一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法，包括稱量、浸提、離心處理、定容和計(jì)算，采用此提取方法，禹白附中總黃酮的提取率可以達(dá)到4.7％。超聲波輔助提取法要求設(shè)備簡單，操作方便，重現(xiàn)性好，提取量高，提取溶劑對(duì)操作人損害小，且超聲波對(duì)黃酮物質(zhì)的活性無影響，是黃酮類等化合物提取優(yōu)先選用的方法，采用此提取方法，禹白附中總黃酮的提取率可以達(dá)到4.7％，對(duì)于提取的粗黃酮提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、低溫冷凍干燥進(jìn)行生物活性研究，結(jié)果表明提取的粗黃酮具有一定的還原能力及對(duì)·OH、O-2·、ABTS+自由基的清除能力，以及對(duì)一些細(xì)菌具有一定的抑菌活性。
【專利說明】一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能性食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禹白附中總黃酮的提取工藝方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 河南省是一個(gè)中藥資源大省，中藥材的種植已有2000多年的歷史，品種數(shù)量和儲(chǔ) 存量均居全國前列。其中以四大懷山藥、山茱萸、金銀花、柴胡、連翹、山碴等種植量最多。 其中，河南省平頂山市禹州也是中藥材種植基地，中藥材種植量達(dá)40種左右，禹白附也是 其中一種。禹白附和關(guān)白附通稱白附子，但兩者功效不同，目前關(guān)白附研究的較多。禹白附 為獨(dú)角蓮的干燥塊莖，以河南禹州產(chǎn)的禹白附最為地道，因其生品有毒，臨床用其炮制品入 藥。禹白附是臨床常用中藥，主要用于治療頭痛、破傷風(fēng)、毒蛇咬傷等疾病。藥理研究表明禹 白附具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜止痛、抗菌消炎、美白等多種功效，目前對(duì)其抗腫瘤作用研究較多；化 學(xué)成分主要有機(jī)酸及其酯類、揮發(fā)油類、氨基酸、腦苷酯、皂苷類、多糖以及一些微量元素。 關(guān)于禹白附總黃酮物質(zhì)的提取工藝、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定國內(nèi)外尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)中沒 有相關(guān)提取工藝的不足。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法，具體按照以 下步驟實(shí)施：
[0005] 步驟1、禹白附樣品的前處理和稱量：將禹白附烘干至恒重、粉碎得到禹白附樣 品；稱取上述禹白附樣品和乙醇溶液；
[0006] 步驟2、浸提：用乙醇溶液浸泡禹白附樣品，超聲提取并靜置；
[0007] 步驟3、離心處理：離心分離殘?jiān)?，留上清液；殘?jiān)貌襟E2中的條件進(jìn)行浸提處理 后再進(jìn)行離心處理，留上清液；重復(fù)1-3次，其中步驟2和步驟3中用到的乙醇溶液的總量 為步驟1中稱量的乙醇溶液總量；合并上清液，得到總黃酮提取物。
[0008] 本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0009] 禹白附的前處理?xiàng)l件：烘干條件為55°C-65°c，粉碎過60目篩。
[0010] 禹白附樣品和乙醇溶液的質(zhì)量體積比（g/mL)為1:15-1:35。
[0011] 步驟1中乙醇溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70%。
[0012] 浸提條件為：浸泡時(shí)間為15min-25min;超聲時(shí)間為：20min-100min，超聲溫度為： 35°C-75°C，超聲波功率為200W;靜置時(shí)間為：3min-7min。
[0013] 離心處理的轉(zhuǎn)速為：2500r/min-3500r/min;離心處理時(shí)間為：8min-12min;所述 浸提和離心處理的次數(shù)為1-3次。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：超聲波輔助提取法要求設(shè)備簡單，操作方便，重現(xiàn)性好，提 取量高，提取溶劑對(duì)操作人損害小，且超聲波對(duì)黃酮物質(zhì)的活性無影響，是黃酮類等化合物 提取優(yōu)先選用的方法，采用此提取方法，禹白附中總黃酮的提取率可以達(dá)到4. 7%，提取的 粗黃酮具有一定的還原能力及對(duì)?0H、0_2 ?、ABTS+自由基的清除能力，以及對(duì)一些細(xì)菌具 有一定的抑菌活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響曲線圖；
[0016] 圖2是本發(fā)明超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響曲線圖；
[0017] 圖3是本發(fā)明超聲提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響曲線圖；
[0018] 圖4是本發(fā)明料液比對(duì)總黃酮得率的影響曲線圖；
[0019]圖5是本發(fā)明提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響曲線圖；
[0020] 圖6是本發(fā)明總黃酮的定性結(jié)果圖；
[0021] 圖7是本發(fā)明黃酮粗提物的還原能力測(cè)定曲線圖；
[0022] 圖8是本發(fā)明黃酮粗提物對(duì)?OH自由基清除率的測(cè)定圖；
[0023] 圖9是本發(fā)明黃酮粗提物對(duì)CT2?的清除率測(cè)定圖；
[0024] 圖10是本發(fā)明黃酮粗提物對(duì)ABTS+清除率的測(cè)定圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026] 本發(fā)明提供一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法，具體按照以下步驟實(shí)施：
[0027] 步驟1、禹白附樣品的前處理和稱量：將禹白附于55°C-65°C的條件下，烘干至恒 重，粉碎，過60目篩，得到禹白附樣品；按照質(zhì)量體積比（g/mL)為1:15-1:35稱取禹白附樣 品和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70 %的乙醇溶液；
[0028] 步驟2、浸提：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%-70%的乙醇溶液浸泡禹白附樣品151^11-251^11， 在超聲波功率為200W，35°C-75°C條件下超聲提取20min-100min，靜止3min-7min;
[0029] 步驟3、離心處理：用低速離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為2500r/min-3500r/min下離心 8min-12min分離殘?jiān)?，留上清液；殘?jiān)貌襟E2中的條件進(jìn)行浸提處理后再進(jìn)行離心處理， 重復(fù)1-3次，其中步驟2和步驟3中用到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70%的乙醇溶液的總量為步 驟1中稱量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70%的乙醇溶液總量；合并上清液，得到總黃酮提取物。
[0030] 步驟4、按照體積比為1:1分別稱取上清液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的NaNO2溶液，搖勻 靜置3min-8min，再加入與上清液等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的Al(NO3) 3溶液，搖勻，放置 3min-8min，加入10倍量的上清液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH溶液，再用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇 定容至25mL，混勻靜置8min_12min;
[0031] 步驟5、計(jì)算：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70%的乙醇溶液為對(duì)照組，于510nm波長處測(cè) 定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，由吸光度求出提取液中的蘆丁含量，按下列公式計(jì)算出 待測(cè)樣中總黃酮的含量；
[0032] 總黃酮的提取量Hi1(mg)=CXV1XV2
[0033] 總黃酮的得率％ =Hi1Ai2X100
[0034] 式中：C為測(cè)得吸光值，帶入回歸方程計(jì)算出的總黃酮濃度（mg/mL)J1為總黃酮 提取液體積（mL)，V2為測(cè)量總黃酮含量時(shí)的定容體積（mL)。Hi1為粗提取物中黃酮的重量 (mg)，m2為禹白附樣品重量（mg)。
[0035]在上述提取方法中，本方法的關(guān)鍵試劑是：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、NaN02、 Al(N03) 3。采用這幾種試劑是因?yàn)樘J丁是屬于黃酮類物質(zhì)的一種，常用于測(cè)定黃酮含量的 標(biāo)準(zhǔn)品，而測(cè)定方法通常采用NaNO2-Al(N03)3比色法測(cè)定總黃酮含量。對(duì)于黃酮的提取通 常采用微波提取法、膜分離法、雙水相提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、有機(jī) 溶劑提取法、熱水提取法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但超聲波輔助提取法要求設(shè)備簡單，操 作方便，重現(xiàn)性好，提取量高。利用超聲波所具有的空化作用破壞植物的細(xì)胞膜，從而有助 于黃酮類物質(zhì)快速溶解于溶劑中。同時(shí)，超聲波促使提取溶劑不斷震蕩有助于溶質(zhì)擴(kuò)散，超 聲波的熱效應(yīng)對(duì)原料還具有水浴作用。另外，還利用其次效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、擴(kuò)散、擊碎等， 使其加速被提取成分的擴(kuò)散、釋放。
[0036] 有機(jī)溶劑常用甲醇、乙醇、丙酮等溶劑，但是甲醇和丙酮毒性大，而乙醇提取溶劑 對(duì)操作人損害小，因而采用無水乙醇作為溶劑，且超聲波對(duì)黃酮物質(zhì)的活性無影響，是黃酮 類等化合物提取優(yōu)先選用的方法，采用此提取方法。本方法關(guān)鍵的參數(shù)是質(zhì)量體積比為1 : 20g/mL、提取次數(shù)3次，提取時(shí)間40-80min、乙醇濃度50-70%、提取溫度為55-75°C，在此工 藝條件下，總黃酮的提取率為4. 0% -4. 7%。
[0037] 結(jié)合圖1，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率在不斷浮動(dòng)。在乙醇濃度60%時(shí)，總 黃酮得率達(dá)到最大值。如圖2所示，隨著超聲提取時(shí)間的增加，總黃酮得率先上升后下降。 在超聲提取時(shí)間為60min時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值。如圖3所示，隨著提取溫度的增加， 總黃酮得率在不斷浮動(dòng)。在提取溫度達(dá)到75°C時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值。溫度的升高使 黃酮在乙醇中的溶解度逐漸增加，從而其提取率逐漸升高。但是溫度過高也影響溶劑揮發(fā)， 造成溶劑的損失以及影響黃酮類物質(zhì)的生物活性。因此，綜合考慮選擇提取溫度為75°C為 最佳提取溫度。如圖4所示，隨著乙醇提取液體積的增加，總黃酮得率先上升后下降。在乙 醇提取液體積為20mL時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值?？赡茉蛟谟谝欢ǖ牧弦罕确秶鷥?nèi)，禹 白附中黃酮類物質(zhì)的溶出速度隨著料液比的增大而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 : 20時(shí)，黃酮類 物質(zhì)的溶出速度達(dá)到最大。如圖5所示，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮得率在不斷上升，提 取三次時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大值。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 將禹白附于60°C的條件下，烘干至恒重，粉碎，過60目篩，得到禹白附樣品；準(zhǔn)確 稱取I.OOg禹白附樣品，以50%乙醇溶液為提取液，按Ig:20mL的料液比，用乙醇溶液浸 泡20min后用超聲波輔助法在超聲波功率為200W、75°C提取80min，靜止5min后在轉(zhuǎn)速為 3000r/min下，用低速離心機(jī)離心IOmin分離殘?jiān)?，留上清液，重?fù)3次，上述乙醇溶液的總 量為稱量的乙醇溶液總量；合并上清液，得到總黃酮提取物；取ImL總黃酮提取物于試管 中，加入LOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，搖勻靜置5min后，再加入LOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3) 3溶液，搖勻，放置5min后加入IOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %NaOH溶液，再用體積分?jǐn)?shù)30 %乙 醇定容，混勻靜置lOmin，以試劑空白為對(duì)照組，于510nm波長處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 回歸方程，由吸光度求出提取液中的蘆丁含量，按下列公式計(jì)算出待測(cè)樣中總黃酮的含量。
[0040] 總黃酮的提取量In1 (mg) =CXV1XV2
[0041] 總黃酮的得率％ =In1Zm2X100
[0042] 式中：C為測(cè)得吸光值，帶入回歸方程計(jì)算出的總黃酮濃度（mg/mL)。V1為總黃酮 提取液體積（mL)，V2為測(cè)量總黃酮含量時(shí)的定容體積（mL)。Hi1為粗提取物中黃酮的重量 (mg)，m2為禹白附樣品重量（mg)。根據(jù)此工藝條件該禹白附中總黃酮的提取率為4. 7%。
[0043] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)做定性實(shí)驗(yàn)，分別向提取液中加入0. 1 %三氯化鐵溶液、1 %三氯化 鋁溶液、20%氫氧化鈉溶液；黃酮類化合物在其基本碳架上含有堿性氧原子，而絕大多數(shù) 都是帶有酚性羥基的衍生物，因而能與某些金屬離子產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)，以及與某些較強(qiáng)的還 原劑發(fā)生顏色反應(yīng)。如圖6所示，1號(hào)試管是對(duì)照；2號(hào)試管是超聲提取液中加入20%的氫 氧化鈉，試樣變成棕黃色；3號(hào)試管是超聲提取液中加入三氯化鐵，溶液變成了淺綠色，可 能由于黃酮量比較少的緣故，溶液顏色沒有變成墨綠色；4號(hào)試管是超聲提取液中加入1% 的三氯化鋁溶液，會(huì)發(fā)現(xiàn)有少許黃色絡(luò)合物生成。由定性試驗(yàn)可知，超聲提取物中含有黃酮 類物質(zhì)。
[0044] 對(duì)于上述黃酮提取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，低溫冷凍干燥機(jī)干燥，得到禹白 附黃酮粗提物，對(duì)于此粗提物進(jìn)行抑菌和抗氧化活性研究如下：
[0045] (1).禹白附中黃酮粗提物的抑菌活性測(cè)定
[0046] 稱取禹白附中黃酮粗提物500mg，用10%乙醇配成溶液，并用濾膜過濾除菌。分別 取制備好的4種供試菌（金黃色葡萄球菌ATCC25923,綠膿桿菌CCTCC2620,嗜水氣單胞菌， 大腸桿菌ATCC25922)懸液（IO6個(gè)/mL) 100iiL均勻涂布瓊脂平板，然后在平板上打孔，孔 穴直徑為6mm，每孔穴依次加入300?50mg/mL不同濃度的黃酮粗提取液50iiL，同時(shí)以抗 生素（鹽酸左氧氟沙星）和10%乙醇作對(duì)照，分別在37°C溫度下培養(yǎng)24h后，測(cè)量孔穴周 圍抑菌圈直徑，用以表示抗菌活性（抗菌活性=抑菌圈直徑一 6mm)。結(jié)果如表1所示。
[0047] 表1.榴蓮果皮總黃酮提取物對(duì)微生物的抑菌圈直徑（cm)
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，具體按照以下步驟實(shí)施： 步驟1、禹白附樣品的前處理和稱量：將禹白附烘干至恒重、粉碎得到禹白附樣品；稱 取上述禹白附樣品和乙醇溶液； 步驟2、浸提：用乙醇溶液浸泡禹白附樣品，超聲提取并靜置； 步驟3、離心處理：離心分離殘?jiān)?，留上清液；殘?jiān)貌襟E2中的條件進(jìn)行浸提處理后再 進(jìn)行離心處理，留上清液；重復(fù)1-3次，其中步驟2和步驟3中用到的乙醇溶液的總量為步 驟1中稱量的乙醇溶液總量；合并上清液，得到總黃酮提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，所述禹白附 的前處理?xiàng)l件：烘干條件為55°C -65°C，粉碎過60目篩。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，所述步驟1中 禹白附樣品和乙醇溶液的質(zhì)量體積比（g/mL)為1:15-1:35。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，所述步驟1中 乙醇溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% -70%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，所述浸提條 件為：浸泡時(shí)間為15min-25min ;超聲時(shí)間為：20min-100min，超聲溫度為：35°C -75°C，超 聲波功率為200W ;靜置時(shí)間為：3min-7min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的禹白附中總黃酮的提取工藝方法，其特征在于，所述離心處 理的轉(zhuǎn)速為：2500r/min-3500r/min ;離心處理時(shí)間為：8min-12min ;所述浸提和離心處理 的次數(shù)為1-3次。
【文檔編號(hào)】A23L1/30GK104351804SQ201410647047
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】洪軍, 胡建業(yè), 王福梅, 柳靜, 杜海霞, 趙安芳, 王佩 申請(qǐng)人:河南城建學(xué)院