豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子遺傳標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。以豬STIM1基因第10內(nèi)含子末端序列的一個(gè)T堿基插入/缺失突變作為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明通過制備得到一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其中大白豬的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在其序列的256bp處存在一個(gè)T堿基插入突變；梅山豬的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，在其序列的256bp處不存在一個(gè)T堿基的缺失突變；該突變可顯著影響豬產(chǎn)仔數(shù)性狀。本發(fā)明還公開了該遺傳標(biāo)記的制備方法及其在豬產(chǎn)仔性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。
【專利說明】豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記（遺傳標(biāo)記）制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬產(chǎn)仔數(shù)性 狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。所述的遺傳標(biāo)記克隆自豬SHMl基因。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬的產(chǎn)仔數(shù)是繁殖性狀中重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)收益，提高 豬產(chǎn)仔數(shù)對提高養(yǎng)豬業(yè)的總體經(jīng)濟(jì)效益意義重大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國如果母豬產(chǎn)仔數(shù)每胎提 高1頭，每年將增收190億人民幣的純利（王莉興和魯紹雄，2008)。母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀是一 個(gè)由排卵、受精、著床、胎兒發(fā)育等多個(gè)具有時(shí)間順序特征的組分性狀構(gòu)成的復(fù)合性狀，屬 于遺傳力很低（0.1左右）的數(shù)量性狀，難以用常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行遺傳改良，所以尋找控制 豬繁殖率的主效基因及其遺傳標(biāo)記對提高豬產(chǎn)仔數(shù)具有重要意義。
[0003] STIMl (Stromal interaction molecule 1)基因參與調(diào)節(jié)胞內(nèi) Ca2+濃度，在哺乳 動(dòng)物卵母細(xì)胞中表達(dá)，可能參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和受精過程。STIMl蛋白能感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 內(nèi)鈣庫Ca 2+濃度，從而調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流，參與形成Ca2+釋放激活Ca2+通道（CRAC)，引發(fā)鈣庫 控制的Ca 2+內(nèi)流（SOCE)，調(diào)控膜內(nèi)外的Ca2+濃度，與鈣振蕩相關(guān)（Strange et al.，2007 ; 陳曉芳等，2009 ;高尚邦和李臣鴻，2009)。而卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂激活和成熟，以及受精過 程均受到鈣振蕩的調(diào)節(jié)（李妍等，2007 ;Ajduk et al·，2008)。2009年，Koh等首次報(bào)道 SHMl存在于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中，并且在豬卵母細(xì)胞中SHMl能探測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度，并 觸發(fā)S0CE(K 〇h et al.，2009)。2012年最新研究表明，SHMl在鼠成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá) 量遠(yuǎn)高于未成熟卵母細(xì)胞，且僅在成熟卵母細(xì)胞中才能檢測到SOCE (G0mez-Ferndindez et al.，2012)。小鼠中，精子刺激后，SHMl在小鼠卵母細(xì)胞中迅速遷移，并參與受精過程鈣振 蕩的維持（G0mez-Ferndindez et al.，2009)。在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，STIMl干擾后導(dǎo)致 生殖腺形態(tài)異常，無法正常排卵，也無法受精（Yan et al.，2006)，SHMl是秀麗新小桿線蟲 正常排卵和繁殖力所必須的（Lorin-Nebel et al.，2007)。另外，大量研究報(bào)道SHMl對腫 瘤有抑制作用，如子宮頸癌（Chen et al·，2011)、乳腺癌（McAndrew et al·，2011)、卵巢癌 (Ritchie et al·，2011)等。
[0004] 綜上所述，SHMl基因與動(dòng)物繁殖性能有著密切聯(lián)系，參與調(diào)控卵母細(xì)胞成熟及受 精過程。目前豬SHMl基因?qū)δ肛i產(chǎn)仔數(shù)的影響還未見報(bào)道。因此， 申請人:克隆了豬SHMl 部分基因序列，利用該序列進(jìn)行了多態(tài)性和關(guān)聯(lián)分析等研究，以期獲得與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的 新分子標(biāo)記。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于擴(kuò)增豬STMQ基因的DNA序列，以尋找該基因序列突變位點(diǎn)多 態(tài)性，獲得一種與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，并利用該遺傳標(biāo)記作為豬標(biāo)記輔助選擇。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明獲得了一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，它是豬DHMl基因的部分DNA片段， 其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1(長度為691bp)和SEQ ID NO :2(長度為690bp)所 示。在SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2第256bp處存在一個(gè)T堿基的插入/缺失突變（如圖 3所示），該位點(diǎn)位于豬SHMl基因第10內(nèi)含子與第11外顯子交界處。
[0008] 申請人:提供了一種擴(kuò)增豬SHMl基因部分DNA片段的引物對，該引物對的DNA序 列如 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 所示。
[0009] 申請人:提供了一種篩選豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)基因 SHMl遺傳標(biāo)記的方法，其步驟如 下：
[0010] 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中豬SHMl基因（登錄號(hào)NC_010451. 3)的DNA序列設(shè)計(jì)特異 引物（該引物的序列如序列表SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示），以大白豬、梅山豬、中國 瘦肉豬新品系DVI系（簡稱DVI系，即D4系）豬基因組DNA為模板進(jìn)行降落PCR(Touchdown PCR)擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物回收并克隆測序，得到如序列表SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示 的基因片段。根據(jù)測序結(jié)果篩查DNA序列變異，在256bp處存在一個(gè)T堿基的插入/缺失 突變（突變位點(diǎn)如圖3所示），并在大白豬和DVI系兩個(gè)豬群中進(jìn)行基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀的 關(guān)聯(lián)分析檢測。
[0011] 本發(fā)明為豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供了一個(gè)新的遺傳標(biāo)記。
[0012] 更詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)如《【具體實(shí)施方式】》所述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 序列表SEQ ID NO :1是擴(kuò)增的一個(gè)"大白豬" SHMl基因的核苷酸序列，序列長度 為691bp。在該序列第256堿基處存在一個(gè)T堿基的插入突變。
[0014] 序列表SEQ ID NO :2是擴(kuò)增的一個(gè)"梅山豬" SHMl基因的核苷酸序列，序列長度 為690bp，在該序列第256堿基處不存在一個(gè)T堿基的插入（T堿基缺失突變），是一個(gè)插入 /缺失突變位點(diǎn)。
[0015] 序列表SEQ ID NO :3是擴(kuò)增SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2特異基因片段所用的 上游（正向）引物序列。
[0016] 序列表SEQ ID NO :4是擴(kuò)增SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2特異基因片段所用的 下游（反向）引物序列。
[0017] 圖1 :是本發(fā)明的總體技術(shù)流程圖。
[0018] 圖2:是豬SHMl基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。圖中標(biāo)記說明：泳道1-6分別為大白 豬1、大白豬2、梅山豬1、梅山豬2、DVI系1和DVI系2個(gè)體的擴(kuò)增片段，片段大小為691bp 或 690bp。
[0019] 圖3 :是豬STIMl基因片段核苷酸序列。圖中加粗帶框字母T代表插入/缺失位 置，帶下劃線序列代表引物位置。
[0020] 圖4 :是三種基因型的測序圖譜。缺失堿基T的為麗基因型，插入堿基T的為NN 型，雙峰圖譜的為雜合基因型麗。
[0021] 圖5 :是本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列（大白豬），序列長度為691bp，其中 在第256堿基處存在一個(gè)T堿基的插入突變。
[0022] 圖6 :是本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列（梅山豬），序列長度為690bp，其中 在該序列第256堿基處不存在一個(gè)T堿基的插入（T堿基缺失突變），是一個(gè)插入/缺失突 變位點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1豬SHMl基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立
[0024] 1.豬基因組DNA的提取
[0025] 本發(fā)明的試驗(yàn)豬品種為大白豬、梅山豬和DVI系豬（樣本來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué) 院畜牧獸醫(yī)研究所和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，大白豬為國外血緣豬種、梅山豬為中國地方豬血緣豬 種，DVI系豬為大白豬與通城豬雜交選育的新品種）。豬基因組DNA的提取采用北京百泰克 生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒（按該試劑盒說明書進(jìn)行操作）提取，具體步 驟如下所述：
[0026] (1)采取豬的耳或尾組織，放入2ml的離心管中，加入200 μ 1裂解液TL，用槍頭吹 打均勻；
[0027] (2)加入20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)，劇烈顛倒充分混勻，55°C水浴鍋中消化過夜；
[0028] (3)加入200 μ 1結(jié)合液CB，充分顛倒混勻，70°C放置IOmin ;
[0029] (4)冷卻后加入100 μ 1異丙醇，劇烈顛倒充分混勻；
[0030] (5)用ImL的槍頭吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，IOOOOrpm離心30s，倒掉收 集管中的廢液；
[0031] (6)加入500uL抑制物去除液IR(該試劑盒自帶），12000rpm離心30s，棄廢液；
[0032] (7)加入700 μ 1漂洗液WB，12000rpm離心30s，倒掉廢液；
[0033] (8)重復(fù)操作步驟7 ;
[0034] (9)將吸附柱AC放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量去除漂洗液，以免殘留的 乙醇抑制下游反應(yīng)；
[0035] (10)取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位加 50-100 μ 1洗脫緩沖液EB (該試劑盒自帶），室溫放置3-5min，12000rpm離心lmin，將溶液 收集到離心管中；
[0036] (11)對提取出的DNA的濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測后置于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0037] 2.豬SHMl基因片段的獲得
[0038] (I)PCR 擴(kuò)增
[0039] 根據(jù)豬SHMl基因的基因組序列（GenBank登陸號(hào)：NC_010451. 3)設(shè)計(jì)以下引物 對：
[0040] 上游（正向）引物：5' GCCTTGCCATCCCCTTGA 3'，
[0041] 下游（反向）引物：5'AGAGACCGCCGATACCCC 3'。
[0042] 利用上述引物在大白豬、梅山豬和DVI系豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng) 體系50 μ L，體系中各組分的濃度為IOOng模板DNA、10 Xbuffer (含Mg2+) 4 μ L、上述上下 游引物各 〇·5μΜ、2·5μΜ dNTPs、lU TaqDNA聚合酶。
[0043] PCR的運(yùn)行程序?yàn)椋?5°C預(yù)熱4min ;95°C變性30s，64°C -54°C退火30s (每個(gè)循環(huán) 降低0. 5°C )，72°C延伸40s，共20個(gè)循環(huán)；95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，共15 個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢，結(jié)果見圖2所示。
[0044] (2) PCR產(chǎn)物純化
[0045] 上述PCR產(chǎn)物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行 純化（按照該試劑盒的說明書操作），具體步驟如下：首先從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段 的凝膠，放入I. 5mL離心管，加入400 μ L溶膠液，50-60°C水浴至膠徹底融化，加熱融膠時(shí)， 每2min混勻一次，冷卻至室溫；將離心柱放入收集管中，把混合液移至離心柱，室溫放置 2min ;12000r/min離心lmin，此時(shí)DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中廢液，將離心柱放入同 一個(gè)收集管中，加入700 μ L洗脫液，12000r/min離心Imin ;倒掉收集管中的廢液，12000r/ min離心Imin ;將離心柱放入一預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌I. 5mL離心管中，加入40 μ L洗脫液或雙 蒸水（pH > 7. 0)，室溫或37°C放置2-3min ;12000r/min離心Imin,離心管中的液體即為回 收的DNA片段。
[0046] 3.利用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測分子標(biāo)記
[0047] 將上述獲得的PCR純化產(chǎn)物直接送到北京奧科公司進(jìn)行測序，直接從測序色譜圖 (見圖4)上進(jìn)行基因型分析。
[0048] 實(shí)施例2本發(fā)明制備的遺傳標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性分布檢測應(yīng)用
[0049] 申請人:在大白豬、DVI系、梅山豬3個(gè)群體中檢測了豬SHMl基因兩種等位基因的 分布頻率，檢測結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明：N等位基因頻率在大白豬中較低，僅為18. 97%， DVI系中為40. 19%，在梅山豬中最高，達(dá)56. 25%。這三個(gè)群體中，大白豬、DVI系和梅山豬 平均每胎產(chǎn)仔數(shù)分別為10. 99±1.95頭、11.67±1.77頭和15. 21±3. 14頭。由此可見，產(chǎn) 仔數(shù)越高的群體，N等位基因頻率越高。
[0050] 表1豬SHMl基因兩個(gè)等位基因在不同群體中的分布
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳標(biāo)記，它是豬DTMl基因的部分DNA序列，其中大白豬的遺 傳標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所不，在該序列的第256bp處存在一個(gè)T堿基的插入 突變；梅山豬的遺傳標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，在該序列的第256bp處不存在 一個(gè)T堿基的缺失突變。
2. -種擴(kuò)增豬STIMl基因部分DNA序列的引物對，其特征在于：所述引物對的DNA序 列如下： 上游引物：GCCTTGCCATCCCCTTGA， 下游引物：AGAGACCGCCGATACCCC。
3. -種篩選豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)基因STIMl的遺傳標(biāo)記的方法，其特征在于：按照以下 步驟： 以GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號(hào)NC_010451. 3的豬STMl基因的DNA序列設(shè)計(jì)特異引 物，該引物的序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示；以豬基因組DNA為模板進(jìn)行降落 PCR(Touchdown PCR)擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物回收，將PCR回收產(chǎn)物直接進(jìn)行測序鑒定基因型。
4. 權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記在在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的引物對在豬產(chǎn)仔數(shù)性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313156SQ201410583718
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】吳俊靜, 梅書棋, 彭先文, 喬木, 武華玉, 劉貴生, 李鳳娥, 宋忠旭, 孫華, 李良華, 李明波, 董斌科, 雷彬, 陶虎 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)