一種用于檢測pdgfra基因熱點(diǎn)突變的引物、探針、鎖核苷酸探針、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測PDGFRA基因突變的引物、探針、鎖核酸探針、試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述引物和探針，所述引物和所述探針包括用于檢測所述PDGFRA基因的第12號外顯子和第18號外顯子中的至少一種，所述引物包括：正向引物和反向引物。所述試劑盒包括：上述引物和探針。本發(fā)明提供的引物和探針能夠高靈敏地檢測出PDGFRA基因是否發(fā)生突變，同時(shí)，采用鎖核酸探針可以大大提高了檢測PDGFRA基因突變的靈敏度，采用本發(fā)明提供的試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測PDGFRA基因是否突變。
【專利說明】-種用于檢測PDGFRA基因熱點(diǎn)突變的引物、探針、鎖核苷 酸探針、試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測roGFRA基因突變的引物、探 針、鎖核苷酸探針、試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 血小板源性生長因子受體a多膚（platelet-derivedgrowthfactorreceptor alpha，H)GFRA)是一種單鏈跨膜蛋白，屬III型酪氨酸蛋白激酶家族。最常見的H)GFRA突 變位點(diǎn)是編碼位于第二酪氨酸激酶區(qū)活化環(huán)的區(qū)域（exonlS)，少數(shù)突變發(fā)生在近膜區(qū) (exonl2)，突變引起TOGFRA蛋白的功能改變，通常會導(dǎo)致非配體依賴性的二聚體形成、酪 氨酸殘基自主磷酸化及下游信號的激活。這種激活導(dǎo)致的最終結(jié)果是腫瘤的發(fā)生。
[0003] 現(xiàn)有的檢測F^GFRA基因突變的方法有Sanger測序法，但采用Sanger測序法檢測 TOGFRA基因突變時(shí)，其檢測靈敏度低，不能準(zhǔn)確檢測出TOGFRA基因是否發(fā)生突變，使用者 迫切需要一種高靈敏度的檢測方法替換Sanger測序法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測roGFRA基因突變的方法的靈敏度低的問題，本發(fā)明實(shí) 施例提供了一種用于檢測TOGFRA基因突變的引物、探針、鎖核苷酸探針、試劑盒及檢測方 法。所述技術(shù)方案如下：
[0005] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測TOGFRA基因突變的引物和探針，所述 用于檢測TOGFRA基因突變的引物和探針包括用于檢測所述TOGFRA基因的第12號外顯子 的引物和探針、以及用于檢測所述TOGFRA基因的第18號外顯子的引物和探針中的至少一 種，所述引物包括：正向引物和反向引物，其中，
[0006] TOGFRA基因第12號外顯子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0007] TOGFRA基因第12號外顯子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0008] TOGFRA基因第12號外顯子的探針如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0009] TOGFRA基因第18號外顯子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0010] TOGFRA基因第18號外顯子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0011] TOGFRA基因第18號外顯子的探針如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0012] 所述探針的5'端均連接有FAM熒光基團(tuán)，所述探針的3'端均連接有BHQ淬滅基 團(tuán)。
[0013] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測roGFRA基因突變的鎖核酸探針，所 述鎖核酸探針包括：
[0014] roGFRA基因第12號外顯子突變類型為V561D的鎖核酸探針如序列表中SEQID NO. 7所示；
[0015] TOGFRA基因第18號外顯子突變類型為D842V的鎖核酸探針如序列表中SEQID NO. 8所示；
[0016] 所述鎖核酸探針的3'端均連接有PCM基團(tuán)。
[0017] 再一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測TOGFRA基因突變的試劑盒，所述試 劑盒包括：上述的引物和探針。
[0018] 具體地，所述試劑盒還包括：如權(quán)利要求2所述的鎖核酸探針。
[0019] 具體地，所述試劑盒還包括：PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、測序反應(yīng)液、 消化酶系和測序PCR產(chǎn)物純化試劑。
[0020] 具體地，所述PCR反應(yīng)液包括：含Mg2+的5XPCR緩沖液5iil、2. 5mmol/LdNTPs 1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0021] 具體地，所述消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
[0022] 具體地，所述測序反應(yīng)液包括：3iimol/L所述TOGFRA基因第12號外顯子的正向 弓丨物1111、311111〇1/1所述？06?狀基因第18號外顯子的正向引物1111、0.31115\81 8(^ 和 0? 45ii1 2. 5XBuffer。
[0023] 具體地，所述測序PCR產(chǎn)物純化試劑包括0. 75mol/LNaCl和納米磁珠。
[0024] 又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測TOGFRA基因突變的方法，采用上述的試 劑盒，所述方法包括：
[0025] 提取樣本的基因組DNA;
[0026] 以獲得的所述基因組DNA作為所述模板DNA，采用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0027] 對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0028] 將所述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行測序PCR擴(kuò)增，得到測序PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[0029] 將所述測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0030] 將純化后的所述測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析，并與所述TOGFRA基因?qū)?yīng)的野生型 進(jìn)行測序分析對比，判定所述樣本中的所述TOGFRA基因是否發(fā)生突變。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的引物和探 針能夠高靈敏地檢測出TOGFRA基因是否發(fā)生突變，同時(shí)，鎖核酸（Lockednucleicacid， LNA)是一種人工合成的反義寡核苷酸，其結(jié)構(gòu)中0 -D-呋喃核糖的2' -0,4' -C位通過不同 的縮水作用形成環(huán)形的氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋剛性縮合結(jié)構(gòu)，環(huán)形橋鎖定 了呋喃糖C3' -內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性，因此對DNA、RNA有很好的識別能力和強(qiáng)大的親和力，且不易被酶解。將鎖核酸作為探 針與RNA/DNA鏈結(jié)合的復(fù)合體具有很高的熱穩(wěn)定性，但又對堿基錯配敏感，一個堿基的錯 配可使RNA/DNA的熔解溫度（Tm值）較大幅度地下降，采用鎖核酸探針可以大大提高了檢 測TOGFRA基因突變的靈敏度。本發(fā)明提供的試劑盒包括本發(fā)明實(shí)施例提供的引物、探針以 及鎖核酸探針，使得本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒具有高靈敏度。本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測 方法，能夠準(zhǔn)確檢測TOGFRA基因是否突變，同時(shí)，對待測樣本的基因片段采用熒光PCR進(jìn)行 擴(kuò)增，擴(kuò)增情況可以通過擴(kuò)增曲線和Ct值判斷，通過加入鎖核酸探針，在PCR過程中對突變 型樣本進(jìn)行富集，能顯著提高突變型的檢測靈敏度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用堿性磷酸酶和核酸外 切酶進(jìn)行消化，這能有效去除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中殘留的dNTP、引物和單鏈DNA等，省去了凝膠 電泳的步驟，不但節(jié)省了時(shí)間還避免了污染，此外，本發(fā)明實(shí)施例采用磁珠法對測序PCR產(chǎn) 物進(jìn)行純化，與傳統(tǒng)的乙醇/醋酸鈉法相比操作簡單快捷、對設(shè)備要求簡單（只需一個磁力 架）、純化結(jié)果穩(wěn)定，得到的測序峰圖干凈清晰、無染料峰。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0033] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例四提供的TOGFRA基因第12號外顯子V561D突變型的測序峰 圖；
[0034] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例四提供的TOGFRA基因第18號外顯子D842V突變型的測序峰 圖；
[0035] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例四提供的加入了鎖核酸探針后檢測TOGFRA基因18號外顯子 的測序峰圖；
[0036] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例四提供的未加入鎖核酸探針后檢測TOGFRA基因18號外顯子 的測序峰圖；
[0037] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例四提供的擴(kuò)增曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一 步地詳細(xì)描述。
[0039] 實(shí)施例一
[0040] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測TOGFRA基因突變的引物和探針，用于檢測 TOGFRA基因突變的引物和探針包括用于檢測TOGFRA基因的第12號外顯子的引物和探針、 以及用于檢測TOGFRA基因的第18號外顯子的引物和探針中的至少一種，該引物包括：正向 引物和反向引物，其中，
[0041] TOGFRA基因第12號外顯子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0042] TOGFRA基因第12號外顯子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0043] TOGFRA基因第12號外顯子的探針如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0044] TOGFRA基因第18號外顯子的正向引物如序列表中SEQIDNO. 4所示；
[0045] TOGFRA基因第18號外顯子的反向引物如序列表中SEQIDNO. 5所示；
[0046] TOGFRA基因第18號外顯子的探針如序列表中SEQIDNO. 6所示；
[0047] 探針的5'端均連接有FAM熒光基團(tuán)，探針的3'端均連接有BHQ淬滅基團(tuán)。
[0048] 本發(fā)明實(shí)施例提供的引物和探針具有高靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測TOGFRA基因是否 發(fā)生突變。
[0049] 實(shí)施例二
[0050] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測TOGFRA基因突變的鎖核酸探針，改鎖核酸探 針包括：
[0051] H)GFRA基因第12號外顯子突變類型為V561D的鎖核酸探針如序列表中SEQID NO. 7所示；
[0052] TOGFRA基因第18號外顯子突變類型為D842V的鎖核酸探針如序列表中SEQID NO. 8所示；
[0053] 鎖核酸探針的3'端均連接有P04基團(tuán)。
[0054] 本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測TOGFRA基因突變的鎖核酸探針，鎖核酸（Locked NucleicAcid，LNA)是一種人工合成的反義寡核苷酸，其結(jié)構(gòu)中P-D-呋喃核糖的2'-0， 4'-C位通過不同的縮水作用形成環(huán)形的氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋剛性縮合結(jié) 構(gòu)，環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3'-內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架 局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此，鎖核酸對DNA和RNA均具有很好的識別能力和強(qiáng)大的親和力，且 不易被酶解，將鎖核酸作為探針與RNA/DNA鏈結(jié)合的復(fù)合體具有很高的熱穩(wěn)定性，但又對 堿基錯配敏感，一個堿基的錯配可使RNA/DNA的熔解溫度（Tm值）較大幅度地下降，通過加 入鎖核酸探針，在PCR過程中對突變型樣本進(jìn)行富集，進(jìn)一步提高突變型的檢測靈敏度，采 用鎖核酸探針可以大大提高檢測TOGFRA基因突變的靈敏度，同時(shí)，PDGFRA基因檢測的樣本 多來源于胃腸道間質(zhì)瘤的病變細(xì)胞組織，該組織中往往含有正常細(xì)胞，影響檢測，本發(fā)明實(shí) 施例采用與野生型基因序列匹配的鎖核酸，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，鎖核酸能夠與野生型序列 結(jié)合，從而阻滯PCR延伸，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，而鎖核酸不能與突變型序列結(jié)合，使得TOGFRA 基因突變型得到擴(kuò)增，從而提高了TOGFRA基因突變的檢出率。
[0055] 實(shí)施例三
[0056] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測TOGFRA基因突變的試劑盒，該試劑盒包括：本發(fā) 明實(shí)施例一提供的引物和探針、本發(fā)明實(shí)施例二提供的鎖核酸探針、PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì)控 品、陰性質(zhì)控品、測序反應(yīng)液、消化酶系和測序PCR產(chǎn)物純化試劑。
[0057] 具體地，在試劑盒中，10iimol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各 0? 75iil，10iimol/L探針各 0? 5iil，10iimol/L鎖核酸探針各 0? 5ill。
[0058] 具體地，PCR反應(yīng)液包括：含Mg2+的5XPCR緩沖液5iU、2. 5mmol/L dNTPsl. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2ii1。
[0059] 具體地，消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸外切酶I，且堿性磷酸酶和核酸外切酶 I的酶活力比為2:5。
[0060] 具體地，測序反應(yīng)液包括：3iimol/LTOGFRA基因第12號外顯子的正向引物liil、 3iimol/LPDGFRA基因第 18 號外顯子的正向引物liil、0.3iil5XBigdye和 0.45iil 2. 5XBuffer。該測序反應(yīng)液用于檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0061] 具體地，測序PCR產(chǎn)物純化試劑包括0. 75MNaCl和納米磁珠。
[0062] 具體地，陰性質(zhì)控品為含TOGFRA野生型基因片段的重組質(zhì)粒。
[0063] 具體地，陽性質(zhì)控品為含有TOGFRA突變型基因片段的重組質(zhì)粒。
[0064] 本發(fā)明提供的用于檢測TOGFRA基因突變的試劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒包括本 發(fā)明實(shí)施例提供的引物、探針以及鎖核酸探針，使得該試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測TOGFRA基因是 否發(fā)生突變，通過加入鎖核酸探針，在PCR過程中對突變型樣本進(jìn)行富集，進(jìn)一步提高突變 型的檢測靈敏度。
[0065] 實(shí)施例四
[0066] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種檢測H)GFRA基因突變的方法，采用本發(fā)明實(shí)施例三提供 的試劑盒，具體檢測方法如下：
[0067] 1、提取樣本的基因組DNA
[0068] 樣本收集：用石蠟包埋病理切片組織，且該切片中含有胃腸道間質(zhì)瘤的病變細(xì) 胞，為了保證病理切片組織含有足夠比例的胃腸道間質(zhì)瘤的病變細(xì)胞，需要加同一組織的HE(Hematoxylin-Eosin)染色片子一張（在顯微鏡下腫瘤細(xì)胞的比例> 70% )。選用石錯 DNA提取試劑盒QIAGENQIAampDNAFFPETissueKit(CatN0. 56404)，對新鮮組織按照石 蠟樣本提取步驟進(jìn)行，但無需加入二甲苯處理步驟，操作步驟詳見該石蠟DNA提取試劑盒 說明書，提取的樣本的基因組DNA采用紫外分光光度計(jì)測定濃度及質(zhì)量，測量0D260/0D280 結(jié)果在1. 8?2. 0之間，提取的樣本的基因組DNA濃度在20ng/iil以上。
[0069] 其中，病理切片組織來源于胃腸道間質(zhì)瘤患者的病變組織，經(jīng)脫水處理后用石蠟 包埋，切片后作為待檢樣本（該胃腸道間質(zhì)瘤患者的病變組織的TOGFRA基因的第12號外 顯子和第18號外顯子均發(fā)生了突變）。
[0070] 樣本用量：每例石蠟包埋病理切片切5張，每張切片的厚度為8?10iim，胃腸道 間質(zhì)瘤的病變細(xì)胞的區(qū)域大于5_X5mm，連續(xù)切片，封存于1. 5ml離心管中。
[0071] 樣本質(zhì)量：為確保樣本的基因組DNA提取的成功率，選擇1年以內(nèi)的石蠟標(biāo)本。
[0072] 2、PCR擴(kuò)增
[0073] 準(zhǔn)備2個PCR反應(yīng)管，用微量加樣器在每一個PCR反應(yīng)管內(nèi)加入引物、探針、鎖 核酸探針和PCR反應(yīng)液，其中，10ymol/L正向引物各0? 75iil，10iimol/L反向引物各 0. 75iil，10iimol/L探針各0. 5iil，10iimol/L鎖核酸探針各0. 5iil，PCR反應(yīng)液包括：含 Mg2+的 5XPCR緩沖液 5ii1、2. 5mmol/LdNTPs1. 5ii1、5U/ii1Taq酶 0? 2ii1 和 20ng/ii1 的模板DNA2iil，補(bǔ)水至23iU，其中，2個PCR反應(yīng)管分別對應(yīng)TOGFRA基因的第12號外 顯子和第18號外顯子，再向PCR反應(yīng)管中加入提取的樣本的基因組DNA、陰性質(zhì)控品和陽 性質(zhì)控品各2iil，蓋緊PCR反應(yīng)管，經(jīng)5000rpm離心數(shù)秒，得到上清液，取該上清液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
[0074] 在熒光PCR儀上設(shè)置以下程序：
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測H)GFRA基因突變的引物和探針，其特征在于，所述用于檢測TOGFRA基 因突變的引物和探針包括用于檢測所述TOGFRA基因的第12號外顯子的引物和探針、以及 用于檢測所述TOGFRA基因的第18號外顯子的引物和探針中的至少一種，所述引物包括：正 向引物和反向引物，其中， PDGFRA基因第12號外顯子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； PDGFRA基因第12號外顯子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； PDGFRA基因第12號外顯子的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； PDGFRA基因第18號外顯子的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 4所示； PDGFRA基因第18號外顯子的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 5所示； PDGFRA基因第18號外顯子的探針如序列表中SEQ ID NO. 6所示； 所述探針的5'端均連接有FAM熒光基團(tuán)，所述探針的3'端均連接有BHQ淬滅基團(tuán)。
2. -種用于檢測TOGFRA基因突變的鎖核酸探針，其特征在于，所述鎖核酸探針包括： TOGFRA基因第12號外顯子突變類型為V561D的鎖核酸探針如序列表中SEQ ID NO. 7 所示； TOGFRA基因第18號外顯子突變類型為D842V的鎖核酸探針如序列表中SEQ ID NO. 8 所示； 所述鎖核酸探針的3'端均連接有P04基團(tuán)。
3. -種用于檢測TOGFRA基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：如權(quán)利要 求1所述的引物和探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：如權(quán)利要求2所述 的鎖核酸探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：PCR反應(yīng)液、陽性質(zhì) 控品、陰性質(zhì)控品、測序反應(yīng)液、消化酶系和測序PCR產(chǎn)物純化試劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括：含Mg2+的5XPCR 緩沖液 5iil、2.5mmol/L dNTPs 1.5iil、5U/iil Taq 酶 0.2iil 和 20ng/iil 的模板 DNA 2 y l〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述消化酶系包括堿性磷酸酶和核酸 外切酶I。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述測序反應(yīng)液包括：3 y mol/L所述 TOGFRA基因第12號外顯子的正向引物liil、3iimol/L所述TOGFRA基因第18號外顯子的 正向引物1以1、0.31115\818(^6和0.451112.5\811打61'。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述測序PCR產(chǎn)物純化試劑包括 0. 75mol/L NaCl和納米磁珠。
10. -種檢測TOGFRA基因突變的方法，采用權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征 在于，所述方法包括： 提取樣本的基因組DNA ; 以獲得的所述基因組DNA作為所述模板DNA，采用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 將所述純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行測序PCR擴(kuò)增，得到測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 將所述測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； 將純化后的所述測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析，并與所述TOGFRA基因?qū)?yīng)的野生型進(jìn)行 對比，判定所述樣本中的所述TOGFRA基因是否發(fā)生突變。
【文檔編號】C12N15/11GK104328182SQ201410604371
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】林佳, 李品, 霍然, 唐景峰 申請人:武漢百泰基因工程有限公司