一種診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA標(biāo)志物及其在制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。通過(guò)定量PCR的方法檢測(cè)被測(cè)者血中的microRNA-29家族的含量，并與正常microRNA水平比較來(lái)診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤，該神經(jīng)膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物microRNA靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作方便，安全無(wú)創(chuàng)傷及易于大量篩查。
【專利說(shuō)明】-種診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種將血中的microRNA作為生物標(biāo)記 物用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫 瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半，廣義是指所有神經(jīng)上皮來(lái)源的腫瘤，狹義是指源于各類 膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO) 1999年的分類方案分為星形細(xì)胞瘤、少支膠質(zhì) 瘤、室管膜瘤、混合性膠質(zhì)瘤、脈絡(luò)叢瘤、來(lái)源不肯定的神經(jīng)上皮組織瘤、神經(jīng)元及神經(jīng)元神 經(jīng)膠質(zhì)混合瘤、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、胚胎性腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤。
[0003] 目前的診斷和篩查在結(jié)合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，診斷有賴于神經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢 查。但是神經(jīng)影像學(xué)檢查依賴于儀器且價(jià)格高，病理學(xué)檢查雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但是屬于侵入性 的，有帶來(lái)后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)。價(jià)格便宜、方便快捷和安全的早期診斷和篩查是神經(jīng)膠質(zhì)瘤遇到 的最主要問(wèn)題，往往有臨床表現(xiàn)以及發(fā)現(xiàn)神經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)異常時(shí)已經(jīng)太晚，其五年生 存率只有3%。
[0004] 因此，臨床上迫切需要一個(gè)非常準(zhǔn)確的、價(jià)格便宜、方便快捷的能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷 或者篩查的分子標(biāo)記物。遺憾的目前為止，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷和篩查方面尚未找到可 信的分子標(biāo)記物。盡管methylguanine methyl transferase、PTEN/MMACl已經(jīng)被人們提出 來(lái)作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期診斷和篩查的標(biāo)記物，但是目前看來(lái)這些標(biāo)記物在特異性、準(zhǔn)確性 等方面都不盡如人意（McNamara MG, Sahebjam S, Mason WP(2013)Emerging biomarkers in glioblastoma. Cancer5(3):1103 - 1119. doi:10. 3390/cancers5031103)。
[0005] MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編 碼RNA，其大小長(zhǎng)約20?25個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列 核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù) 合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途 徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。
[0006] 最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，大約50 %得到注解的miRNAs在基 因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)（fragile site)。這說(shuō)明miRNAs在腫瘤發(fā)生過(guò)程中 起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員 將 miRNA 命名為 "oncomirs"。
[0007] 已經(jīng)有研究認(rèn)為miRNA可以作為一種潛在的腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和診斷的標(biāo)記物，而且 miRNA在血清、血楽、尿液等體液中是穩(wěn)定的，使得其作為腫瘤標(biāo)記物的可能性又進(jìn)一步加 大，而且隨著目前技術(shù)的進(jìn)步，miRNA檢測(cè)技術(shù)越來(lái)越方便、快捷和價(jià)格低廉。
[0008] 在已經(jīng)報(bào)道的miRNA當(dāng)中，microRNA-29的高表達(dá)已經(jīng)被認(rèn)為與某些腫瘤的發(fā)生 發(fā)展相關(guān)，比如與結(jié)直腸癌，其靈敏度和精確度分別是69.0 %和89. 1 % (Huang Z，Huang D, Ni S1Peng Z1Sheng ff, Du X(2010)Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer.Int J Cancer J Int Cancer 127 (I):118-126. doi :10. 1002/ijc. 25007)。再比如在急性白血病中，microRNA-29的高表達(dá)與其發(fā)生 發(fā)展相關(guān)，其靈敏度和優(yōu)化之后的精確度分別為86. 7%和95.0% (Wang F et al.，2012. miR_29a and miR-142_3p downregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia. Mol Biol R印 39 (3) :2713 - 2722. doi :10. 1007/sll033-011-1026-5)。
[0009] 但是由于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的組織特異性，在另外一些腫瘤當(dāng)中出現(xiàn)了 microRNA-29 家族低表達(dá)的情況，在這些腫瘤當(dāng)中，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是與microRNA-29家族的低表達(dá)相 關(guān)的，這些腫瘤包括肝癌（SU et al·· MicroRNA-101, down-regulated in hepatocellular carcinoma, promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity. Cancer Res 2009 ； 69:1135-1142.)、乳腺癌（Iorio MV, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 2005;65:7065-7070·)、慢性白血病（Pekarsky Y，et al.Tcllexpression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR_29and miR-181. Cancer Res 2006 ；66:11590 - 11593.)〇
[0010] 尤其是在白血病當(dāng)中，急性和慢性白血病中microRNA-29家族扮演了截然相反的 角色。因此，在特定的腫瘤當(dāng)中microRNA-29家族扮演的角色如何，沒有現(xiàn)成的答案、也無(wú) 法由其他腫瘤的結(jié)果給出教導(dǎo)和啟示，需要深入的開展特異性的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種用于檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其分期的 microRNA標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)被測(cè)者血清或者血漿中microRNA-29家族的含量，并與正常人 群血清或者血楽中的microRNA-29家族的水平進(jìn)行比較來(lái)診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤，該microRNA的 靈敏度和精確度高；通過(guò)microRNA-29家族的水平高低差異可以區(qū)分早期和晚期腫瘤。
[0012] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是：一種篩查和診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其分期的 microRNA 標(biāo)志物，所述標(biāo)志物為 microRNA-29 家族（包括 miR-29a、miR-29b 和 miR-29c)， miR-29a、miR-29b 和 miR-29c 的序列分別如序列表序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：篩查出的microRNA標(biāo)志物作為用于檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的精 確度和靈敏度高。
[0014] 更進(jìn)一步的，在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0015] 本發(fā)明還包括一種診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA標(biāo)志物在制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷試 劑中的用途。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1與內(nèi)參microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的歸一化水平
[0017] Control指正常人群，WHO I-II指早期神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，WHO III-IV指晚期神 經(jīng)膠質(zhì)瘤患者。顯著性差異含義為，P〈0.05，*P〈0.01，〃P〈0.005。早期患者（WHO I-II)與正常（Control)比較〃 Ρ〈0·01，為極顯著性差異。晚期患者（WHO III-IV)與正 常（Control)比較〃 w Ρ〈0· 005,為極顯著性差異。早期患者（WHO I-II)與晚期患者（WHO ΙΙΙ-?ν)比較Wp〈0. 05,為顯著性差異。
[0018] 圖2神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清miR-29家族的ROC曲線（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲線下面積（areas under the curve, AUC)圖中 顯示了早期患者（WHO 1-11)、晚期患者（WHO III-IV)和所有患者（WHO I-IV)的ROC曲線、 曲線下面積、靈敏度（Sensitivity)和準(zhǔn)確度（Specificity)。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，所列舉的實(shí)施例僅僅是用來(lái)解釋本發(fā)明，并非 用于限制本發(fā)明的范圍。
[0020] 實(shí)施例1臨床血清標(biāo)本microRNA-29家族的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病的相關(guān)性研究
[0021] 一、材料與標(biāo)本收集描述
[0022] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清標(biāo)本收集至來(lái)自臨床的處于不同分期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者， 合計(jì)83例。正常人群的血清標(biāo)本收集至來(lái)自正常健康人群，合計(jì)69例。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 診斷是通過(guò)組織病理學(xué)或者磁共振成像來(lái)確認(rèn)的，標(biāo)準(zhǔn)是基于WHO的分類；神經(jīng)膠質(zhì)瘤的 分期是根據(jù) WHO 和 TNM 的分類標(biāo)準(zhǔn)（Sobin LH, Fleming ID, 1997. TNM classification of malignant tumors, fifth edition (1997). Union Internationale contre Ie cancer and the American joint committee on cancer. Cancer 80 (9) : 1803 - 1804)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤患 者在取血之前沒有經(jīng)過(guò)外科手術(shù)、化療或者放療等任何抗腫瘤方面的治療。每個(gè)樣本用 PAXgene Blood RNA tubes (BD Biosciences, Basel, Switzerland)合計(jì)收集 IOml 血液。
[0023] 二、樣品處理和RNA提取
[0024] 血液在凝血之后，在500 X g、4攝氏度下離心60分鐘之后取上層血清保存于-80攝 氏度下備用。血清中的 RNA通過(guò)MiRNeasy Kit (Qiagen GmbH, Hombrechtikon, Switzerland) 按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行提取和純化。
[0025] 三、定量 PCR
[0026] 定量 PCR 實(shí)驗(yàn)參照 W Wei 等人的方法（Wei W, et al. · miR_29targets Akt3to reduce proliferation and facilitate differentiation of myoblasts in skeletal muscle development. Cell Death and Disease(2013)4, e668 ；doi:10. 1038/ cddis. 2013. 184)。血清中 microRNA-29 家族表達(dá)的高低通過(guò) Ct 值（Cycle threshold)來(lái) 評(píng)估，計(jì)算方法是2_ΛΛα。本實(shí)驗(yàn)中microRNA-24作為內(nèi)參，microRNA-29家族的Ct值通 過(guò)內(nèi)參microRNA-24的量來(lái)歸一化。每個(gè)樣本做三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0027] 四、統(tǒng)計(jì)分析方法
[0028] 顯著性差異用 t 檢驗(yàn)（student，s t test)、Mann - Whitney 檢驗(yàn)（Mann - Whitney test)和 x 檢驗(yàn)（xtest)。ROC 曲線（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲線下面積（areas under the curve, AUC)被用作為預(yù)測(cè)miR-29家族在神經(jīng)膠 質(zhì)瘤中標(biāo)記物的指標(biāo)。優(yōu)化的靈敏度和精確度根據(jù)檢驗(yàn)前概率（pre-test probability) 和由ROC獲得的值比（cost ratio)來(lái)計(jì)算獲得。所用的統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 19. 0,當(dāng)P值小 于0. 05時(shí)認(rèn)為顯著。
[0029] 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0030] l、miR-29家族在早晚等各期神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者及正常人群中的表達(dá)
[0031] 如圖1所示，與內(nèi)參microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的歸一化水平在 所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤組和正常人群組之間都有顯著性差異（p〈0. 01)。而且晚期患者組和正常人 群組之間有極顯著性差異（P〈〇. 005)。再比較早期患者和晚期患者組，組間也有顯著差異 (Ρ〈0· 05)。
[0032] 2、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-29家族的水平作為生物標(biāo)記物的預(yù)測(cè)值
[0033] 不同分期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清miR-29家族作為生物標(biāo)記物的預(yù)測(cè)表現(xiàn)通過(guò) ROC曲線（圖2)可知。所有階段（I-IV期）的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清miR-29家族作為生物 標(biāo)記物的預(yù)測(cè)表現(xiàn)是中等的，其AUC為0. 74(95% CI，0. 67 - 0. 82)，優(yōu)化的靈敏度和準(zhǔn)確 度分別為68. 5%和77. 3%。晚期患者血清miR-29家族作為生物標(biāo)記物的預(yù)測(cè)表現(xiàn)是最佳 的，AUC高達(dá)0. 81 (95% Cl, 0. 73 - 0. 89)。早期患者血清miR-29家族作為生物標(biāo)記物的預(yù) 測(cè)表現(xiàn)尚可，AUC 為 0· 66(95% Cl, 0· 58 - 0· 76)。
[0034] 六、結(jié)論
[0035] 1、血中miR-29家族的水平可以作為生物標(biāo)記物來(lái)篩查和診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤；
[0036] 2、血中miR-29家族的水平可以作為生物標(biāo)記物來(lái)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行分期。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物，其特征為，所述microRNA分子標(biāo) 記物為microRNA-29家族。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物，其特征為， 所述 microRNA-29 家族包括 microRNA_29a、microRNA_29b 和 microRNA_29c。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物，其特征為， 所述 microRNA-29a、microRNA-29b 和 microRNA-29c 的序列分別為 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
4. 權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的一種用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物在 制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷試劑中的用途。
5. 權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的一種用于診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的microRNA分子標(biāo)記物在 制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤早晚期分期診斷試劑中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313171SQ201410621604
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】吳俊華, 江春平 申請(qǐng)人:南京大學(xué)