低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)pesa精子的方法
【專(zhuān)利摘要】低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法，將80%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加入錐形管中，然后將40%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加在液面之上，使之液面分層清晰；充分混合附睪液標(biāo)本，將0.5ml附睪液緩慢的加在40%密度梯度培養(yǎng)基液面上，使之液面分層清晰；離心400×g15min，優(yōu)質(zhì)精子將在錐形管底部沉淀；輕輕吸取出沉淀，懸浮于5mlHET培養(yǎng)基中，離心300×g8min以去除殘留的密度梯度培養(yǎng)基；吸出沉淀，懸浮于3.0ml精子獲能培養(yǎng)基中，離心300×g5min以去除殘留的HTF培養(yǎng)基；去除上清液，留取0.5ml左右的獲能液與沉淀充分混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中代用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從人附睪液中回收高質(zhì)量精子的方法，具體涉及低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)是目前治療梗阻性無(wú)精癥的唯一有效方法[1]，此技術(shù)使得無(wú)數(shù)梗阻性無(wú)精癥患者擁有了自己的后代。通過(guò)人類(lèi)經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA)獲得的精子是ICSI精子的主要來(lái)源之一，但是經(jīng)PESA取得的精子密度、活率和前向運(yùn)動(dòng)率很差，傳統(tǒng)的高低密度梯度力心法只適合洗滌體外射出的、密度和活率較高的精液，如果用此方法洗滌PESA精子則不能有效回收高質(zhì)量精子(傳統(tǒng)梯度離心密度培養(yǎng)基加入量為2.5-3.0 ml),目前普遍使用的洗滌PESA精子方法是直接用HET洗滌培養(yǎng)基離心附睪液，此方法不能有效去除附睪液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和鞘膜積液等雜質(zhì)，在進(jìn)行ICSI操作時(shí)這些雜質(zhì)經(jīng)常阻塞和粘連穿刺針，甚至在操作過(guò)程中需要更換穿刺針，增加了操作成本和操作時(shí)間，使得卵子在培養(yǎng)箱外暴露時(shí)間延長(zhǎng)，卵子超微結(jié)構(gòu)損傷的概率增加，影響的卵子的受精率和胚胎的種植潛能[2].(參考文獻(xiàn):[I]董瑞娜，郭藝紅，孫瑩璞等，3106個(gè)不同來(lái)源精子ICSI周期臨床妊娠結(jié)局分析.生殖與避孕，2013,4 (33):233-238 [2]靳鐳，朱桂金，章漢望，等.PESA結(jié)合ICSI治療無(wú)精子癥其后代安全性的回顧性研究.中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志，2006,4( 11): 1025-1027)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，從而提供一種低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法。原理為:低劑量密度梯度離心法所加入梯度培養(yǎng)基量少，為傳統(tǒng)方法的30%-40%，液面較低，活動(dòng)精子在離心時(shí)比無(wú)活力的精子更主動(dòng)地沿沉淀梯度的方向運(yùn)動(dòng)、從而穿過(guò)不同密度界面的特點(diǎn)，可以回收較多的活動(dòng)的精子，回收率比目前普遍應(yīng)用的HET洗滌培養(yǎng)基離心法好，本發(fā)明采用低劑量高低密度梯度離心法減少了密度梯度培養(yǎng)基的用量，使得在有效去除附睪液中雜質(zhì)的同時(shí)最大限度的收集附睪液中的活動(dòng)精子。
[0004]解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟和條件:
步驟一:將80%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加入錐形管中，然后小心的將40%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加在頁(yè)面之上，使之液面分層清晰；
步驟二:充分混合附睪液標(biāo)本，將0.5ml附睪液緩慢的加在40%密度梯度培養(yǎng)基，使之液面分層清晰；
步驟三:離心400Xgl5min，優(yōu)質(zhì)精子將在錐形管底部沉淀；
步驟四:輕輕吸取出沉淀，懸浮于5mlHET培養(yǎng)基中，離心300Xg8min以去除殘留的密度梯度培養(yǎng)基；
步驟五:吸出沉淀，懸浮于3.0ml精子獲能培養(yǎng)基中，離心300Xg5min以去除殘留的HTF培養(yǎng)基；
步驟六:緩慢的去除上清液，留取0.5ml左右的獲能液與沉淀充分混勻，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中代用。
[0005]采用上述技術(shù)方案的有益效果是:
本發(fā)明提供的低劑量高低密度梯度離心法，是一種操作簡(jiǎn)單、實(shí)用的精液處理方法，適用于洗滌人類(lèi)經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA，又稱(chēng)作附睪穿刺術(shù))提取的精子，能有效的去除附辜液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、銷(xiāo)I吳積液和細(xì)菌等雜質(zhì)，有利于精子體外獲能，有效避免了在單精子卵胞漿內(nèi)注射(ICSI)操作中雜質(zhì)堵塞和粘連穿刺針情況的發(fā)生，減少卵子體外操作時(shí)間，最大限度的減少溫度、濕度和C02濃度的變化對(duì)卵子紡錘體、微絲等超微結(jié)構(gòu)的損傷，從而可以改善卵子受精潛能和胚胎發(fā)育潛能，以提高卵子受精率和胚胎種植率。

【具體實(shí)施方式】
[0006]低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法，【具體實(shí)施方式】再述于下，它由下述步驟組成:
步驟一:高低密度梯度離心培養(yǎng)基:由美國(guó)Coopersurgical公司生產(chǎn)，貨號(hào):ART-2024。將80%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加入錐形管中，然后小心的將40%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加在頁(yè)面之上，使之液面分層清晰；
步驟二:充分混合附睪液標(biāo)本，將0.5ml附睪液緩慢的加在40%密度梯度培養(yǎng)基，使之液面分層清晰，如附睪液體積較大，可同時(shí)使用多個(gè)錐形管；
步驟三:離心400Xgl5min，優(yōu)質(zhì)精子將在錐形管底部沉淀；
步驟四:HTF精子洗滌培養(yǎng)基由美國(guó)Coopersurgical公司生產(chǎn)，貨號(hào):ART_1006。輕輕吸取出沉淀，懸浮于5mlHET培養(yǎng)基中，離心300Xg8min以去除殘留的密度梯度培養(yǎng)基；步驟五:精子獲能洗滌培養(yǎng)基由美國(guó)Coopersurgical公司生產(chǎn)，貨號(hào):ART_1020。吸出沉淀，懸浮于3.0ml精子獲能培養(yǎng)基中，離心300Xg5min以去除殘留的HTF培養(yǎng)基；
步驟六:緩慢的去除上清液，留取0.5ml左右的獲能液與沉淀充分混勻，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中代用。
【權(quán)利要求】
1.低劑量高低密度梯度離心法洗滌人類(lèi)PESA精子的方法，其特征在于:它由下述步驟組成: 步驟一:將80%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加入錐形管中，然后小心的將40%密度梯度培養(yǎng)基0.5ml加在頁(yè)面之上，使之液面分層清晰； 步驟二:充分混合附睪液標(biāo)本，將0.5ml附睪液緩慢的加在40%密度梯度培養(yǎng)基，使之液面分層清晰； 步驟三:離心400Xgl5min，優(yōu)質(zhì)精子將在錐形管底部沉淀； 步驟四:輕輕吸取出沉淀，懸浮于5mlHET培養(yǎng)基中，離心300Xg8min以去除殘留的密度梯度培養(yǎng)基； 步驟五:吸出沉淀，懸浮于3.0ml精子獲能培養(yǎng)基中，離心300Xg5min以去除殘留的HTF培養(yǎng)基； 步驟六:緩慢的去除上清液，留取0.5ml左右的獲能液與沉淀充分混勻，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中代用。
【文檔編號(hào)】C12N5/076GK104403993SQ201410626225
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】葛斌, 楊智敏, 刁英, 楊名慧, 宮黎明, 姚觀平, 董世桃 申請(qǐng)人:遵義醫(yī)學(xué)院