，采用濁度法測定軟骨素的含量，利用硫酸軟骨素與氯化十六烷基吡 啶結(jié)合生成穩(wěn)定乳濁液，在波長680nm處測定硫酸軟骨素在一定濃度方位內(nèi)具有良好的線 性關(guān)系。
[0070] 從附圖2看出，表達(dá)UDP-GlcNAc途徑的合成從基因，軟骨素的產(chǎn)量逐漸提高，說明 提高UDP-GlcNAc的濃度有助于軟骨素的合成，重組菌株ZHCH0168/pP43NMK/glmU-glmM的 產(chǎn)量最高，達(dá)到I. 55g/L。而表達(dá)UDP-GlcA合成途徑的tuaD基因（即重組菌株ZHCH0168/ pP43NMK/tuaD)，軟骨素的產(chǎn)量達(dá)到I. 76g/L。
[0071] 同時，通過對軟骨素產(chǎn)物的平均分子量測定結(jié)果顯示，獲得的產(chǎn)物平均分子量在 30kDa左右。
[0072] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)軟骨素的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，是在枯草芽孢桿菌中表達(dá) UDP-N-乙酰氨基葡糖C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶，構(gòu)建枯草芽孢桿菌代謝合成軟骨素的途 徑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為 Bacillus subtilis 168。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述UDP-GlcNAc C4異構(gòu) 酶和軟骨素合成酶是來源于大腸桿菌K4的KfoA和KfoC基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，編碼UDP-GlcNAc C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶的基因重組整合在基因組上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，啟動子為木糖誘導(dǎo)型 啟動子Pxly。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，還分別表達(dá)了 UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸的合成途徑的基因，調(diào)控軟骨素的合成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述UDP-N-乙酰氨基 葡糖的合成途徑包括編碼M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，編碼變位酶的基 因glmM ;所述UDP-葡糖醛酸的合成途徑包括編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD，編碼 M)P-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB;上述基因來源于巴斯德菌屬（Pasteurella type D)、 大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌（Bacillus)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述分別表達(dá)了 UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸的合成途徑的基因，包括以pP43NMK為表達(dá)載體表達(dá) 基因 glmU，或 glmU 及 glmM,或 tuaD，或 tuaD 及 gtaB。
8. 權(quán)利要求1所述重組枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)軟骨素和硫酸軟骨素中的應(yīng)用方法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌是以pP43NMK為表 達(dá)載體表達(dá)編碼M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU及編碼變位酶的基 因glmM ;并在基因組上以木糖誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子Pxyl整合串聯(lián)表達(dá)編碼UDP-N-乙酰氨基葡 糖C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶的基因。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌是以pP43NMK為 表達(dá)載體表達(dá)編碼M)P-葡萄糖脫氫酶的基因tuaD，或tuaD及編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 的基因gtaB，并在基因組上以木糖誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子Pxyl整合串聯(lián)表達(dá)編碼UDP-N-乙酰氨 基葡糖C4異構(gòu)酶和軟骨素合成酶的基因。
【文檔編號】C12R1/125GK104388372SQ201410734915
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】康振, 陳堅, 堵國成, 金鵬, 張琳培 申請人:江南大學(xué)