一種分離、純化金釵石斛原生質(zhì)體的方法和專用試劑配方的制作方法
【專利摘要】一種分離、純化金釵石斛原生質(zhì)體的方法和專用試劑配方。專用試劑溶液A和溶液B，A由MES、KCl、Mannitol、CellulaseR10、PectolyaseY-23、MacerozymeR-10、BSA、CaCl2和ddH2O。溶液B由MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2、ddH2O。該試劑制備原生質(zhì)體步驟：（1）將金釵石斛植株放黑暗處培養(yǎng)12h，取幼嫩飽滿葉片無菌處理后剪碎；（2）在搖床上用溶液A黑暗處理（1）碎片釋放出原生質(zhì)體；（3）將（2）獲得的原生質(zhì)體溶液過200目細(xì)胞篩過濾，濾液離心2-8min，用溶液B溶解沉淀物，反復(fù)離心；（4）用FDA對（3）純化的原生質(zhì)體活力檢測。用本法制的原生質(zhì)體密度大、純度高、活力強(qiáng)。
【專利說明】-種分離、純化金紋石解原生質(zhì)體的方法和專用試劑配方

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體為用金鐵石解的幼嫩葉片分離、純化原生質(zhì) 體的方法與相應(yīng)的專用試劑配方。本發(fā)明為一種金鐵石解原生質(zhì)體分離與純化的方法與專 用試劑。使用包括W下步驟：原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定、原生 質(zhì)體活力率的測定。 技術(shù)背景
[000引 金鐵石解(化/7血(9如曲/7(9如7e Lindl.)在治療白內(nèi)障、益胃生津、抗腫瘤、抗衰 老、抗福射、治療也血管疾病、提高機(jī)體免疫功能、抗疲勞等方面具有顯著功效，在國內(nèi)外具 有廣闊的市場，已成為世界各國防病、治病和醫(yī)療保健的極品良藥。然而，由于金鐵石解自 然生長緩慢的自身原因、生長環(huán)境被破壞的環(huán)境原因和長期被掠奪式采挖的人為原因，導(dǎo) 致其資源日益匿乏，已被列為國家二類保護(hù)植物和《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》，迫切需 要借助現(xiàn)代生物技術(shù)，（1)保護(hù)和利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源、（2)創(chuàng)制新的種質(zhì)資源為選育優(yōu)良 品種奠定材料基礎(chǔ)、（3)利用細(xì)胞息浮培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因工程菌方式生產(chǎn)藥用成分W縮短有效 成分的獲取周期。分離純化出高活力的原生質(zhì)體，進(jìn)一步通過細(xì)胞工程方法對金鐵石解進(jìn) 行遺傳改良具有重要的研究價(jià)值和市場潛力。
[0003] 植物原生質(zhì)體是指除去了全部細(xì)胞壁后質(zhì)膜包裹的細(xì)胞，是開展基礎(chǔ)研究的理想 材料。分離純化的原生質(zhì)體，可W用于開展植物細(xì)胞信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞壁合成機(jī)理、 膜的結(jié)構(gòu)與功能、核質(zhì)關(guān)系、突變體誘導(dǎo)、雜交或自交不親和的機(jī)理、細(xì)胞間的相互作用、植 物激素的作用機(jī)理、分離各種細(xì)胞器、引入細(xì)胞器、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源基因、生物反應(yīng) 器構(gòu)建等方面的研究。
[0004] 本發(fā)明人首先搜集了多個金鐵石解的種質(zhì)資源，進(jìn)行評價(jià)后，用源自赤水的金鐵 石解種源的種子為外植體，通過植物組培技術(shù)進(jìn)行種子萌發(fā)、原球莖誘導(dǎo)和組培再生苗培 養(yǎng)，系統(tǒng)建立起種苗的組培快繁技術(shù)體系，再W組培再生苗的葉片為材料，用酶解法分離獲 得了原生質(zhì)體，并進(jìn)行了純度和活力檢測。進(jìn)一步W云南瑞麗的一個金鐵石解品系和赤水 金鐵石解另一個品系的嫩葉為研究材料，W本技術(shù)方法和試劑進(jìn)行原生質(zhì)體分離純化，均 能獲得純度高、活力強(qiáng)的原生質(zhì)體，為金鐵石解的種質(zhì)資源拓展、商業(yè)化遺傳育種、基因改 良等后續(xù)研究奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0005] 國內(nèi)外迄今檢索到的、關(guān)于金鐵石解原生質(zhì)體分離的報(bào)道有兩份。一份是劉運(yùn)全 等（2010) W金鐵石解類原球莖為研究材料，用酶解法獲得了（8. 25 + 0. 17) X IO5個/g、活 性為（90. 24+1.84) %原生質(zhì)體的報(bào)道巧リ運(yùn)全等，2010,熱帶生物學(xué)報(bào)1(3) :215-219), 而本專利用采用的材料為金鐵石解組培苗或成株的幼嫩葉片，分離原生質(zhì)體的溶液配方和 操作流程與劉運(yùn)全等的也基本不同，但本專利獲得的原生質(zhì)體得率可達(dá)7. 55 X 1〇7個/g葉 片，遠(yuǎn)高于該文獻(xiàn)報(bào)道，且本專利獲得的原生質(zhì)體活力率均達(dá)90% W上，最高可達(dá)92. 38%， 與該文獻(xiàn)比較而言相當(dāng)或更高。
[0006] 另一份文獻(xiàn)是本實(shí)驗(yàn)室之前申報(bào)的一項(xiàng)專利，"一種赤水金鐵石解原生質(zhì)體分離、 純化方法及專用試劑"（申報(bào)日期為2014年4月17日，專利受理號為201410153412. 9)，原 生質(zhì)體的得率為3. 72X IO7個/g葉片、活力率達(dá)86. 13%。本專利在該文獻(xiàn)基礎(chǔ)上做了較大 改進(jìn)，使得原生質(zhì)體的得率和活力率顯著增加。與前一個專利文獻(xiàn)比較，本發(fā)明專利做了如 下重大改進(jìn)；（0本專利的使用不僅僅限制于組培苗的葉片，還可應(yīng)用于田間種植植株的 幼嫩葉片，但田間葉片在酶解前需滅菌處理；（2)本專利增添了簡單的預(yù)處理步驟，W提高 原生質(zhì)體的得率和活力，具體為；在酶解葉片分離原生質(zhì)體前，先將金鐵石解再生苗植株或 田間種植的株放置在黑暗條件下培養(yǎng)12 h，取幼嫩飽滿葉片在超凈工作臺中經(jīng)無菌處理后 將其切割為1 mm左右寬的碎片后置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培養(yǎng)皿中，在4 C低 溫、黑暗條件下質(zhì)壁分離1 h后倒掉甘露醇溶液；（3)本發(fā)明專利中溶液A與溶液B中關(guān)鍵 試劑和實(shí)驗(yàn)流程中關(guān)鍵參數(shù)巧日溫度、轉(zhuǎn)速、處理時間）是一定的幅度范圍，而不是像前專利 那樣是某一個具體的數(shù)值，該使得實(shí)驗(yàn)時更便捷和更具有可操作性；（4)本專利的原生質(zhì) 體得率翻倍，活力也顯著提高，分別達(dá)7. 55 X IO7個/g和92. 38%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡單易行且快速獲取能滿足細(xì)胞器分離與功能鑒定、 轉(zhuǎn)基因受體和生物反應(yīng)器構(gòu)建的金鐵石解原生質(zhì)體的方法與專用試劑的配方。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明包括原生質(zhì)體的分離、原生質(zhì)體的純化、原生質(zhì)體產(chǎn) 量的測定、原生質(zhì)體活力的鑒定等四方面內(nèi)容。具體內(nèi)容如下： 原生質(zhì)體的分離；（0將金鐵石解再生苗植株或成株放置在黑暗條件下培養(yǎng)12 h，取 幼嫩飽滿葉片在超凈工作臺中經(jīng)無菌處理后將其切割為1 mm左右寬的碎片后進(jìn)行預(yù)處理， 即置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培養(yǎng)皿中，在4 C低溫、黑暗條件下質(zhì)壁分離1 h后 倒掉甘露醇溶液。（2)注入溶液A對預(yù)處理后的葉片碎片進(jìn)行避光酶解，在溫度23-28 C、 轉(zhuǎn)速為50-150巧m的恒溫?fù)u床上震蕩0.5-6 h即可釋放出原生質(zhì)體。本步驟中，注入溶 液A的量根據(jù)葉片碎片的多少來決定，W溶液A剛好淹沒葉片碎片小段為宜；培養(yǎng)皿需用封 口膠封口 W避免染菌；培養(yǎng)皿在恒溫?fù)u床上震蕩，使溶液A與葉片碎片充分接觸為宜。（3) 溶液A酶解完成后，打開培養(yǎng)皿，用吸頭輕輕吹打葉片，即可充分釋放出酶解出來的原生質(zhì) 體。
[0009] 所述溶液A成分如表1。
[0010] 表1溶液A成分及含量（W 10 ml為例）；

【權(quán)利要求】
1. 一種分離、純化金釵石斛原生質(zhì)體的專用試劑配方，其特征在于：專用試劑溶液A和 溶液 B，A 由 MES、KC1、Mannitol、Cellulase R10、Pectolyase Y-23、Macerozyme R-10、 BSA、CaCl2 和 ddH20 ;溶液 B 由 MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2、ddH20 ; 溶液A成分及含量以10 ml如下：
所述試劑溶液A各成分濃度為：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L, CaCl2 0.l〇-〇. 30 mol/L ； 溶液B成分及含量以IOml如下： :...1_
所述試劑溶液B各成分濃度為：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L, CaCl2 0?10-0. 30 mol/L。
2. -種分離、純化金釵石斛原生質(zhì)體的方法，其方法步驟和特征在于： 一）原生質(zhì)體的分離：1)將金釵石斛再生苗植株或成株放置在黑暗條件下培養(yǎng)12 h， 取幼嫩飽滿葉片在超凈工作臺中經(jīng)無菌處理后將其切割為I mm左右寬的碎片后進(jìn)行預(yù)處 理，即置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培養(yǎng)皿中，在4 °C低溫、黑暗條件下質(zhì)壁分離1 h后倒掉甘露醇溶液； 2)注入溶液A對預(yù)處理后的葉片碎片進(jìn)行避光酶解，在溫度23-28 °C、轉(zhuǎn)速為50-150 rpm的恒溫?fù)u床上震蕩0. 5-6 h即可釋放出原生質(zhì)體；本步驟中，注入溶液A的量根據(jù)葉片 碎片的多少來決定，以溶液A剛好淹沒葉片碎片小段為宜；培養(yǎng)皿需用封口膠封口以避免 染菌；培養(yǎng)皿在恒溫?fù)u床上震蕩，使溶液A與葉片碎片充分接觸； 3)溶液A酶解完成后，打開培養(yǎng)皿，用吸頭輕輕吹打葉片，即可充分釋放出酶解出來的 原生質(zhì)體； 二） 原生質(zhì)體的純化：將酶解0. 5-6 h左右原生質(zhì)體混合液用200目的細(xì)胞篩過濾，再 將濾液置于2 ml離心管中，在100-500 g/min下離心2-8 min，使原生質(zhì)體沉降，然后棄上 清夜，將溶液B緩慢加入沉降物中進(jìn)行輕輕重懸，在100-500 g/min的轉(zhuǎn)速下離心2-5次， 每次2-8 min，最終得到純化的原生質(zhì)體； 三) 原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定：將純化后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入溶液B中，定量成2 ml，輕輕吹打， 使原生質(zhì)體分布均勻；取一塊干凈的血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋玻片，用移液槍吸取一滴原生質(zhì)體 液加在蓋玻片一側(cè)邊緣，待液體充滿計(jì)數(shù)區(qū)，置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)三次，每次 重復(fù)數(shù)三遍，取平均值；根據(jù)加入溶液A中葉片的多少計(jì)算出每克葉片得到的原生質(zhì)體的 產(chǎn)量，計(jì)算結(jié)果以每克葉片細(xì)胞數(shù)表示(個/g); 四） 原生質(zhì)體活力的鑒定：利用FDA (熒光素雙醋酸酯)透過原生質(zhì)體后，在酯酶的作用 下迅速分解，放出熒光素，使有活力的原生質(zhì)體發(fā)出黃綠色的熒光從而來鑒定原生質(zhì)體的 活力，計(jì)算原生質(zhì)體活力時需在明視野下觀察原生質(zhì)體總數(shù)，然后再轉(zhuǎn)到熒光下記錄有活 力的原生質(zhì)體數(shù)，最后計(jì)算原生質(zhì)體活力率。
【文檔編號】C12Q1/06GK104357377SQ201410671534
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】徐德林, 儲士潤, 張 林, 楊璐萍, 錢剛 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院