產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝，涉及一種基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝。是要解決現(xiàn)有益生菌中蛋氨酸和賴氨酸含量較低，未能有效提高飼料蛋白轉(zhuǎn)化率的技術(shù)問題。制備方法：一、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因片段；二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因片段；三、構(gòu)建pHT43/Zein和pHT43/Cflr重組載體；四、將重組載體pHT43/Zein轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌；五、再轉(zhuǎn)入pHT43/Cflr；即完成。發(fā)酵工藝：一、菌種活化；二、種子培養(yǎng)液制備；三、搖瓶發(fā)酵；四、發(fā)酵罐發(fā)酵；即完成。用于生產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸。
【專利說明】產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝。

【背景技術(shù)】
[0002] 納豆芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌納豆菌亞種，革蘭陽性菌，好氧，有芽孢，極易成鏈。 只具有單層細(xì)胞外膜，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。在極 端的條件下，還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強的內(nèi)源胞子。是各種益生菌當(dāng)中，對環(huán)境耐受力最 好可以直達(dá)小腸的菌種之一，口服后可改變動物腸道菌叢生態(tài)，幫助消化道機能正?；??？?以產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強動物細(xì)胞免疫反應(yīng)。并能生成多種蛋白酶（特別是堿性蛋白 酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物，從而提高飼料的 轉(zhuǎn)化率。
[0003] 納豆芽孢桿菌是一種重要的飼用益生菌，其菌種及發(fā)酵產(chǎn)物能夠作為飼料添加劑 提升畜禽乳肉蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)。在畜禽生產(chǎn)中，蛋氨酸和賴氨酸是最重要的氨基酸，是飼料 成分中對畜禽生產(chǎn)最重要的影響因素，能有效地提高飼料蛋白轉(zhuǎn)化率。益生菌中蛋氨酸和 賴氨酸含量較低，如能提高益生菌中蛋氨酸和賴氨酸的含量，將使益生菌營養(yǎng)更加豐富、更 好地提高飼料蛋白轉(zhuǎn)化率，從而更有效地發(fā)揮益生菌的功用。但目前尚未建立提高益生菌 蛋氨酸和賴氨酸含量的生物技術(shù)，致使益生菌未能最佳地發(fā)揮其提高飼料轉(zhuǎn)化率的功用， 因而有必要建立提高益生菌蛋氨酸和賴氨酸含量的生物技術(shù)，形成更有價值的益生菌新一 代產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是要解決現(xiàn)有益生菌中蛋氨酸和賴氨酸含量較低，未能有效提高飼料蛋白 轉(zhuǎn)化率的技術(shù)問題，提供產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法和發(fā)酵工藝。
[0005] 本發(fā)明產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0006] -、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全長476bp片段；
[0007] 二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因 Cflr全長720bp片段；
[0008] 三、利用枯草芽孢桿菌特異表達(dá)載體pHT43分別構(gòu)建pHT43/Zein和pHT43/Cflr 基因重組載體；
[0009] 四、以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，將重組載體PHT43/ Zein轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體， 涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個 單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs， 采用SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因 mRNA的含量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析， 選擇Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的 重組菌為穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因的納?芽抱桿菌；
[0010] 五、以步驟四獲得的穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納 豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后將pHT43/Cflr轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中 25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體，涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/ mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素，進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行 液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cf Ir基因 mRNA的含 量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇Cf Ir基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法 檢測賴氨酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納 豆芽孢桿菌；
[0011] 步驟四和步驟五中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液配方：每升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液含5gK2HP04、6gKH 2P04、 2gNa2S04、lg 檸檬酸鈉、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和2g谷氨酸鈉，pH7. 5。
[0012] 步驟四熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：
[0013] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0014] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0015] 步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為：
[0016] 上游引物：5' -CCGTCTCGCAGATTAT-3'，
[0017] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3' ；
[0018] 步驟五熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：
[0019] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0020] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0021] 步驟五熒光定量PCR中檢測Cflr基因的引物序列為：
[0022] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3 '，
[0023] 下游引物：5 ' -CTACAGCAGCAACAGC-3 '。
[0024] 上述產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，按以下步驟進(jìn)行：
[0025] -、菌種活化：將上述獲得的穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱 桿菌轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24小時，得到活化的菌種；
[0026] 二、種子培養(yǎng)液制備：將活化的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下 震蕩培養(yǎng)13h，得種子液；
[0027] 三、搖瓶發(fā)酵：將種子液按體積百分比5%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于 37°C、200rpm條件下震蕩培養(yǎng)13h，得發(fā)酵液；
[0028] 四、發(fā)酵罐發(fā)酵：
[0029] 將豆柏和玉米粉分別粉碎至200目，然后將豆柏和玉米粉按照質(zhì)量比1:2混合，將 混合粉末和步驟三獲得的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)混，得預(yù)混料，并添加尿素和硫乙醇酸鈉，然后添加 復(fù)合胰酶，每小時按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的〇. 01 %添加乳糖進(jìn)行動態(tài)補料，發(fā)酵時間為24小 時，即完成發(fā)酵。
[0030] 本發(fā)明獲得轉(zhuǎn)高蛋氨酸和賴氨酸納基因納豆芽孢桿菌及其發(fā)酵工藝，發(fā)酵代謝產(chǎn) 物蛋氨酸和賴氨酸含量分別提高40%和60%以上。
[0031] 納豆芽孢桿菌具有很強的利用小分子氮源和碳源合成限制性必需氨基酸、多種生 長調(diào)節(jié)因子和維生素的能力，以添加劑形式喂飼能夠顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。
[0032] 本發(fā)明方法有效提高了以納豆芽孢桿菌作為益生菌發(fā)酵時代謝產(chǎn)物的蛋氨酸和 賴氨酸含量，顯著提高了納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，菌體發(fā)酵代謝產(chǎn)物作為飼料 添加劑顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為實驗1中穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱桿菌質(zhì)粒經(jīng) XbaI和SmaI雙酶切后的電泳圖；圖2為實驗1中發(fā)酵液上清的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0034] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。

【具體實施方式】 [0035] 一：本實施方式產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，按 以下步驟進(jìn)行：
[0036] -、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全長476bp片段；
[0037] 二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因 Cflr全長720bp片段；
[0038] 三、利用枯草芽孢桿菌特異表達(dá)載體pHT43分別構(gòu)建pHT43/Zein和pHT43/Cflr 基因重組載體；
[0039] 四、以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，將重組載體pHT43/ Zein轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體， 涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個 單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs， 采用SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因 mRNA的含量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析， 選擇Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的 重組菌為穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因的納?芽抱桿菌；
[0040] 五、以步驟四獲得的穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納 豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后將pHT43/Cflr轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中 25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體，涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/ mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素，進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行 液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cf Ir基因 mRNA的含 量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇Cf Ir基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法 檢測賴氨酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納 豆芽孢桿菌；
[0041] 步驟四和步驟五中熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：
[0042] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0043] 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ；
[0044] 步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為：
[0045] 上游引物：5 ' -CCGTCTCGCAGATTAT-3，，
[0046] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3,；
[0047] 步驟五熒光定量PCR中檢測Cflr基因的引物序列為：
[0048] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3，，
[0049] 下游引物：5 ' -CTACAGCAGCAACAGC-3，。
[0050] 所述的納豆芽孢桿菌購自廣州農(nóng)冠生物科技有限公司。

【具體實施方式】 [0051] 二：本實施方式與一不同的是：步驟一中PCR引物為： Fl :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，Rl :5' -TCCCCCGGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'， PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性lmin，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循 環(huán)，72°C再延伸lOmin。其它與一相同。

【具體實施方式】 [0052] 三：本實施方式與一或二不同的是：步驟二中PCR引 物為：F2 :5, -GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3，，R2 :5, -TCCCCCGGGTAAACTAATAAATAGCC (：1'(：1'1^〇：-3'，？〇?循環(huán)反應(yīng)條件為941：預(yù)變性308,941：變性308,551：退火308,721：延伸 3min，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。其它與一或二相同。

【具體實施方式】 [0053] 四：本實施方式與一至三之一不同的是：步驟三中 pHT43/Zein的構(gòu)建方法為：用XbaI和SmaI分別對基因 Zein和載體pHT43進(jìn)行雙酶切，然 后連接酶切產(chǎn)物，獲得重組載體pHT43/Zein。其它與一至三之一相同。

【具體實施方式】 [0054] 五：本實施方式與一至四之一不同的是：步驟三中 pHT43/Cf Ir的構(gòu)建方法為：用XbaI和SmaI分別對基因 Cf Ir和載體pHT43進(jìn)行雙酶切，然 后連接酶切產(chǎn)物，獲得重組載體pHT43/Cflr。其它與一至四之一相同。

【具體實施方式】 [0055] 六：本實施方式與一至五之一不同的是：步驟四和 步驟五中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液配方：每升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液含5gK 2HP04、6gKH2P04、2gNa2S0 4、lg檸檬酸鈉、 0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷氨酸鈉， pH7. 5。其它與一至五之一相同。

【具體實施方式】 [0056] 七：本實施方式產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，按 以下步驟進(jìn)行：
[0057] -、菌種活化：將獲得的穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱桿菌 轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24小時，得到活化的菌種；
[0058] 二、種子培養(yǎng)液制備：將活化的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下 震蕩培養(yǎng)13h，得種子液；
[0059] 三、搖瓶發(fā)酵：將種子液按體積百分比5%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于 37°C、200rpm條件下震蕩培養(yǎng)13h，得發(fā)酵液；
[0060] 四、發(fā)酵罐發(fā)酵：
[0061] 將豆柏和玉米粉分別粉碎至200目，然后將豆柏和玉米粉按照質(zhì)量比1:2混合，將 混合粉末和步驟三獲得的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)混，得預(yù)混料，并添加尿素和硫乙醇酸鈉，然后添加 復(fù)合胰酶，每小時按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的〇. 01 %添加乳糖進(jìn)行動態(tài)補料，發(fā)酵時間為24小 時，即完成發(fā)酵。
[0062] 步驟四所述復(fù)合胰酶購買自重慶奧力生物制藥有限公司，商品名稱為胰酶，按干 燥品計算，每Ig胰酶中含胰蛋白酶不得少于1800活力單位，胰淀粉酶不得少于21000活力 單位，胰脂肪酶不得少于12000活力單位。
[0063] LB液體培養(yǎng)基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和蒸餾水組成。 [0064]

【具體實施方式】八：本實施方式與【具體實施方式】七不同的是：步驟一所述斜面培養(yǎng) 基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，包括蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15?20g、氨芐青霉素 l〇mg、氯霉素5mg和蒸饋水IOOOmL, 121°C高壓滅菌15min。其它與【具體實施方式】七相同。 [0065]

【具體實施方式】九：本實施方式與【具體實施方式】七或八不同的是：步驟四中混合粉 末的質(zhì)量為發(fā)酵液質(zhì)量的10%。其它與【具體實施方式】七或八相同。

【具體實施方式】 [0066] 十：本實施方式與七至九之一不同的是：步驟四中尿 素的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的0. 05%，硫乙醇酸鈉的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的0. 05%，復(fù)合胰酶的 質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的〇. 3%。其它與七至九之一相同。
[0067] 實驗 1 :
[0068] 本實驗產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0069] -、利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全長476bp片段；
[0070] 步驟一中 PCR 引物為：F1 :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，Rl :5' -TCCCCC GGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'，PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 lmin，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。
[0071] 二、利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因 Cflr全長720bp片段；
[0072] 步驟二中 PCR 引物為：F2 :5'-GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3'，R2 :5'-TCCCC CGGGTAAACTAATAAATAGCCCTCTTCCC-3'，PCR 循環(huán)反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 30s，94°C變性 30s， 55°C退火30s，72°C延伸3min，共30個循環(huán)，72°C再延伸10min。
[0073] 三、用XbaI和SmaI分別對基因 Zein和載體pHT43進(jìn)行雙酶切，然后連接酶切產(chǎn) 物，獲得重組載體pHT43/Zein ;用XbaI和SmaI分別對基因 Cflr和載體pHT43進(jìn)行雙酶切， 然后連接酶切產(chǎn)物，獲得重組載體pHT43/Cflr ;
[0074] 四、以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，將重組載體pHT43/ Zein轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體， 涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素， 進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個 單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs， 采用SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因 mRNA的含量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析， 選擇Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的 重組菌為穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因的納?芽抱桿菌；
[0075] 步驟四中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液配方：每升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液含5gK2HP04、6gKH 2P04、2gNa2S04、lg檸 檬酸鈉、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸鈉，pH7. 5。
[0076] 步驟四熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：
[0077] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0078] 下游引物：5, -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3,；
[0079] 步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為：
[0080] 上游引物：5 ' -CCGTCTCGCAGATTAT-3，，
[0081] 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3,；
[0082] 五、以步驟四獲得的穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納 豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后將pHT43/Cflr轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中 25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體，涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/ mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素，進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行 液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用 Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cf Ir基因 mRNA的含 量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇Cf Ir基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法 檢測賴氨酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納 豆芽孢桿菌；
[0083] 步驟四中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液配方：每升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液含5gK2HP04、6gKH 2P04、2gNa2S04、lg檸 檬酸鈉、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸鈉，pH7. 5。
[0084] 步驟五熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為：
[0085] 上游引物：5 ' -GCGTGAGTGATGAAGGTTT-3 '，
[0086] 下游引物：5, -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3,；
[0087] 步驟五熒光定量PCR中檢測Cflr基因的引物序列為：
[0088] 上游引物：5 ' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3 '，
[0089] 下游引物：5' -CTACAGCAGCAACAGC-3,；
[0090] 對本實驗獲得的穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱桿菌質(zhì)粒經(jīng) XbaI和SmaI雙酶切，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，獲得476bpZein和720bpCflr 基因片段特異性條帶，說明該重組菌已同時轉(zhuǎn)入Zein和Cflr基因。圖1中M為DNA分子 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱桿菌質(zhì)粒經(jīng)XbaI和 SmaI雙酶切獲得的Zein和Cf Ir基因片段，泳道2為穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基 因的納豆芽孢桿菌質(zhì)粒經(jīng)SmaI酶切獲得的片段。
[0091] 上述穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納豆芽孢桿菌的發(fā)酵工藝，按以下 步驟進(jìn)行：
[0092] -、菌種活化：將上述獲得的穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱 桿菌轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24小時，得到活化的菌種；
[0093] 二、種子培養(yǎng)液制備：將活化的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下 震蕩培養(yǎng)13h，得種子液；
[0094] 三、搖瓶發(fā)酵：將種子液按體積百分比5%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于 37°C、200rpm條件下震蕩培養(yǎng)13h，得發(fā)酵液；
[0095] 四、發(fā)酵罐發(fā)酵：
[0096] 將豆柏和玉米粉分別粉碎至200目，然后將豆柏和玉米粉按照質(zhì)量比1:2混合，將 混合粉末和步驟三獲得的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)混，得預(yù)混料，并添加尿素和硫乙醇酸鈉，然后添加 復(fù)合胰酶，每小時按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的〇. 01 %添加乳糖進(jìn)行動態(tài)補料，發(fā)酵時間為24小 時，即完成發(fā)酵。步驟四中混合粉末的質(zhì)量為發(fā)酵液質(zhì)量的10%，尿素的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì) 量的0. 05%，硫乙醇酸鈉的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的0. 05%，復(fù)合胰酶的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的 0· 3%。
[0097] 應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳對發(fā)酵液上清進(jìn)行目的蛋白鑒定，如圖2所示，發(fā)酵液 上清可見16kDa Zein和24kDa Cflr蛋白特異性條帶，說明該重組菌已同時表達(dá)Zein和 Cflr蛋白。獲得轉(zhuǎn)高蛋氨酸和賴氨酸基因納豆芽孢桿菌。圖2中泳道M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為納豆芽孢桿菌發(fā)酵液上清；泳道2為轉(zhuǎn)pHT43納豆芽孢桿菌發(fā)酵液上清；泳 道3、4、5為轉(zhuǎn)pHT43/Cflr和pHT43/Zein納豆芽孢桿菌發(fā)酵液上清。
[0098] 步驟四所述復(fù)合胰酶購買自重慶奧力生物制藥有限公司，商品名稱為胰酶，按干 燥品計算，每Ig胰酶中含胰蛋白酶不得少于1800活力單位，胰淀粉酶不得少于21000活力 單位，胰脂肪酶不得少于12000活力單位。
[0099] 步驟一所述斜面培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，包括蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉 5g、瓊脂15?20g、氨節(jié)青霉素10mg、氯霉素5mg和蒸饋水IOOOmL, 121°C高壓滅菌15min。
[0100] LB液體培養(yǎng)基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl和蒸餾水組成。
[0101] 所述的納豆芽孢桿菌購自廣州農(nóng)冠生物科技有限公司。
[0102] 本實驗的發(fā)酵代謝產(chǎn)物賴氨酸由菌種發(fā)酵前發(fā)酵液干物質(zhì)含量47. 45mg/g提高 至菌種發(fā)酵后發(fā)酵液干物質(zhì)含量78. 73mg/g，提高了 65. 92%，發(fā)酵代謝產(chǎn)物蛋氨酸含量由 菌種發(fā)酵前發(fā)酵液干物質(zhì)含量33. 82mg/g提高至菌種發(fā)酵后發(fā)酵液干物質(zhì)含量49. 51mg/ g，提高了 46. 39%。賴氨酸和蛋氨酸分別占蛋白質(zhì)20種氨基酸的二十分之一，以上比例的 提高對于將納豆芽孢桿菌作為添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)具有重要價值。
[0103] 納豆芽孢桿菌具有很強的利用小分子氮源和碳源合成限制性必需氨基酸、多種生 長調(diào)節(jié)因子和維生素的能力，以添加劑形式喂飼能夠顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。
[0104] 本方法有效提高了以納豆芽孢桿菌作為益生菌發(fā)酵時代謝產(chǎn)物的蛋氨酸和賴氨 酸含量，顯著提高了納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，菌體發(fā)酵代謝產(chǎn)物作為飼料添加 劑顯著提高畜禽的生產(chǎn)性能。
【權(quán)利要求】
1. 產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn) 行： 一、 利用PCR從玉米種子胚乳中克隆高蛋氨酸基因 Zein全長476bp片段； 二、 利用PCR從辣椒花藥中克隆高賴氨酸基因 Cflr全長720bp片段； 三、 利用枯草芽孢桿菌特異表達(dá)載體PHT43分別構(gòu)建pHT43/Zein和pHT43/Cflr基因 重組載體； 四、 以納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，將重組載體pHT43/Zein 轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，然后于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中25°C培養(yǎng)24小時，然后收集菌體，涂布 LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加100 μ g/mL氨芐青霉素和5 μ g/mL氯霉素，進(jìn)行 陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，每管LB培養(yǎng)基中接種一個單菌 落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs，采用 SYBR法熒光定量PCR檢測Zein基因 mRNA的含量，對熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇 Zein基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測蛋氨酸的含量，檢測出蛋氨酸的重組 菌為穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因的納?芽抱桿菌； 五、 以步驟四獲得的穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因的納豆芽孢桿菌為出發(fā)菌株，制備納豆芽 孢桿菌原生質(zhì)體，然后將pHT43/Cflr轉(zhuǎn)入納豆芽孢桿菌原生質(zhì)體，于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中25°C培 養(yǎng)24小時，然后收集菌體，涂布LB培養(yǎng)基平板，所述LB培養(yǎng)基平板中添加 100 μ g/mL氨芐 青霉素和5 μ g/mL氯霉素，進(jìn)行陽性菌株的篩選，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)， 每管LB培養(yǎng)基中接種一個單菌落，于37°C培養(yǎng)24小時，然后對每管菌液采用Trizol法提 取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNAs，采用SYBR法熒光定量PCR檢測Cflr基因 mRNA的含量，對熒光 定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇Cflr基因擴增陽性的菌種，采用高效液相色譜法檢測賴氨 酸的含量，檢測出賴氨酸的重組菌為穩(wěn)定表達(dá)高蛋氨酸基因和高賴氨酸基因的納豆芽孢桿 菌； 步驟四和步驟五中熒光定量PCR中作為對照的16SrRNAPCR引物序列為： 上游引物：5' -GCGTGAGTGATGAAGGITT-3'， 下游引物：5' -GCCGTGGCTTTCTTGTTA-3' ； 步驟四熒光定量PCR中檢測Zein基因的引物序列為： 上游引物：5' -CCGTCTCGCAGATTAT-3'， 下游引物：5' -GCAGCACCAACAAAGG-3' ； 步驟五熒光定量PCR中檢測Cflr基因的引物序列為： 上游引物：5' -GAAAGAAATGGTGGGAC-3'， 下游引物：5' -CTACAGCAGCAACAGC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于 步驟一中 PCR 引物為：F1 :5' -GCTCTAGAAGGAAGCAAGGACACCACC-3'，R1 :5' -TCCCCCGGGTCTAG AATGCAGCACCAAC-3'，PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 lmin，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸lmin，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于 步驟二中 PCR 引物為：F2 :5' -GCTCTAGAAAAAGATGGGTTGTGGGGAAT-3'，R2 :5' -TCCCCCGGGTAA ACTAATAAATAGCCCTCTTCCC-3'，PCR 循環(huán)反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 30s，94°C變性 30s，55°C退 火30s，72°C延伸3min，共30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于 步驟三中pHT43/Zein的構(gòu)建方法為：用Xbal和Smal分別對基因 Zein和載體pHT43進(jìn)行 雙酶切，然后連接酶切產(chǎn)物，獲得重組載體pHT43/Zein。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于 步驟三中pHT43/Cflr的構(gòu)建方法為：用Xbal和Smal分別對基因 Cflr和載體pHT43進(jìn)行 雙酶切，然后連接酶切產(chǎn)物，獲得重組載體pHT43/Cf lr。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的制備方法，其特征在于 步驟四和步驟五中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液配方：每升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液含5gK 2HP04、6gKH2P04、2gNa2S0 4、lg檸 檬酸鈉、0· 2gMgS04、0. 05gCaCl2、0. 005gFeCl3、0. 001gMnS04、80mg 色氨酸，5g 葡萄糖和 2g 谷 氨酸鈉，pH7. 5。
7. 產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，其特征在于具體工藝按以下步驟進(jìn) 行： 一、 菌種活化：將穩(wěn)定表達(dá)商蛋氣酸基因和商賴氣酸基因的納?芽抱桿菌轉(zhuǎn)接到斜面 培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)24小時，得到活化的菌種； 二、 種子培養(yǎng)液制備：將活化的菌種接種到LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下震蕩 培養(yǎng)13h，得種子液； 三、 搖瓶發(fā)酵：將種子液按體積百分比5 %的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基，于37°C、 200rpm條件下震蕩培養(yǎng)13h，得發(fā)酵液； 四、 發(fā)酵罐發(fā)酵： 將豆柏和玉米粉分別粉碎至200目，然后將豆柏和玉米粉按照質(zhì)量比1:2混合，將混合 粉末和步驟三獲得的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)混，得預(yù)混料，并添加尿素和硫乙醇酸鈉，然后添加復(fù)合 胰酶，每小時按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的0. 01 %添加乳糖進(jìn)行動態(tài)補料，發(fā)酵時間為24小時， 即完成發(fā)酵。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，其特征在 于步驟一所述斜面培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，包括蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂 15?20g、氨節(jié)青霉素10mg、氯霉素5mg和蒸饋水lOOOmL，121°C高壓滅菌15min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，其特征在于 步驟四中混合粉末的質(zhì)量為發(fā)酵液質(zhì)量的10%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)蛋氨酸和賴氨酸的基因工程菌株的發(fā)酵工藝，其特征 在于步驟四中尿素的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的0. 05 %，硫乙醇酸鈉的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的 0. 05%，復(fù)合胰酶的質(zhì)量為預(yù)混料質(zhì)量的0. 3%。
【文檔編號】C12P13/08GK104278006SQ201410583223
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】高學(xué)軍, 劉營, 張雙, 武彩霞, 駱超超, 婁麗, 李學(xué)琳, 潘洪寶, 孫喆 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)