一種HtrA2融合基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種HtrA2融合基因，該HtrA2融合基因能應(yīng)用于防治由線粒體受損引起的病癥。該基因由線粒體外膜蛋白USP30的定位序列與HtrA2的蛋白酶功能域及PDZ功能域融合而成。在細(xì)胞里表達(dá)后，MOM-HtrA2蛋白能靶向定位到線粒體表面，將企圖進(jìn)入線粒體的各種變性蛋白降解，防止它們?cè)诰€粒體內(nèi)部積累，從根本上清除引發(fā)線粒體損傷的變性蛋白，解決了現(xiàn)有技術(shù)的抗氧化藥物“治標(biāo)”不“治本”的問題。
【專利說明】—種HtrA2融合基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種HtrA2融合基因及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]線粒體受損是器官退化性疾病的共同病理特征之一。已知的退行性神經(jīng)疾病中，有不少是由于變性蛋白損傷了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能所引起的。例如老年癡呆癥相關(guān)的Αβ蛋白片段、帕金森氏病相關(guān)的突變a -Synuclein蛋白、肌肉萎縮性側(cè)面硬化病相關(guān)的突變SODl蛋白等，都可以在線粒體表面或內(nèi)部積累，并形成不溶性的蛋白聚集體，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。除了這些由突變基因所引起的變性蛋白積累，在老年人的神經(jīng)元中，由于蛋白合成的準(zhǔn)確率以及蛋白酶體的活力下降，部分在細(xì)胞質(zhì)里合成的線粒體蛋白存在突變卻不能被及時(shí)降解清除。當(dāng)它們轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體后，也能形成不溶性蛋白聚集體，引起線粒體的結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致老年性的退行性神經(jīng)元死亡。
[0003]目前已有的線粒體保護(hù)技術(shù)很少，而且都“治標(biāo)”不“治本”。由于變性蛋白在線粒體中積累后往往引起氧化性自由基的大量產(chǎn)生，造成線粒體的進(jìn)一步氧化損傷，已有各種技術(shù)主要是通過把抗氧化藥物送入細(xì)胞或線粒體，以期降低氧化性自由基水平° 例如文獻(xiàn)“Protective effect of pyrroloquinoline quinone againstA β -1nduced neurotoxicity in human neuroblastoma SH-SY5Y cells，，(NeurosciLett.464:165-169)和“Involvement of ERK1/2 pathway in neuroprotective effectsof pyrroloquinoline quinine against rotenone-1nduced SH-SY5Y cell injury，，(Neuroscience 270:183-191),報(bào)道了批咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine,PQQ)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用。PQQ是最近幾年發(fā)現(xiàn)的最有效的線粒體抗氧化劑之一，能降低心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及其它細(xì)胞線粒體中的氧化性自由基，也能在一定程度上緩解Αβ蛋白片段等變性蛋白所引起的線粒體損傷。但由于PQQ并不直接抑制變性蛋白的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)或清除線粒體中的變性蛋白，因此它不能改變線粒體損傷的根源，效果也往往不太理想。
[0004]因此，降低變性蛋白在線粒體內(nèi)部的積累是當(dāng)前退行性神經(jīng)疾病預(yù)防治療中亟待解決的技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種HtrA2融合基因，能用于防止變性蛋白在線粒體內(nèi)積累。該基因由線粒體外膜蛋白USP30的定位序列與HtrA2的蛋白酶功能域及PDZ功能域融合而成(以下稱 Mitochondrial Outer Membrane HtrA2,簡(jiǎn)稱 M0M_HtrA2)。在細(xì)胞里表達(dá)后，M0M-HtrA2蛋白能靶向定位到線粒體表面，將企圖進(jìn)入線粒體的各種變性蛋白降解，防止它們?cè)诰€粒體內(nèi)部積累。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
一種HtrA2融合基因，其特征在于:該HtrA2融合基因的DNA序列為SEQID NO:1。
[0007]本發(fā)明的HtrA2融合基因?yàn)镸0M_HtrA2融合基因，5’端的201個(gè)堿基編碼USP30的線粒體外膜定位系列，而3’端的975個(gè)堿基編碼HtrA2的蛋白酶功能域和PDZ功能域。兩段序列間由GGATCT序列鏈接。
[0008]本發(fā)明的HtrA2融合基因在線粒體保護(hù)中的應(yīng)用。
[0009]線粒體蛋白酶HtrA2主要有兩種蛋白亞型，較長(zhǎng)的HtrA2L和較短的HtrA2S。一般認(rèn)為，HtrA2S分布在線粒體內(nèi)外膜間隙中，能降解其周圍的變性蛋白，是保護(hù)線粒體的主要亞型。實(shí)驗(yàn)證明，HtrA2L雖然蛋白水平很低，但也能發(fā)揮很重要的保護(hù)功能。與HtrA2S不同，HtrA2L分布在線粒體外膜上，是線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通道的“門衛(wèi)”，能把即將進(jìn)入線粒體的變性蛋白在線粒體表面及時(shí)降解，防止它們?cè)诰€粒體內(nèi)部積累。一般細(xì)胞中的HtrA2L水平很低，因此它們抵御變性蛋白以及蛋白酶體抑制的能力有限。
[0010]本發(fā)明中所用的人類線粒體外膜蛋白USP30 cDNA序列中的1-201核苷酸編碼它的線粒體外膜定位序列(Mitochondrial Outer Membrane Targeting Sequence, MOM-TS),而人類線粒體蛋白酶HtrA2 cDNA序列中的400-1374編碼它的蛋白酶功能域(ProteaseDomain)和PDZ功能域。將USP30 (1-201)與HtrA2 (400-1374)片段用分子克隆方法融合，建立線粒體外膜HtrA2 (MOM-HtrA2)的表達(dá)載體。提高線粒體表面的HtrA2蛋白水平，從而能更有效的防止變性蛋白在線粒體內(nèi)部積累，為線粒體的保護(hù)提供新的途徑。
[0011]本發(fā)明的HtrA2融合基因構(gòu)建的具體步驟如下:
I)用含有Acc65I位點(diǎn)的引物I和含有BamHI位點(diǎn)的引物2 PCR擴(kuò)增出人類線粒體外膜蛋白 USP30 cDNA 中的 USP30 (1-201)片段(SEQID N0:2)。
[0012]2)用含有BglII位點(diǎn)的引物3和XbaI位點(diǎn)的引物4，PCR擴(kuò)增蛋白酶HtrA2 cDNA中的 HtrA2 (400-1374)片段(SEQID NO: 3)。
[0013]3)用限制性內(nèi)切酶Acc65I和BamHI對(duì)USP30(1-201)片段進(jìn)行酶切，用BglII和XbaI對(duì)HtrA2 (400-1374)片段進(jìn)行酶切。
[0014]4)通過瓊脂糖凝膠電泳純化、回收酶切后的片段；
5)將回收的USP30(1-201)和HtrA2 (400-1374)片段同時(shí)連接到經(jīng)Acc65I和XbaI酶切處理的基因表達(dá)載體中，得到由USP30 (1-201)和HtrA2 (400-1374)連接而成的HtrA2融合基因。
[0015]所述引物I的DNA序列為(SEQID N0:4):
5’ -GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’
所述弓丨物2的DNA序列為(SEQID NO: 5):
5’ -GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’
所述弓丨物3的DNA序列為(SEQID NO: 6):
5’ -GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’
所述弓丨物4的DNA序列為(SEQID NO: 7):
5’ -GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’
本發(fā)明的融合基因可以用任何常用的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。
[0016]本發(fā)明提出了線粒體保護(hù)的新途徑，通過建立線粒體外膜HtrA2 (M0M-HtrA2)的表達(dá)載體，提高線粒體表面的HtrA2蛋白水平，從而有效的防止變性蛋白在線粒體內(nèi)部積累。因此，本發(fā)明的HtrA2融合基因不同于現(xiàn)有技術(shù)的抗氧化藥物，僅是降低由變性蛋白積累引起的氧化性自由基水平，而是從根本上清除引發(fā)線粒體損傷的變性蛋白，解決了現(xiàn)有技術(shù)的抗氧化藥物“治標(biāo)”不“治本”的問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為實(shí)施例4的變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果。
[0018]圖2為實(shí)施例5的變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果。
[0019]圖3為實(shí)施例6的變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果。
[0020]圖4為實(shí)施例7的細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)M0M_HtrA2融合基因的線粒體保護(hù)功能作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0022]實(shí)施例1
本發(fā)明的M0M-HtrA2融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建具體步驟如下:
I)用含有Acc65I位點(diǎn)的引物I和含有BamHI位點(diǎn)的引物2 PCR擴(kuò)增出人類線粒體外膜蛋白USP30 cDNA中的1-201核苷酸序列，即USP30 (1-201)片段。
[0023]2)用含有BglII位點(diǎn)的引物3和XbaI位點(diǎn)的引物4，PCR擴(kuò)增蛋白酶HtrA2 cDNA中的 400-1374 核苷酸，即 HtrA2 (400-1374)片段。
[0024]3)用限制性內(nèi)切酶Acc65I和BamHI對(duì)USP30(1_201)片段進(jìn)行酶切，用BglII和XbaI對(duì)HtrA2 (400-1374)片段進(jìn)行酶切。
[0025]4)通過瓊脂糖凝膠電泳純化、回收酶切后的片段，連接入經(jīng)過Acc65I和XbaI酶切處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)化涂板后，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒DNA后，用Acc65I和XbaI進(jìn)行酶切鑒定。
[0026]實(shí)施例2
本實(shí)施例的實(shí)施方式與實(shí)施例1基本相同，在此基礎(chǔ)上:
所述引物I的DNA序列為:
5’ -GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’
所述引物2的DNA序列為:
5’ -GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’
所述引物3的DNA序列為:
5’ -GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’
所述引物4的DNA序列為:
5’ -GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’。
[0027]實(shí)施例3
本發(fā)明的M0M-HtrA2融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建具體步驟如下:
I)用含有Acc65I位點(diǎn)的引物I和含有BamHI位點(diǎn)的引物2 PCR擴(kuò)增出人類線粒體外膜蛋白USP30 cDNA中的1-201核苷酸序列，即USP30 (1-201)片段；PCR循環(huán)的條件為:94° C變性30秒、55 ° C退火30秒、72 ° C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
[0028]2)用含有BglII位點(diǎn)的引物3和XbaI位點(diǎn)的引物4，PCR擴(kuò)增蛋白酶HtrA2 cDNA中的400-1374核苷酸，即HtrA2 (400-1374)片段；PCR循環(huán)的條件為:94。C變性30秒、55 ° C退火30秒、72 ° C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
[0029]3)用限制性內(nèi)切酶Acc65I和BamHI對(duì)USP30(1_201)片段進(jìn)行酶切，用BglII和XbaI對(duì)HtrA2 (400-1374)片段進(jìn)行酶切，酶切條件為37 ° C 3小時(shí)。
[0030]4)通過瓊脂糖凝膠電泳純化、回收酶切后的片段，用T4 DNA Ligase連接入經(jīng)過Acc65I和XbaI酶切處理的pcDNA3.1-Flag載體中，連接條件為16 ° C 2小時(shí)。轉(zhuǎn)化涂板后，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒DNA后，用Acc65I和XbaI進(jìn)行酶切鑒定。
[0031]實(shí)施例4
表達(dá)M0M-HtrA2抑制A β片段在線粒體中的累積
I)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
穩(wěn)定表達(dá)變性蛋白MM-A β -myc的HEK293T (HtrA2K0)細(xì)胞株是用含有MM-A β -myc的慢病毒感染HtrA2基因敲除的HEK293T細(xì)胞，并用抗生素清除未感染細(xì)胞而獲得的。其培養(yǎng)條件:DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100單位/ml的青霉素，100 mg/ml的鏈霉素，在37°C，5% CO2孵箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染所用的試劑是MegaTran 1.0 (Origene公司)，按廠家所提供的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
[0032]2 ) M0M-HtrA2 表達(dá)的檢測(cè)
本發(fā)明所述M0M-HtrA2融合基因的表達(dá)載體中帶有Flag標(biāo)簽序列，在細(xì)胞中表達(dá)后，M0M-HtrA2蛋白帶有Flag標(biāo)記。為檢測(cè)它的表達(dá)，可將細(xì)胞裂解，用SDS-PAGE分離蛋白，再用Western Blot分析進(jìn)行定量。檢測(cè)所用的一抗為Flag標(biāo)簽抗體(Prospect公司)和帶有熒光標(biāo)記的二抗(Thermo-Fisher公司)。依次用它們孵育含有蛋白的PVDF膜以后，用L1-Cor Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描獲取Western圖像。在Western結(jié)果中，M0M-HtrA2為55 kd的單一條帶。具體結(jié)果見圖1。
[0033]3 )變性蛋白降解的檢測(cè)
本實(shí)施例中的所表達(dá)的變性蛋白為在N-端帶有線粒體內(nèi)膜定位序列(MitochondrialInner Membrane Targeting Sequence,簡(jiǎn)稱 MIM),并在 C-端帶有 Myc 標(biāo)簽的 A β 蛋白。該蛋白在細(xì)胞中合成后能轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜上，以單體或多聚體形式存在。該蛋白的表達(dá)可通過SDS-PAGE和Western Blot分析進(jìn)行檢測(cè)。所用的抗體為Myc標(biāo)簽抗體(Prospect公司)與突光標(biāo)記的二抗(Thermo-Fisher公司)。Western結(jié)果用L1-Cor Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描獲得。
[0034]4)變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果(圖1)
圖1A.表達(dá)M0M-HtrA2可有效降解進(jìn)入線粒體的Αβ單體。
[0035]由于內(nèi)源HtrA2基因也能產(chǎn)生少量定位在線粒體表面的HtrA2蛋白，為消除它的影響，我們用敲除了 HtrA2基因的HEK293T細(xì)胞(HtrA2 KO細(xì)胞)建立了穩(wěn)定表達(dá)MM-A β的細(xì)胞株，用以檢測(cè)M0M-HtrA2的變性蛋白清除活力。M0M_HtrA2表達(dá)能有效降低MIM-A β單體的水平。用蛋白酶體抑制劑Bortezomib (簡(jiǎn)稱Bort, 100 ηΜ, 12小時(shí))處理細(xì)胞能明顯降低蛋白酶體對(duì)MIM-A β的降解，使細(xì)胞中的MIM-A β水平升高，但表達(dá)M0M_HtrA2能抑制這種升高。Tomm70是線粒體外膜蛋白，作為線粒體總量的內(nèi)參。
[0036]圖1B.圖1A實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。表示ρ〈0.005。
[0037]圖1C.表達(dá)M0M_HtrA2可顯著降解線粒體中的ΜΙΜ-Αβ多聚體。
[0038]在穩(wěn)定表達(dá)ΜΜ-Αβ的細(xì)胞中表達(dá)M0M_HtrA2能顯著降低在線粒體內(nèi)膜上形成的Αβ多聚體。Bortezomib (Bort)處理也會(huì)引起線粒體內(nèi)部Aβ多聚體水平的明顯升高,而表達(dá)M0M-HtrA2幾乎完全抑制這種升高。Actin是蛋白上樣量的內(nèi)參。
[0039]圖1D.圖1C實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。表示ρ〈0.005。
[0040]實(shí)施例5
表達(dá)M0M-HtrA2能顯著降低突變SODl和突變a_Synuclein在線粒體中的累積。
[0041]I)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
穩(wěn)定表達(dá)變性蛋白SODl (G93A)或a-SynucIein (A30P)的HEK293T細(xì)胞株是用含有這些突變基因的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，并用抗生素清除未感染細(xì)胞而獲得的。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染條件同實(shí)施例4。
[0042]2)HtrA2表達(dá)的檢測(cè)
同實(shí)施例4，檢測(cè)結(jié)果見圖2。
[0043]3 )變性蛋白降解的檢測(cè)
SODl (G93A)或a-SynucIein (A30P)蛋白上也帶有Myc標(biāo)簽，其檢測(cè)方法同實(shí)施例4。
[0044]4)變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果(圖2)
圖2A.M0M-HtrA2能顯著降解進(jìn)入線粒體的變性蛋白SODl (G93A)。
[0045]在穩(wěn)定表達(dá)了突變SODl，即SODl (G93A)的HEK293T細(xì)胞中表達(dá)M0M_HtrA2能顯著降低S0D1(G93A)蛋白在線粒體中積累。SODl (G93A)是引起肌肉萎縮性側(cè)面硬化病的突變蛋白，容易在線粒體內(nèi)部形成不溶性蛋白聚集體。Tomm70是線粒體外膜蛋白，作為線粒體總量的內(nèi)參。
[0046]圖2B.圖2A實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。表示ρ〈0.005。
[0047]圖2C.M0M-HtrA2能顯著降解進(jìn)入線粒體的變性蛋白a -Synuclein(Α30Ρ)。
[0048]在穩(wěn)定表達(dá)突變a-Synuclein, S卩 a-Synuclein (Α30Ρ)的 ΗΕΚ293Τ 細(xì)胞中表達(dá)M0M_HtrA2 能顯著降低 a-Synuclein(A30P)蛋白在線粒體中積累。a-Synuclein(Α30Ρ)是引起帕金森氏病的突變蛋白。部分a-Synuclein(Α30Ρ)蛋白能進(jìn)入線粒體,形成不溶性蛋白聚集體。Tomm70是線粒體外膜蛋白，作為線粒體總量的內(nèi)參。
[0049]圖2D.圖2C實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。表示ρ〈0.005。
[0050]實(shí)施例6
表達(dá)M0M-HtrA2能顯著降低突變的線粒體蛋白endoG(N174A)和OTC Λ 30-114的累積。
[0051]I)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
穩(wěn)定表達(dá)變性蛋白endoG(N174A)和OTCA 30-114的HEK293T細(xì)胞株是用含有這些突變基因的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，并用抗生素清除未感染細(xì)胞而獲得的。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染條件同實(shí)施例4。
[0052]2) HtrA2表達(dá)的檢測(cè)
同實(shí)施例4，檢測(cè)結(jié)果見圖3。
[0053]3 )變性蛋白降解的檢測(cè)
變性蛋白endoG(N174A)和OTCA 30-114上也帶有Myc標(biāo)簽，其檢測(cè)方法同實(shí)施例4。
[0054]4)變性蛋白降解的檢測(cè)結(jié)果(圖3)
圖3A.M0M-HtrA2能有效降解突變的線粒體蛋白endoG(N174A)。
[0055]在穩(wěn)定表達(dá)線粒體突變蛋白endoG(N174A)的HEK293T細(xì)胞株中表達(dá)M0M_HtrA2能有效降低endoG(N174A)在線粒體中的積累。endoG(N174A)是含有N174A點(diǎn)突變的endoG蛋白，容易在線粒體內(nèi)外膜間隙中形成不溶性蛋白聚集體。Tomm70是線粒體外膜蛋白，作為線粒體總量的內(nèi)參。
[0056]圖3B.圖3A實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。表示ρ〈0.005。
[0057]圖3C.M0M_HtrA2能有效降解突變的線粒體蛋白0TCA30-114。
[0058]在穩(wěn)定表達(dá)線粒體突變蛋白OTC Λ 30-114的ΗΕΚ293Τ細(xì)胞株中表達(dá)M0M_HtrA2能有效降低OTC Δ 30-114在線粒體中的積累。OTC是線粒體基質(zhì)蛋白，而OTC Λ 30-114是缺失了第30位至第114位DNA的突變OTC蛋白，它容易在基質(zhì)中形成不溶性蛋白聚集體。Tomm70是線粒體外膜蛋白，作為線粒體總量的內(nèi)參。
[0059]圖3D.圖3C實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。**表示p〈0.01 實(shí)施例7
M0M-HtrA2表達(dá)和PQQ處理對(duì)蛋白酶體抑制劑所引起細(xì)胞凋亡的影響 1、細(xì)胞培養(yǎng)
穩(wěn)定表達(dá)M0M-HtrA2的HEK293T細(xì)胞株是用攜帶M0M_HtrA2基因的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，并用抗生素清除未感染細(xì)胞而獲得的。其培養(yǎng)條件與HEK293細(xì)胞相同。運(yùn)用蛋白酶體抑制劑 Bortezomib 50 ηΜ 處理 HEK293T、HEK293T (M0M_HtrA2)細(xì)胞 24 h，部分細(xì)胞質(zhì)中不能被及時(shí)降解的變性蛋白會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，在線粒體中的積累，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
[0060]作為對(duì)比，另一組HEK293T細(xì)胞在Bortezomib處理過程中同時(shí)加入100 mM PQQ。
[0061]2、HtrA2表達(dá)的檢測(cè)
同實(shí)施例4，檢測(cè)結(jié)果見圖4A。
[0062]3、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法
采用FITC-Annexin V熒光染色方法檢測(cè)Bortezomib處理的HEK293T、HEK293T(M0M-HtrA2)細(xì)胞以及Bortezomib/PQQ處理的HEK293T細(xì)胞的凋亡情況。將處理后的細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞之后，在細(xì)胞懸浮液中加入FITC-Annexin標(biāo)記凋亡細(xì)胞，通過熒光顯微鏡成相，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。
[0063]4、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果(圖4)
圖4A.Western Blot分析檢測(cè)M0M_HtrA2在各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的表達(dá)。
[0064]圖4B.M0M-HtrA2比PQQ更有效地降低蛋白酶體抑制所引起的細(xì)胞凋亡。
[0065]用FITC-Annexin V突光染色方法分析表明用蛋白酶體抑制劑Bortezomib處理HEK293T細(xì)胞(濃度50 ηΜ,時(shí)間24小時(shí))能誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡，而表達(dá)M0M_HtrA2能顯著降低這種細(xì)胞凋亡。PQQ處理也能降低細(xì)胞凋亡，但效果不如M0M-HtrA2。
[0066]圖4C.圖4B實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果。*表示p〈0.05, **表示p〈0.01。
【權(quán)利要求】
1.一種HtrA2融合基因，其特征在于:該HtrA2融合基因的DNA序列為SEQID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HtrA2融合基因，其特征在于:該HtrA2融合基因構(gòu)建的具體步驟如下: 1)用含有Acc65I位點(diǎn)的引物I和含有BamHI位點(diǎn)的引物2PCR擴(kuò)增出人類線粒體外膜蛋白 USP30 cDNA 中的 USP30 (1-201)片段； 2)用含有BglII位點(diǎn)的引物3和XbaI位點(diǎn)的引物4，PCR擴(kuò)增蛋白酶HtrA2cDNA中的 HtrA2 (400-1374)片段； 3)用限制性內(nèi)切酶Acc65I和BamHI對(duì)USP30(1-201)片段進(jìn)行酶切，用BglII和XbaI對(duì)HtrA2 (400-1374)片段進(jìn)行酶切； 4)通過瓊脂糖凝膠電泳純化、回收酶切后的片段； 5)將回收的USP30(1-201)和HtrA2(400-1374)片段同時(shí)連接到經(jīng)Acc65I和XbaI酶切處理的基因表達(dá)載體中，得到由USP30 (1-201)和HtrA2 (400-1374)連接而成的HtrA2融合基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種HtrA2融合基因，其特征在于: 所述引物I的DNA序列為:
5’ -GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’ 所述引物2的DNA序列為:
5’ -GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’ 所述引物3的DNA序列為:
5’ -GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’ 所述引物4的DNA序列為:
5’ -GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HtrA2融合基因的應(yīng)用，其特征在于:該HtrA2融合基因在防治由線粒體受損引起的病癥中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種HtrA2融合基因的應(yīng)用，其特征在于:所述的病癥為退行性神經(jīng)疾病。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK104357470SQ201410644113
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】姜長(zhǎng)安, 張婷, 胡袁 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西第二醫(yī)院