一次細(xì)針穿刺材料提取基因組dna和rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種一次細(xì)針穿刺活檢材料提取基因組DNA和RNA的方法。本發(fā)明是將微量活檢材料用渦旋混合器對(duì)細(xì)胞裂解液和樣品進(jìn)行混合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA和RNA的同時(shí)提取，替代了傳統(tǒng)液氮研磨或機(jī)械粉碎方法由于操作過程中樣品損失過大而只能分別對(duì)DNA和RNA進(jìn)行提取。本發(fā)明的操作步驟簡(jiǎn)單，成本低，所需樣本量少，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間短，有效的防止DNA和RNA降解；提取后的DNA和RNA的濃度、純度和完整性，能夠滿足后續(xù)的基因組學(xué)各方面的分析要求。
【專利說明】-次細(xì)針穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分離、制備或純化DNA或RNA的方法，具體是一種一次細(xì)針穿刺材料提 取基因組DNA和RNA的方法，可供下游基因組學(xué)分析。

【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部和科技部在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行的第三次居民死亡原因抽樣調(diào)查結(jié)果 表明：惡性腫瘤已成為我國(guó)第二位死亡原因，占死亡總數(shù)的22. 32%，僅次于腦血管病，在城 市更是高居死因首位（占城市死亡總數(shù)的25.0%)。近30年以來，癌癥發(fā)病數(shù)以年均3%? 5%的速度遞增。目前，醫(yī)學(xué)上采用的傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷、組織細(xì)胞學(xué)診斷都是對(duì)已經(jīng)形成腫 瘤組織塊的樣本進(jìn)行分析，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的蹤跡。由于傳統(tǒng)的方法存在上述滯后的問 題，腫瘤分子診斷由此誕生，其最大優(yōu)點(diǎn)在于能早期甚至"超早期"發(fā)現(xiàn)腫瘤特有的突變基 因，在這些基因突變尚未累積形成腫瘤組織塊時(shí)，就能及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤蹤跡，從而實(shí)現(xiàn)有效干 預(yù)。其中，基因分子檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)"三早"的根本途徑之一。目前，化療總體有效率在30%到 40%，而通過基因檢測(cè)篩選出獲益病人，有效率可以提高到80%。
[0003] 腫瘤個(gè)體化醫(yī)療系統(tǒng)生物學(xué)基因組技術(shù)綜合檢測(cè)是一種全新的個(gè)性化治療方法， 其原理是利用細(xì)針穿刺活檢材料，采用多種基因組技術(shù)(下代測(cè)序、RNA表達(dá)譜、拷貝數(shù)變 化）和系統(tǒng)生物方法，捕捉到的不僅是個(gè)體的細(xì)胞畸變，還有在所有已知的細(xì)胞生物中的復(fù) 雜交互。目前的研究表明，癌癥的誘因是多種多樣的。腫瘤個(gè)體化醫(yī)療系統(tǒng)生物學(xué)基因組 技術(shù)綜合檢測(cè)能夠在全基因組監(jiān)測(cè)條件下，對(duì)不同的人采用不同的靶向治療方法。該項(xiàng)目 可同時(shí)應(yīng)用于健康人群及高危人群的癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)分析和癌癥病人的疾病探源、治療輔助 診斷、用藥指導(dǎo)等。
[0004] 腫瘤個(gè)體化醫(yī)療系統(tǒng)生物學(xué)基因組技術(shù)綜合檢測(cè)需要用腫瘤組織（穿刺活檢或手 術(shù)取材)來進(jìn)行DNA和RNA分離提取。但目前傳統(tǒng)的總RNA制備方法（Trizol法、CTAB-LiCl 法、CTAB-異丙醇法、異硫氰酸胍熱苯酚法)和DNA制備方法(濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚 抽提法、水抽提法)不能充分滿足對(duì)一次細(xì)針穿刺的微量活檢材料同時(shí)提取DNA和RNA的要 求，微創(chuàng)活檢材料有限是目前進(jìn)行多層面全基因組檢測(cè)的最大瓶頸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明就是為了解決活檢材料少而不能滿足多層面全基因組學(xué)分析需求的問題， 而提供的一種一次細(xì)針穿刺活檢材料提取基因組DNA和RNA的方法。
[0006] 本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007] -種一次穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法，步驟如下： a. 將一次細(xì)針穿刺材料置于細(xì)胞裂解液中，室溫孵育； b. 使用渦旋混合器對(duì)上述混合物進(jìn)行渦旋混勻，靜置，重復(fù)渦旋混勻和靜置步驟； c. 取1/4體積的細(xì)胞裂解液混合物用于分離RNA ; d. 剩余細(xì)胞裂解液混合物用于分離DNA ; 所述步驟C中分離RNA的步驟為： I .向細(xì)胞裂解液混合物中加入TRIzol，用渦旋混合器作勻漿處理，室溫靜置，再加入 氯仿，振蕩，室溫靜置； II .低溫條件下離心，吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，室溫靜置； III.低溫條件下離心，棄掉上清液，加入75%乙醇洗滌RNA沉淀； IV .在低溫、低離心力條件下離心，棄掉上清液，室溫靜置，加入無 RNase的水、0. 5% 十二烷基磺酸鈉或100%的去離子甲酰胺溶液，懸浮沉淀，充分溶解RNA，-70°C保存?zhèn)溆茫?所述步驟d中分離DNA的步驟為： I .向剩余裂解液混合物中加入蛋白酶K，混勻，水浴，振蕩，離心，吸取上清液； II .加入I步所述上清液2倍體積的異丙醇，混勻，再加入與上清液、異丙醇混合后體 積相等的酚：氯仿：異戊醇混合物，混勻，離心； III.取上層溶液并加入與上層溶液等體積的氯仿：異戊醇混合溶液，混勻，離心； IV .取上層溶液并加入上層溶液1/2體積的乙酸氨，再加入上層溶液2倍體積的無水 乙醇，混勻，室溫靜置，離心； V .棄掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，離心； VI.棄掉上清液及管壁殘液，加入TE溶液重新溶解沉淀物，置于4°C或-20°C保存?zhèn)?用。
[0008] 這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，用渦旋混合器對(duì)一次細(xì)針穿刺獲得的約幾毫克的活檢樣品和 細(xì)胞裂解液進(jìn)行渦旋混勻替代傳統(tǒng)液氮研磨或機(jī)械粉碎組織勻漿方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，使 得提取DNA和RNA的方法操作步驟簡(jiǎn)單，成本低；使用一次細(xì)針穿刺獲得的活檢材料可以同 時(shí)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行提取，所需樣本量少，減少了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，有效的防止DNA和RNA降 解；同時(shí)，使用本發(fā)明所述的方法提取的DNA和RNA的濃度、純度和完整性能夠滿足后續(xù)對(duì) 全基因組拷貝數(shù)、全基因組表達(dá)和全外顯子測(cè)序等分析的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是樣品1提取的RNA完整性檢測(cè)圖； 圖2是樣品2提取的RNA完整性檢測(cè)圖； 圖3是樣品3提取的RNA完整性檢測(cè)圖； 圖4是樣品4提取的RNA完整性檢測(cè)圖； 圖5是樣品5提取的RNA完整性檢測(cè)圖； 圖6是瓊脂糖電泳檢測(cè)五個(gè)樣品提取的DNA完整性檢測(cè)圖； 圖7是樣品1提取的RNA全基因組基因表達(dá)分析圖； 圖8是樣品2提取的RNA全基因組基因表達(dá)分析圖； 圖9是樣品3提取的RNA全基因組基因表達(dá)分析圖； 圖10是樣品4提取的RNA全基因組基因表達(dá)分析圖； 圖11是樣品5提取的RNA全基因組基因表達(dá)分析圖； 圖12是樣品1提取的DNA全基因組拷貝數(shù)變異分析圖； 圖13是樣品2提取的DNA全基因組拷貝數(shù)變異分析圖； 圖14是樣品3提取的DNA全基因組拷貝數(shù)變異分析圖； 圖15是樣品4提取的DNA全基因組拷貝數(shù)變異分析圖； 圖16是樣品5提取的DNA全基因組拷貝數(shù)變異分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0011] 一 ·主要材料及設(shè)備 本發(fā)明所采用的樣品為經(jīng)過一次細(xì)針（7#)穿刺得到的活檢材料。
[0012] TRIzol-Invitrogen 公司。
[0013] 細(xì)胞裂解液的成分為：三羥甲基氨基甲烷（Tris)終濃度為100 mmol/L、乙二胺四 乙酸（EDTA)終濃度為500 mmol/L、氯化鈉（NaCl)終濃度為20 mmol/L、十二烷基硫酸鈉 (SDS)終濃度為10%、胰RNA酶終濃度為20ug/ml。
[0014] TE溶液的成分為：三羥甲基氨基甲烷（Tris)終濃度為10 mmol/L、乙二胺四乙酸 (EDTA)終濃度為 I mmol/L。
[0015] 酚：氯仿：異戊醇混合溶液的體積比為25:24:1。
[0016] 氯仿：異戊醇混合溶液的體積比為24:1。
[0017] 渦旋混合器一美國(guó)伯樂公司BR-2000。
[0018] 離心機(jī)一德國(guó)艾本德公司5804R。
[0019] 二· DNA和RNA提取方法 使用一次細(xì)針穿刺活檢材料提取基因組DNA和RNA的方法，步驟如下： a. 將細(xì)針穿刺活檢材料全部置于150?300 ul細(xì)胞裂解液中，在室溫孵育5? 18min ； b. 使用渦旋混合器對(duì)上述混合物進(jìn)行渦旋混勻1?3 min，靜置1?5min，本操作重復(fù) 2?6次； c. 取1/4體積的細(xì)胞裂解液混合物用于分離RNA ; d. 剩余細(xì)胞裂解液混合物用于分離DNA ; 所述步驟c中分離RNA的步驟為： I .向50ul細(xì)胞裂解液混合物中加入0. 5?2 ml TRIzol，用渦旋混合器進(jìn)行勻漿處 M Imin ； II .將勻漿樣品在室溫下放置2?8min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離； III ·向勻漿樣品中加入0. 1?0. 4 ml的氯仿，劇烈振蕩10?22s，室溫放置2?6min ; IV . 2?8°C的條件下8500?12000 Xg離心9?30min，吸取上層水相中的液體； V .把水相中的液體轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入0. 2?0. 8 ml的異丙醇沉淀水相中的 RNA，室溫放置7?20min ; VI · 2?8°C的條件下8500?12000 Xg離心9?30min，棄掉上清液； W ·至少加入Iml 75%乙醇洗滌RNA沉淀；在2?8°C，離心力不超過7500 X g的條件 下離心3?IOmin,棄掉上清液； VDI ·室溫放置5?10min，加入10?30 μ 1無 RNase的水、0. 5% SDS或100%的去離子 甲酰胺溶液，用移液器吸打幾次，55?60°C放置7?20min使RNA溶解，-70°C保存?zhèn)溆茫?所述步驟d中分離DNA的步驟為： I .取剩余裂解液混合物轉(zhuǎn)入離心管中，加入500 μ g/ml蛋白酶K 15?25 μ 1，混勻； 在60?70°C恒溫水浴鍋中水浴25?55min，或37°C水浴12?24h，間歇振蕩離心管3? 5次，13400 Xg離心3?9min，吸取上清液到新離心管中； II .加入340 μ 1的異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻； III ·加入510 μ 1的酚：氯仿：異戊醇混合溶液振蕩混勻，13400 X g離心3?9min ; IV .取上層溶液至一個(gè)新離心管，加入500 μ 1的氯仿：異戊醇混合溶液，振蕩混勻， 13400 X g 離心 2 ?8min ; V ·取上層溶液至一個(gè)新離心管，加入250 μ 1的7. 5mol/L乙酸氨，再加入Iml的無水 乙醇，混勻，室溫沉淀1?6min，13400 X g離心6?15min ; VI .棄掉上清液，除去管壁上的殘余液體； VD ·用1?2 ml 70%乙醇洗漆沉淀物1?3次，13400 Xg離心3?9min ; VDI.棄掉上清液，除去管壁上的殘余液體； IX .加25?40 μ I TE溶液重新溶解沉淀物，置于4°C或-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 三·結(jié)果 1.所提取的RNA樣本檢測(cè) (I) RNA樣本濃度和純度檢測(cè) 使用本發(fā)明所述方法分離的RNA總量在140?420 ng之間，濃度在10?30 ng/ul之 間，OD 260/280 比值在 1.8 ?2. 2 之間（NanoDrop 8000，Thermo Scientific 公司），參見 表1。

【權(quán)利要求】
1. 一種一次細(xì)針穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法，步驟如下： a. 將一次細(xì)針穿刺材料置于細(xì)胞裂解液中，室溫孵育； b. 使用渦旋混合器對(duì)上述混合物進(jìn)行渦旋混勻，靜置，重復(fù)渦旋混勻和靜置步驟； c. 取1/4體積的細(xì)胞裂解液混合物用于分離RNA ; d. 剩余細(xì)胞裂解液混合物用于分離DNA ; 所述步驟c中分離RNA的步驟為： I .向細(xì)胞裂解液混合物中加入TRIzol，用渦旋混合器作勻漿處理，室溫靜置，再加入 氯仿，振蕩，室溫靜置； II .低溫條件下離心，吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，室溫靜置； III.低溫條件下離心，棄掉上清液，加入75%乙醇洗滌RNA沉淀； IV .在低溫、低離心力條件下離心，棄掉上清液，室溫靜置，加入無RNase的水、0. 5% 十二烷基磺酸鈉或100%的去離子甲酰胺溶液，懸浮沉淀，充分溶解RNA，-70°C保存?zhèn)溆茫? 所述步驟d中分離DNA的步驟為： I .向剩余裂解液混合物中加入蛋白酶K，混勻，水浴，振蕩，離心，吸取上清液； Π .加入異丙醇，混勻，再加入酚：氯仿：異戊醇混合溶液，混勻，離心； III.取上層溶液加入氯仿：異戊醇混合溶液，混勻，離心； IV .取上層溶液加入乙酸氨，再加入無水乙醇，混勻，室溫靜置，離心； V .棄掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，離心； VI.棄掉上清液及管壁殘液，加入TE溶液重新溶解沉淀物，置于4°C或-20°C保存?zhèn)?用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一次細(xì)針穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法，其特征在 于：所述步驟b中潤(rùn)旋混勻1?3min，靜置1?5min，重復(fù)操作2?6次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一次細(xì)針穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法，其特征在 于：所述細(xì)胞裂解液的成分為：三羥甲基氨基甲烷100 mm〇l/L、乙二胺四乙酸500 mmol/L、 氯化鈉20 mmol/L、十二烷基硫酸鈉10%、胰RNA酶20ug/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一次細(xì)針穿刺材料提取基因組DNA和RNA的方法，其特征在 于：所述步驟c，IV中離心力不超過7500Xg。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104293772SQ201410621555
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】王萬恒, 陳曉瑞 申請(qǐng)人:天津邁安診生物技術(shù)有限公司, 天津諾凱生物技術(shù)有限公司