一種重組菌株及其全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組菌株及其全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的方法，其特征是利用重組菌株全細胞作為生物催化劑催化4-羥基肉桂酸制備4-羥基肉桂醛，包括以下步驟：（1）構(gòu)建重組菌株 E.coli M15/pQE31-4CL1-CCR；（2）制備重組菌株全細胞；（3）利用上述重組菌株全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛，得到的產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。本發(fā)明首次提出了用生物轉(zhuǎn)化的方法合成4-羥基肉桂醛的途徑，具有反應(yīng)條件溫和，酶活性高，節(jié)約成本，操作簡便等優(yōu)點，提供了一種新的合成4-羥基肉桂醛的方法，同時也為植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了一種新思路。
【專利說明】一種重組菌株及其全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001〕 本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化方法制備植物次生代謝產(chǎn)物。

【背景技術(shù)】
[0002]4-羥基肉桂醛是木質(zhì)素生物合成及降解過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，包括香豆醛、咖啡醛、松柏醛和芥子醛。4-羥基肉桂醛是農(nóng)業(yè)化學、植物科學以及生物能源領(lǐng)域的研究熱點之一。這類芳香族聚合物阻止了木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液態(tài)燃料，因此是生物燃料生產(chǎn)、反芻動物對纖維素的消化利用和制漿造紙等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)濟利用木質(zhì)纖維素的最大障礙之一。4-羥基肉桂醛不僅是木質(zhì)素單體生物合成的關(guān)鍵中間體，也是木質(zhì)素人工合成及天然合成過程中的重要代謝產(chǎn)物。有趣的是，缺乏肉桂醛脫氫酶的植物比正常植物催化4-羥基肉桂醛還原為單體的能力提高了 50%。4-羥基肉桂醛同時也是多種植物次生代謝物生物合成的假設(shè)中間體，其中包括一些重要的植物代謝調(diào)控物以及許多生物醫(yī)學研究的熱點。另外，4-羥基肉桂醛是4-羥基肉桂醇及其衍生物的重要合成前體，包括木質(zhì)化的潛在單體替代物。
[0003]4-羥基肉桂醛的研究對于探究與其相關(guān)的生物合成和加工過程十分必要，是調(diào)控木質(zhì)化過程和開發(fā)可用于液態(tài)生物燃料發(fā)電的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)至關(guān)重要的一步。盡管松柏醛和芥子醛可以在市面上買到，香豆醛和咖啡醛目前尚未作為商品供應(yīng)。目前合成4-羥基肉桂醛的方法包括利用4-乙?；郊兹┑木S蒂希反應(yīng)、肉桂酸氯化物和混合酸酐的還原反應(yīng)、以及苯丙烯醇的氧化反應(yīng)等化學方法合成。但利用化學合成法生產(chǎn)制備4-羥基肉桂醛存在操作步驟繁瑣、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多和難于純化等問題。
[0004]生物轉(zhuǎn)化是利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學轉(zhuǎn)化的過程，其本質(zhì)是利用微生物細胞內(nèi)的酶進行催化。細胞內(nèi)完整的多酶體系可以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應(yīng)，彌補了酶法催化中級聯(lián)催化過程不易實現(xiàn)的不足，同時又省去了繁雜的酶的分離純化過程。大腸桿菌是生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的良好系統(tǒng)，包括通過苯丙烷途徑生產(chǎn)植物化學物質(zhì)。但是，尚沒有利用重組雙功能酶菌株催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的報道。構(gòu)建重組菌株的基因來自741毛白楊，該雙功能酶基因編碼4-香豆酸:輔酶八連接酶(411)和肉桂酰輔酶八還原酶⑴⑶)，催化4-羥基肉桂酸還原為4-羥基肉桂醛。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有4-羥基肉桂醛制備工藝上的不足，目的在于提供一種4-羥基肉桂醛的方法。該種全細胞酶制劑制備方法簡單，不涉及到酶的分離純化。這種全細胞酶制劑具有轉(zhuǎn)化效率高，性能穩(wěn)定的特點。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
一種重組菌株及其全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的方法，特征是在于以重組菌株全細胞為生物催化劑，并在該全細胞體系中添加底物4-羥基肉桂酸，實現(xiàn)細胞內(nèi)催化反應(yīng)制備4-羥基肉桂醛； 所用的底物4-羥基肉桂酸選用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，濃度為1！111 ；
(1)重組菌的構(gòu)建
提取基因組的毛白楊為741毛白楊。
[0007]為了獲得411-(:(?的完整序列，我們以4-香豆酸:輔酶4連接酶(411)和肉桂酰輔酶八還原酶((1?)的全長⑶嫩質(zhì)粒載體作為擴增反應(yīng)模板。利用引物2和引物3的重疊區(qū)域進行多重實驗，以及含有3迪I限制性酶切位點(下劃線)的引物1和含有恥！1 I限制性酶切位點(下劃線)的引物4進行反應(yīng)擴增雙功能酶基因片段:
弓 |奪勿 1:5，^ ,
弓 |奪勿 2:5’ -^,0,^^0,^,00,^0^0,00^00,^0,^,33003003003003^33003003003003^30,000,000,000,
弓 1.3:5’ ~81:^00^^1:1:^81:^01:1:081:080^ ,
弓 |奪勿 4:5’ -^^2^8001:1:81:1:^881:01:1:0808^801:01:1:0-3 ^ ,
利用產(chǎn)物與？1018-1載體相連，獲得重組91018-14(^1-(:0^ ？0？擴增的保真度通過0嫩測序分析。擴增產(chǎn)物利用3]^ I和I進行酶切，然后插入空載體]3證31的同一位點上，構(gòu)建重組質(zhì)粒？職31-411-(1?(見圖1),轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌株￡.0011 115/1)0231-4011-00^.該重組菌株具有催化4-羥基肉桂酸還原為4-羥基肉桂醛的能力。
[0008]所述雙功能酶的核苷酸序列為序列表中所示。
[0009](2)重組菌株全細胞的制備
18固體培養(yǎng)基，以8/1計，胰蛋白胨10，酵母提取物5，5，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；18液體培養(yǎng)基，以8凡計，胰蛋白胨10，酵母提取物10，瓊脂粉15，邱7.5，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；
將含有雙功能酶基因的重組菌株？職31-411- 001？的大腸桿菌115接種于⑶固體培養(yǎng)基，活化；挑取重組菌株單菌落接種于51111含100 11 氨芐青霉素和25 ^ 卡那霉素的[8液體培養(yǎng)基中，于37° (^20011)111振蕩培養(yǎng)過夜；取1此培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50此含100^邑/0[氨芐青霉素和25^ 8/此卡那霉素的⑶液體培養(yǎng)基中，于37° 120011)111振蕩培養(yǎng)至控制00600為0.6 ；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-盡-0-硫代半乳糖苷1？%至終濃度0.4^01/[，于28。(^20011)111誘導(dǎo)培養(yǎng)8匕。
[0010](3)重組菌株全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛
501111反應(yīng)體系組成:50此含重組菌株全細胞的18液體培養(yǎng)基，終濃度為1禮的底物4-羥基肉桂酸；反應(yīng)混合物于37° (^20011)0避光振蕩反應(yīng)2-321反應(yīng)后混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用于產(chǎn)物分析。
[0011]產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析。反相高效液相色譜柱為20即八X30038-018^(2.1^ 150 臟，3.5 9111；義打七已0八，113八)，流動相為乙臆，流速0.10-0.15此/111111，檢測波長為325鹽。質(zhì)譜為配備￡31源的離子阱質(zhì)譜([⑶020^X？嫩父)。
[0012]產(chǎn)物產(chǎn)率的計算:產(chǎn)率(％) =6/6X 100%
式中6為反應(yīng)后4-羥基肉桂醛的濃度，6為反應(yīng)前底物的濃度。
[0013]香豆醛、咖啡醛、松柏醛的產(chǎn)率分別為34%，11%，19%。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點: (1)采用重組0嫩技術(shù)所構(gòu)建的4(^11-001？酶分子，保留了 4011酶分子和(1?酶分子各自的酶活性，因此只需要一個重組雙功能酶4(:11-(1?菌株就可以催化酚酸類(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸)生成相應(yīng)的4-羥基肉桂醛(香豆醛、咖啡醛、松柏醛),解除了細胞膜對中間產(chǎn)物(羥基肉桂酸—衍生物)進出細胞的阻礙。
[0015](2)本發(fā)明制作方法簡單，與純酶反應(yīng)體系相比，該全細胞催化體系不需要額外添加輔酶八、八I？以及^大大減化了反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，節(jié)約了成本，同時不涉及到酶繁雜分離純化的過程，簡化了設(shè)備的投資。
[0016](3)重組大腸桿菌所需要的營養(yǎng)低，易培養(yǎng)，易操作，制備工藝簡單，細胞體相當于酶的天然保護層，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步驟。
[0017](4)與化學合成法相比，簡化了 4-羥基肉桂醛的生產(chǎn)工藝，直接將底物投入到重組大腸桿菌全細胞培養(yǎng)液中，大大減少了副產(chǎn)物的生成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為重組表達載體圖譜。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例1中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)香豆醛的高效液相色譜圖以及質(zhì)譜圖。八:反應(yīng)初始時刻，底物香豆酸(31)和內(nèi)標芥子醛(13)的高效液相色譜圖；8:反應(yīng)一段時間后，底物香豆酸(31),產(chǎn)物香豆醛$1)和內(nèi)標芥子醛(13)的高效液相色譜圖 ?:香豆酸(31)的二級質(zhì)譜圖；0:香豆醛(91)的二級質(zhì)譜圖。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例2中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)咖啡醛的高效液相色譜圖以及質(zhì)譜圖。八:反應(yīng)初始時刻，底物咖啡酸(31)和內(nèi)標芥子醛(13)的高效液相色譜圖；8:反應(yīng)一段時間后，底物咖啡酸(31)，產(chǎn)物咖啡醛(？ 1)和內(nèi)標芥子醛(13 )的高效液相色譜圖 ?:咖啡酸(31)的二級質(zhì)譜圖；0:咖啡醛(91)的二級質(zhì)譜圖。
[0021]圖4為本發(fā)明實施例3中利用重組菌株全細胞催化生產(chǎn)松柏醛的高效液相色譜圖以及質(zhì)譜圖。八:反應(yīng)初始時刻，底物阿魏酸(31)和內(nèi)標芥子醛(13)的高效液相色譜圖；8:反應(yīng)一段時間后，底物阿魏酸(31),產(chǎn)物松柏醛$1)和內(nèi)標芥子醛(13)的高效液相色譜圖?的二級質(zhì)譜圖；0:松柏醛(91)的二級質(zhì)譜圖。

【具體實施方式】
[0022]下述下面結(jié)合實施例，進一步闡述對本發(fā)明:
實施例1
(1)挑取重組菌株X115/1)0231-4011-(1?單菌落接種于5此18液體培養(yǎng)基中，于37。120011)111振蕩培養(yǎng)過夜；以體積比為2:100的比例，將所得的菌液轉(zhuǎn)接于50此[8液體培養(yǎng)基中，于37° 120011)111振蕩至控制00600為0.6 ；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-0 -0-硫代半乳糖苷1？%至終濃度0.411111101/1,于28。誘導(dǎo)培養(yǎng)8卜；所述[8液體培養(yǎng)基的配方為:以8/1計，胰蛋白胨10，酵母提取物55，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；攬祥溶解均勾后滅囷，冷卻后備用；
(2)將濃度為1禮的底物香豆酸直接投入50此上述液體培養(yǎng)物中，于37。
避光振蕩反應(yīng)411 ；
(3)反應(yīng)完成后，于4°150^10011^離心棄菌體，收集反應(yīng)液；反應(yīng)混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用于產(chǎn)物分析。產(chǎn)物利用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測，如圖2所示，香豆酸、香豆醛和內(nèi)標芥子醛的出峰時間分別為27.16111111,37.32111111和47.531111110
[0023]實施例2
(1)挑取重組菌株X115/1)0231-4011-(1?單菌落接種于5此18液體培養(yǎng)基中，于37。120011)111振蕩培養(yǎng)過夜；以體積比為2:100的比例，將所得的菌液轉(zhuǎn)接于50此[8液體培養(yǎng)基中，于37° 120011)111振蕩至控制00600為0.6 ；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-0 -0-硫代半乳糖苷1？%至終濃度0.411111101/1,于28。誘導(dǎo)培養(yǎng)8卜；所述[8液體培養(yǎng)基的配方為:以8/1計，胰蛋白胨10，酵母提取物55，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；攬祥溶解均勾后滅囷，冷卻后備用；
(2)將濃度為1禮的底物咖啡酸直接投入50此上述液體培養(yǎng)物中，于37。
避光振蕩反應(yīng)811 ；
(3)反應(yīng)完成后，于4°150^10011^離心棄菌體，收集反應(yīng)液；反應(yīng)混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用于產(chǎn)物分析。產(chǎn)物利用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測，如圖3所示，咖啡酸、咖啡醛和內(nèi)標芥子醛的出峰時間分別為12.41111111,23.42111111和47.531111110
[0024]實施例3
(1)挑取重組菌株X115/1)0231-4011-(1?單菌落接種于5此18液體培養(yǎng)基中，于37。120011)111振蕩培養(yǎng)過夜；以體積比為2:100的比例，將所得的菌液轉(zhuǎn)接于50此[8液體培養(yǎng)基中，于37° 120011)111振蕩至控制00600為0.6 ；向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-0 -0-硫代半乳糖苷1？%至終濃度0.411111101/1,于28。誘導(dǎo)培養(yǎng)8卜；所述[8液體培養(yǎng)基的配方為:以8/1計，胰蛋白胨10，酵母提取物55，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；攬祥溶解均勾后滅囷，冷卻后備用；
(2)將濃度為1禮的底物阿魏酸直接投入50此上述液體培養(yǎng)物中，于37。
避光振蕩反應(yīng)32匕；
(3)反應(yīng)完成后，于4°150^10011^離心棄菌體，收集反應(yīng)液；反應(yīng)混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用于產(chǎn)物分析。產(chǎn)物利用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測，如圖4所示，阿魏酸、松柏醒和內(nèi)標芥子醒的出峰時間分別為34.28111111^44.69111111和47.531111110
【權(quán)利要求】
1.一種重組菌株及其全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛的方法，其特征是在于以重組菌株全細胞為生物催化劑，并在該全細胞體系中添加底物4-羥基肉桂酸，實現(xiàn)細胞內(nèi)催化反應(yīng)制備4-羥基肉桂醛； 所用的底物4-羥基肉桂酸選用香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，濃度為ImM ； 重組菌的構(gòu)建 提取基因組的毛白楊為741毛白楊； 為了獲得4CL1-CCR的完整序列，我們以4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL1)和肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)的全長cDNA質(zhì)粒載體作為PCR擴增反應(yīng)模板；利用引物2和引物3的重疊區(qū)域進行多重PCR實驗，以及含有Sph I限制性酶切位點(下劃線)的引物I和含有Kpn I限制性酶切位點(下劃線)的引物4進行PCR反應(yīng)擴增雙功能酶基因片段:
弓I物 1:5，-ggcatgcatgaatccacaagaagaattc-3，,
弓I物 2 -gatgaagcatcaaccggcatagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccaffaaccaccaccacctatgcctgccaacttttctttcag^3,,
弓L 3:5’ -atgccggttgatgcttcatcac tttcag-V ,
弓I物 4:5’ -gggtaccttattgaatcttcacagactcttc-3，, 循環(huán)利用PCR產(chǎn)物與PMD18-T載體相連，獲得重組PMD18-T4CL1-CCR ；PCR擴增的保真度通過DNA測序分析；擴增產(chǎn)物利用Sph I和Kpn I進行酶切，然后插入空載體pQE31的同一位點上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PQE31-4CL1-CCR，轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌株E.colM15/PQE31-4CL1-CCR ;該重組菌株具有催化4-羥基肉桂酸還原為4-羥基肉桂醛的能力； 所述雙功能酶的核苷酸序列為序列表中所示； 重組菌株全細胞的制備 LB固體培養(yǎng)基，以g/L計，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaC110，pH7.5，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ；LB液體培養(yǎng)基，以g/L計，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂粉15，PH7.5，氨芐青霉素0.1，卡那霉素0.025 ； 將含有雙功能酶基因的重組菌株P(guān)QE31-4CL1-CCR的大腸桿菌M15接種于LB固體培養(yǎng)基，活化；挑取重組菌株單菌落接種于5mL含100 μ g/mL氨芐青霉素和25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取ImL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含100 μ g/mL氨芐青霉素和25μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37° C、200rpm振蕩培養(yǎng)至控制0D600為0.6 ;向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-β -D-硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0.4mmol/L,于 28。C、200rpm 誘導(dǎo)培養(yǎng) 8h ； 重組菌株全細胞催化生產(chǎn)4-羥基肉桂醛由50mL反應(yīng)體系組成:50mL含重組菌株全細胞的LB液體培養(yǎng)基，終濃度為ImM的底物4-羥基肉桂酸；反應(yīng)混合物于37° C、200rpm避光振蕩反應(yīng)2-32h，反應(yīng)后混合物用等體積乙酸乙酯萃取，有機相用于產(chǎn)物分析； 產(chǎn)物通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析；反相高效液相色譜柱為ZORBAX300SB-C18 柱(2.1 X 150 mm, 3.5 μ m; Agilent, Santa Clara, CA, USA),流動相為乙臆，流速0.10-0.15 mL/min，檢測波長為325 nm ;質(zhì)譜為配備ESI源的離子阱質(zhì)譜(LCQ DECAXP MAX)ο
【文檔編號】C12P7/24GK104498540SQ201410721268
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】蓋穎, 劉淑欣, 侯佳音, 陸海, 蔣湘寧 申請人:北京林業(yè)大學, 蓋穎, 劉淑欣