一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法，包括以下步驟：（1）植物細(xì)胞原生質(zhì)體的提取；（2）植物細(xì)胞原生質(zhì)體中液泡的提??；（3）原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定：在光鏡下檢測(cè)上述液泡中葉綠素的含量和細(xì)胞色素c氧化酶的活性，以確定提取液泡的純度，并且測(cè)定提取液泡中硝態(tài)氮的含量，最后分別測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中酸性磷酸酶的活性，并將原生質(zhì)體和液泡中硝態(tài)氮的含量用酸性磷酸酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)計(jì)算得到原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量。本方法可以準(zhǔn)確測(cè)定出原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量；提取完好原生質(zhì)體的效率在90%以上；完好液泡的提取效率在95%以上。
【專利說(shuō)明】一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物局部成分含量的測(cè)定方法，尤其涉及一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是氮肥的消費(fèi)大國(guó)，年氮肥消耗量位居世界第一，但是氮肥利用率卻較低，平均只有35%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家的40%-60%。隨著氮肥的大量施用，許多地方出現(xiàn)隨氮肥施用量增加作物產(chǎn)量反而減少的現(xiàn)象。過(guò)低的氮肥利用率不僅造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，還嚴(yán)重的威脅到了人類的身體健康。2013年聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署全球養(yǎng)分管理合作伙伴(GPNM,UNEP)組織編寫的“Our Nutrient World”就系統(tǒng)分析了養(yǎng)分在糧食安全和環(huán)境保護(hù)中的作用，明確提出了 20-20計(jì)劃，即在20年內(nèi)提高養(yǎng)分利用效率20%。因此，提高氮肥利用率，充分挖掘作物高效利用氮素的遺傳潛力具有重要的生態(tài)和實(shí)際生產(chǎn)意義。
[0003]植物體內(nèi)硝態(tài)氮(N03_)的累積與利用是作物氮素營(yíng)養(yǎng)研宄的重要組成部分，關(guān)系到植物體內(nèi)NOf含量和氮素利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)高低的問(wèn)題。NO3-短途運(yùn)輸調(diào)控著NO 3_的利用效率。液泡對(duì)NO 3_起到分隔作用，儲(chǔ)存在液泡中的NO 3-不能及時(shí)高效利用；只有分配在液泡外原生質(zhì)體中的N03_才能被代謝酶及時(shí)代謝并形成植株體的一部分。因此，液泡N03_在原生質(zhì)體和液泡中的分配不僅影響了 NO 3_的利用效率，而且直接影響了植株的氮素利用效率，盡管N03_在液泡內(nèi)外的短途分配機(jī)理已取得了較好的研宄進(jìn)展，但對(duì)于如何測(cè)定液泡內(nèi)外NOf的濃度并沒(méi)有一個(gè)很好的方法。
目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中硝態(tài)氮的方法主要為微電極測(cè)定法，從而研宄液泡中實(shí)際的硝酸鹽外流與內(nèi)流過(guò)程。比如采用原位法監(jiān)測(cè)液泡內(nèi)外的電化學(xué)梯度，從而測(cè)定細(xì)胞質(zhì)和液泡中硝酸鹽的濃度是研宄硝酸鹽在細(xì)胞器間轉(zhuǎn)運(yùn)的原始方法。以往的研宄采用硝酸鹽選擇性微電極分別測(cè)定了液泡膜內(nèi)、外的二個(gè)組分或組群中的硝酸鹽濃度，同時(shí)用酶法測(cè)定整個(gè)單細(xì)胞的硝酸鹽濃度，證實(shí)了用硝酸鹽選擇性微電極測(cè)定液泡膜內(nèi)外的硝酸鹽濃度方法的可行性，這曾經(jīng)為研宄硝酸鹽在作物液泡膜上的運(yùn)輸提供了可行的方法與途徑。目前用于測(cè)定植株細(xì)胞硝酸鹽濃度的方法中，硝酸鹽選擇性微電極法受到普遍采用。國(guó)內(nèi)外有關(guān)對(duì)不同作物細(xì)胞和液泡中硝酸鹽濃度的變化及利用研宄的材料也不斷擴(kuò)大，迄今所能查到的有大麥、玉米、大豆、菠菜和水稻等一些作物，逐步形成了一套完善和成熟的細(xì)胞質(zhì)和液泡NO3-含量的測(cè)定方法，為液泡NO 3-利用的研宄創(chuàng)造了良好的條件。但利用雙電極法測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中的硝態(tài)氮含量畢竟是通過(guò)電流的變化來(lái)反應(yīng)硝態(tài)氮含量的變化，并不是對(duì)亞細(xì)胞器中硝態(tài)氮含量的直接測(cè)定；此外，雙阻微電極法分別測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中的硝態(tài)氮含量難度較大，很難確定微電極的扎針部位是否確定在亞細(xì)胞的某個(gè)部位，因此測(cè)定結(jié)果也并不一定能反映真實(shí)值。除此之外，國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在也有一些對(duì)細(xì)胞原生質(zhì)體和液泡進(jìn)行分離測(cè)定的報(bào)道，但都僅限于重金屬含量的測(cè)定，并沒(méi)有一種成熟的技術(shù)可以分別測(cè)定細(xì)胞原生質(zhì)體和液泡中的硝態(tài)氮含量。
[0004]可見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)液泡NOf在液泡內(nèi)外的分配機(jī)理已有一定研宄，但到目前為止還沒(méi)有一種普遍、有效的方法可以直接測(cè)定液泡內(nèi)外的N03_含量，也即原生質(zhì)體和液泡中的硝態(tài)氮含量。因此，抓住提高植物N03_利用效率的關(guān)鍵，進(jìn)一步方便植株體NO 3_利用效率的研宄，本申請(qǐng)根據(jù)以往的研宄結(jié)果對(duì)植株細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體和液泡的分離，提出了一套切實(shí)可行的測(cè)定植物細(xì)胞原生質(zhì)體和液泡中no3_含量的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服以上【背景技術(shù)】中提到的不足和缺陷，提供一種可以將植物細(xì)胞的原生質(zhì)體和液泡進(jìn)行分離，從而分別測(cè)定原生質(zhì)體中液泡內(nèi)外硝態(tài)氮含量的一種有效方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、夕卜硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法，包括以下步驟；
(1)植物細(xì)胞原生質(zhì)體的提取:取幼苗葉片，加入預(yù)冷的研磨緩沖液研磨，研磨液經(jīng)過(guò)濾、離心，得到的沉淀即為原生質(zhì)體，用懸浮緩沖液懸浮后得原生質(zhì)體懸浮液，分為兩等分，其中一份用于硝態(tài)氮含量的檢測(cè)，另一份用于提取液泡；
(2)植物細(xì)胞原生質(zhì)體中液泡的提取:取上述用于提取液泡的原生質(zhì)體懸浮液，加入到蔗糖溶液中，采用蔗糖密度梯度離心法離心，用移液槍吸取離心液中從上往下數(shù)的第二層溶液，即得到植物液泡；(離心后，離心液分為5層，用移液槍吸取從上往下數(shù)的第二層，即為植物液泡)
(3)原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定:在光鏡下檢測(cè)上述液泡中葉綠素的含量和細(xì)胞色素c氧化酶的活性，以確定提取液泡的純度，并且測(cè)定提取液泡中硝態(tài)氮的含量，最后分別測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中酸性磷酸酶的活性，并將原生質(zhì)體和液泡中硝態(tài)氮的含量用酸性磷酸酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)計(jì)算得到原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量。
[0007]方法原理:(I)在原生質(zhì)體中能檢測(cè)到葉綠素和細(xì)胞色素c氧化酶，而液泡中不含有這些成分因而檢測(cè)不到，采用此方法可以鑒定提取液泡純度的高低；(2)其次，由于植物酸性磷酸酶(ACP)既存在于原生質(zhì)體中，也存在于液泡中(即原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外均含有ACP),因此我們可以以ACP酶的酶活作為NO3-含量標(biāo)準(zhǔn)化的指標(biāo)。
[0008]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述步驟(I) ~ (3)的整個(gè)過(guò)程在0~40C下進(jìn)行。
[0009]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述研磨緩沖液pH為7.6，包括23~27 mmol.Γ14-羥乙基哌嗪乙磺酸-緩血酸胺，200~300mmol.L—1甘露醇，4~7 mmol 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，3~6 mmol.Γ1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，8~15mmol.廠1KCl，l~3mmol.L—1苯甲基磺酰氟，5~20mg.L ―1聚乙稀P比略燒酮，3~7mg.廠1牛血清白蛋白，
3?6 μ g.Γ1 2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚，4~7mmol.[1K2S2O5，0.8-1.2mmol.Γ1 二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇在所述研磨緩沖液使用前加入。(因?yàn)槎蛱K糖醇容易變性和降解，因此在溶液使用前加入效果最佳，加入時(shí)間久了以后會(huì)使緩沖液失效。)
上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述過(guò)濾是用兩層紗布過(guò)濾。
[0010]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述步驟(I)中離心的具體操作為:經(jīng)560Xg (離心力)離心12 min，然后將上清液經(jīng)1000Xg離心15 min，取上清液，經(jīng)60000 X g離心30min，棄上清液。
[0011]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述懸浮緩沖液pH為7.6，包括2.3-2.8 mmol.Γ14-羥乙基哌嗪乙磺酸-緩血酸胺,200-300 mmol.171甘露醇,0.8-1.2 mmol.L—1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，0.9-1.1 mmol噸―1 二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇在所述懸浮緩沖液使用前加入。
[0012]上述的測(cè)定方法中，優(yōu)選的，所述蔗糖密度梯度離心法的步驟包括:將懸浮液置于不連續(xù)蔗糖梯度:45%、36%、22%的蔗糖溶液中，經(jīng)70000 Xg離心2 h，取22%和36%區(qū)帶，再加入懸浮液，經(jīng)80000 Xg離心40 min。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明能夠有效分離植物細(xì)胞的原生質(zhì)體和液泡，從而準(zhǔn)確測(cè)定植物細(xì)胞的原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外的硝態(tài)氮含量，為監(jiān)測(cè)植物硝態(tài)氮的利用情況提供切實(shí)、可行的檢測(cè)手段。具體表現(xiàn):
(I)目前還沒(méi)有一種方法能準(zhǔn)確分別測(cè)定原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外的硝態(tài)氮含量，本方法采用原生質(zhì)體和液泡分離、ACP酶標(biāo)準(zhǔn)化硝態(tài)氮含量的方法可以準(zhǔn)確測(cè)定出原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量；(2)現(xiàn)有技術(shù)能夠從植物組織中提取到30%左右的完好原生質(zhì)體，本方法提取完好原生質(zhì)體的效率在90%以上；(3)現(xiàn)有技術(shù)對(duì)液泡和原生質(zhì)體的提取是完全獨(dú)立的兩個(gè)技術(shù)過(guò)程，本方法將提取的原生質(zhì)體分成兩等分的技術(shù)改進(jìn)減少了液泡提取的工作量，同時(shí)保證了原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的可比性；(4)現(xiàn)有技術(shù)能夠從植物組織中提取到10%左右的完好液泡，本方法完好液泡的提取效率在95%以上；(5)現(xiàn)有技術(shù)對(duì)原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外的硝態(tài)氮含量的計(jì)算沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)參照，本方法利用植物酸性磷酸酶(ACP)既存在于原生質(zhì)體中，也存在于液泡中的原理，以ACP酶的酶活作為N03_含量標(biāo)準(zhǔn)化的指標(biāo)；計(jì)算出來(lái)的硝態(tài)氮含量可以進(jìn)行準(zhǔn)確的比較含量高低。

【具體實(shí)施方式】
[0014]為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說(shuō)明書較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實(shí)施例。
[0015]除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]除非另有特別說(shuō)明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買得到或者可通過(guò)現(xiàn)有方法制備得到。
[0017]實(shí)施例1:
一種本發(fā)明的植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法，包括以下步驟；
(O植株材料的培養(yǎng)
油菜幼苗的培養(yǎng):將Xiangyoul5號(hào)油菜品種籽粒浸種于20%(v/v)的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒30min，采用砂培試驗(yàn)，選用30 cmX 30 cm棕色圓塑料缽，生長(zhǎng)基質(zhì)為無(wú)營(yíng)養(yǎng)液成分(用水和稀鹽酸清洗干凈)的珍珠巖砂粒；試驗(yàn)設(shè)I個(gè)氮水平:正常供氮(15 mmol.L — 1N03_)，正常供氮處理所用營(yíng)養(yǎng)液成分為賀格蘭德(Hoagland)營(yíng)養(yǎng)液(5 mmol.Γ1 KNO3,1mmol.L 1 KH2PO4, 7 mmol.L 1 MgSO4, 5 mmol.L 1 Ca (NO3)2.4H20，3 mmol.L 1 Fe-EDTA，46.25 μ mo I.L 1 B，6.722 μ mo I.L 1 Mn，0.765 μ mo I.L 1 Zn，0.316 μ mo I.L 1 Cu 和
0.5 μπιο?.Γ1 Mo) o每5天澆一次營(yíng)養(yǎng)液，保持ρΗ5.5，每缽一株，全生育期精心管理。
[0018]煙草幼苗的培養(yǎng):將萌發(fā)后的煙草品種K326在恒溫培養(yǎng)箱中育苗，水培液采用賀格蘭德(Hoagland)營(yíng)養(yǎng)液(I mmol.L 1 KNO3, 0.2 mmol.L 1 KH2PO4, 1.4 mmol.L 1MgSO4, I mmol.L-1 Ca (NO3)2.4H20, 0.6 mmol.L-1 Fe-EDTA, 9.25 μ mo I.L-1 B, 1.2μ mo I.L 1 Mn, 0.13 μ mo I.L 1 Zn, 0.06 μ mol.L 1 Cu 和 0.1 μ mol.L 1 Mo)，培養(yǎng)箱中的生長(zhǎng)條件為:溫度29°C、相對(duì)濕度86%，光照10h。
[0019]油菜和煙草原生質(zhì)體的提取及液泡分離的條件摸索:
在前人研宄的基礎(chǔ)上，我們根據(jù)油菜和煙草的生長(zhǎng)特性和生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行了植株樣品采集時(shí)間和米集部位的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)上午10點(diǎn)左右的樣品提取的液泡相對(duì)飽滿和活性尚，兩種作物都需采集生長(zhǎng)旺盛和成熟的植株部位作為液泡提取的材料。
[0020]此外，原生質(zhì)體中的液泡處于半包裹狀態(tài)時(shí)的提取效果最好；如果處于全包裹狀態(tài)，表明原生質(zhì)體沒(méi)有被破壞，液泡很難從原生質(zhì)體中分離出來(lái)；如果此時(shí)液泡已完全從原生質(zhì)體中分離出來(lái)，則將會(huì)立刻破裂，同樣得不到完整可用的液泡。因此在進(jìn)行原生質(zhì)體和液泡分離前，觀察到原生質(zhì)體中的液泡應(yīng)該是處于半包裹狀態(tài)，此時(shí)控制分離緩沖液中的滲透勢(shì)和釋放時(shí)間，就可以很好的將液泡從原生質(zhì)體中分離出來(lái)。比如，液泡處于半包裹狀態(tài)時(shí)，分離緩沖液中的甘露醇濃度應(yīng)該處于較低(0.2 mol.1/1)水平，這有利于液泡往內(nèi)吸收緩沖液而不斷脹大，最終從半包裹體中“釋放”出來(lái)；而釋放出來(lái)后的液泡必須立即處于較高甘露醇濃度(0.8 mol.L—1)的分離緩沖液中，以免因過(guò)度吸收溶液而破裂。歸納起來(lái)就是要特別注意液泡從原生質(zhì)體中分離的時(shí)間，以及嚴(yán)格控制分離緩沖液的滲透勢(shì)。以保證液泡即可以從原生質(zhì)體中分離出來(lái)，又不至于過(guò)度吸收水分而破裂。
[0021]油菜和煙草細(xì)胞原生質(zhì)體的提取:所有操作過(guò)程均在O?4°C下進(jìn)行，分別取約1g油菜和煙草的幼苗葉片，加入葉片質(zhì)量2倍體積的預(yù)冷的研磨緩沖液(研磨緩沖液的體積為葉片質(zhì)量的2倍)，其中研磨緩沖液的pH為7.6，包括25 mmol -Γ1 4-羥乙基哌嗪乙磺酸-緩血酸胺(ifepes-Tris)，250 mmol.171甘露醇，5 mmol噸-1乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，5 mmol.L—1 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，10 mmol.L KC1，2 mmol.Γ1 苯甲基磺酰氟(PMSF)，15mg.L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP )，5mg.L ―1牛血清白蛋白(BSA)，5 μ g.L ―12，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，5 mmol.[1K2S2O5, I mmol.Γ1 二硫蘇糖醇(DTT)(為了保持二硫蘇糖醇的使用效果，在使用緩沖液前加入到緩沖液中混合使用)，研磨。研磨液經(jīng)2層紗布過(guò)濾，560Xg離心12 min，上清液在1000Xg離心15 min后，再60000Xg離心30 min，棄上清液，得到的沉淀即為原生質(zhì)體，懸浮于I ml懸浮緩沖液(pH 7.6，包括2.5mmol.L 1Hepes-Tris，250 mmol.L 1 甘露醇，I mmol.L 1EDTA，I mmol.L 1DTT )中，得到原生質(zhì)體懸浮液，分為兩等分，其一用于硝態(tài)氮含量的檢測(cè)，另一份用于提取液泡。
[0022](2)油菜和煙草細(xì)胞原生質(zhì)體中液泡的提取:所有操作過(guò)程均在O?4°C下進(jìn)行，取上述用于提取液泡的原生質(zhì)體懸浮液，置于不連續(xù)蔗糖梯度[含45%、36%和22%(W/V)蔗糖溶液]，經(jīng)70000 Xg離心2 ho取22%和36%區(qū)帶，再加入懸浮液，經(jīng)80000 Xg離心40min，離心液分為5層，用移液槍吸取從上往下數(shù)的第二層，即得到油菜和煙草植株的液泡。
[0023](3)原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定:所有操作過(guò)程均在O?4°C下進(jìn)行，在光鏡下和采用分光光度比色法檢測(cè)上述液泡中葉綠素的含量和細(xì)胞色素c氧化酶的活性，分光光度計(jì)的OD值均為零，在液泡中檢測(cè)不到葉綠素含量和細(xì)胞色素c氧化酶的活性，表明提取到的液泡純度為100%，不含有任何原生質(zhì)體的其它雜質(zhì)；將提取到的液泡用超聲波震碎，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定液泡中硝態(tài)氮的含量，最后采用分光光度法分別測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中酸性磷酸酶的活性，并將原生質(zhì)體和液泡中硝態(tài)氮的含量用酸性磷酸酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)計(jì)算得到原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量，結(jié)果表明液泡中的硝態(tài)氮含量占到原生質(zhì)體硝態(tài)氮含量的95.4%，表明植物體內(nèi)絕大部分硝態(tài)氮均儲(chǔ)藏在原生質(zhì)體的液泡中。
[0024]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種植物原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)植物細(xì)胞原生質(zhì)體的提取:取幼苗葉片，加入預(yù)冷的研磨緩沖液研磨，研磨液經(jīng)過(guò)濾、離心，得到的沉淀即為原生質(zhì)體，用懸浮緩沖液懸浮后得原生質(zhì)體懸浮液，分為兩等分，其中一份用于硝態(tài)氮含量的檢測(cè)，另一份用于提取液泡； (2)植物細(xì)胞原生質(zhì)體中液泡的提取:取上述用于提取液泡的原生質(zhì)體懸浮液，加入至蔗糖溶液中，采用蔗糖密度梯度離心法離心，用移液槍吸取離心液中從上往下數(shù)的第二層溶液，即得到植物液泡； (3)原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮含量的測(cè)定:在光鏡下檢測(cè)上述液泡中葉綠素的含量和細(xì)胞色素c氧化酶的活性，以確定提取液泡的純度，并且測(cè)定提取液泡中硝態(tài)氮的含量，最后分別測(cè)定原生質(zhì)體和液泡中酸性磷酸酶的活性，并將原生質(zhì)體和液泡中硝態(tài)氮的含量用酸性磷酸酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)計(jì)算得到原生質(zhì)體中液泡內(nèi)、外硝態(tài)氮的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟(1)~(3)的整個(gè)過(guò)程在0~4°C下進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述研磨緩沖液pH為7.6，包括23~27mmol.L 1 4_輕乙基呢嘆乙橫酸-緩血酸胺，200~300mmol.L 1甘露醇，4~7 mmol.L 1乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸，3~6 mmol.L—1乙二胺四乙酸二鈉，8~15mmol.L ―1 KC1，l~3mmol.L—1苯甲基磺酰氟，5_20mg.L ―1聚乙稀P比略燒酮，3~7mg.廠1牛血清白蛋白，3—6 μ g.L 1 2, 6- 二叔丁基 ~4~ 甲基苯酸，4~7mmol.L 1 K2S205，0.8—1.2mmol.L 1 二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇在所述研磨緩沖液使用前加入。
4.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述過(guò)濾是用兩層紗布過(guò)濾。
5.如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟(1)中離心的具體操作為:經(jīng)560Xg離心12 min，然后將上清液經(jīng)lOOOOXg離心15 min，取上清液，經(jīng)60000 Xg離心30 min，棄上清液。
6.如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述懸浮緩沖液pH為7.6，包括2.3-2.8 mmol.Γ1 4-羥乙基哌嗪乙磺酸-緩血酸胺，200~300 mmol.Γ1甘露醇，0.8-1.2 mmol.L—1乙二胺四乙酸二鈉，0.9-1.1 mmol.L ―1 二硫蘇糖醇，所述二硫蘇糖醇在所述懸浮緩沖液使用前加入。
7.如權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述鹿糖密度梯度離心法的步驟包括:將懸浮液置于不連續(xù)蔗糖梯度:45%、36%、22%的蔗糖溶液中，經(jīng)70000Xg離心2h，取22%和36%區(qū)帶，再加入懸浮液，經(jīng)80000Xg離心40 min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/26GK104498585SQ201410700868
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】張振華, 宋海星, 向鵬華, 單雪華, 韓永亮, 劉強(qiáng), 榮湘民, 彭建偉, 郭維 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 湖南省煙草公司衡陽(yáng)市公司