一種枯草芽孢桿菌菌株、生防菌劑及其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物材料制備【技術領域】，提供一種枯草芽孢桿菌wdcjxq2266，利用該菌株生產的生防菌劑，及該菌株和生防菌劑的應用?？莶菅挎邨U菌wdcjxq2266，于2014年4月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC NO.8993，通過將該菌株在LB培養(yǎng)液28℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)12～24小時，制成活菌總濃度為1×109～1×1010CFU/mL的菌劑成品，將菌劑成品稀釋10-100倍后在辣椒種植時浸種處理，或在移栽時進行灌根處理。其抑菌效果非常明顯，經過試驗證明，生防菌劑在溫室條件下對辣椒疫病的防效可以達到69.06％，對辣椒的增產幅度達到38.5％。CGMCC NO.89932014.04.03
【專利說明】-種枯草芽抱桿菌菌株、生防菌劑及其制備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護技術【技術領域】，涉及一種枯草芽抱桿菌菌Wdcjxq2266,利用 該菌株生產的生防菌劑，W及該菌株和生防菌劑在防治辣椒疫病中的應用。

【背景技術】
[0002] 辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phyto地thora capsici Leonian)引起的一種細菌性 病害。辣椒疫霉菌的寄主范圍較廣，除辣椒外還能寄生番茄、茄子和一些瓜類作物。病菌W 卵抱子在±壤中或病殘體中越冬，借風、雨、灌水及其他農事活動傳播。發(fā)病后可產生新的 抱子囊，形成游動抱子進行再侵染。病菌生育溫度范圍為10?37C，最適宜溫度為20? 3(TC?？諝庀鄬穸冗_90% W上時發(fā)病迅速運巷、低注地、排水不良，氮服使用偏多、密度 過大、植株衰弱均有利于該病的發(fā)生和蔓延。該種病害由于地理分布范圍廣，寄主范圍廣， 所W-旦侵染非常容易造成毀滅性打擊，到目前為止還沒有有效的防治手段。
[0003] 辣椒是我國重要的經濟作物，疫病一直是辣椒上的重要病害，近年來，隨著設施蔬 菜種植面積的擴大和連作密度的加大，發(fā)病趨勢更加嚴重，據調查，嚴重時減產50% W上， 甚至造成毀滅性的危害。
[0004] 長期W來，國內外對辣椒疫病的防治多從農業(yè)防治和化學防治出發(fā)，雖然取得了 一定的防效，但始終未能很好控制該病害的發(fā)生，且造成了一定程度的環(huán)境污染。生物防治 由于其自身的優(yōu)點開始受到越來越多的重視，利用微生物制劑防治辣椒疫病取得了一些進 展，但效果并不理想。綜上所述，開發(fā)新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑控制辣椒疫病 的發(fā)生是實現農業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要，符合社會發(fā)展要求。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決現有技術中防治辣椒疫病的制劑防治效果不理想，易造成環(huán) 境污染的問題，提供一種枯草芽抱桿菌菌株、包括該菌株的生防菌劑及該菌劑的制備，W及 二者在防治辣椒疫病上的應用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術方案實現
[0007] 1.本發(fā)明提供一種枯草芽抱桿菌菌株，所述枯草芽抱桿菌菌株炬acillus subtilis)的名稱為wdcjxq2266,于2014年4月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中也，菌種保藏號為CGMCC NO. 8993,地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號。菌落特征：單個細胞0.7?0.8X2?3微米，著色均勻。無芙膜，周生鞭毛，能運動。 革蘭氏陽性菌，芽抱0. 6?0. 9 X 1. 0?1. 5微米，楠圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱 形成后菌體不膨大。菌落表面粗趟不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形 成皺贈。需氧菌?？衫玫鞍踪|、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成剛巧。
[000引2.本發(fā)明還提供一種生防菌劑，所述的生防菌劑包括上述1提供的枯草芽抱桿菌 菌株 wdcjxq2266。
[000引 3.上述2提供的生防菌劑，其中，菌劑成品中活菌總濃度為IX IO9?IX 101化即/ mL。
[0010] 4.上述3提供的生防菌劑，該生防菌劑主要由上述I提供的枯草芽抱桿菌菌株 wdcjxq2266經菌體活化、種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)后得到的。
[0011] 5.上述2-4任一項所述的生防菌劑的制備方法，其中，將上述1提供防治辣椒疫 病的生防菌株wdcjxq2266在LB培養(yǎng)液28C 180巧m振蕩培養(yǎng)12-2化，然后4000巧m離也 lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為lXl〇9?lXl(TCFU/mL。
[0012] 6.上述1提供的枯草芽抱桿菌菌株在防治辣椒疫病中的應用。
[0013] 7.上述2提供的生防菌劑在防治辣椒疫病中的應用。
[0014] 8.上述7提供的應化該應用方法為，在使用前，將該菌劑成品稀釋10-100倍，在 辣椒種植時浸種處理或在移栽時進行灌根處理達到防治辣椒疫病的作用。
[0015] 9.上述2提供的生防菌劑在辣椒促生增產中的應用
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 1.生防制劑中含有抑制辣椒疫病病原菌生長的專一性菌株枯草芽抱桿菌菌株 wdcjxq2266,其抑菌效果非常明顯，經過試驗證明，本發(fā)明提供的生防制劑在室溫條件下對 辣椒疫病的防效可W達到69.06%，施入±壤中可W形成優(yōu)勢群，并能保持活性存活下來。
[0018] 2.本發(fā)明的芽抱桿菌菌株wdcjxq2266,生產工藝簡單、培養(yǎng)時間短、成本低，且該 菌株可W通過簡單、快捷低成本的制備方法獲得防治辣椒疫病的生防制劑。
[0019] 3.本發(fā)明提供的生防制劑為微生物防治劑，無公害，不產生環(huán)境污染，可W不用或 減少其他相應化學農藥的用量，不僅節(jié)省農民開支，而且有利于蔬菜的出口。
[0020] 4.經過試驗證明，本發(fā)明提供的生防制劑，具有抗病、增產作用，可為農民增加收 入。

【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0022] 實施例1
[002引 1. wdcjxq2266生防菌劑的制備
[0024] 本發(fā)明涉及一種防治辣椒疫病的生防菌株wdcjxq2266,為2013年在江蘇南京市 郊病田健株上分離得到。
[00巧]分離方法；采用5點取樣法將生長至成熟期的整株番茄（連根、莖、葉和粘附± ) 裝入滅菌的封口塑料袋中，立即帶回實驗室。在分離番茄生境相關細菌前用自來水沖洗采 集到的番茄根，直到沖洗干凈，然后在滅菌水中潤洗3遍。采集到的莖和葉采取同樣的處理 方法。分別稱取植物的根、莖、葉放入含有27血無菌0. 85%化CI溶液的H角瓶中，加入少 許直徑2mm的玻璃珠，200rpm 3(TC振蕩30min后，分別移于滅菌培養(yǎng)皿中，先用1.5%次氯 酸軸溶液（化CIO)浸泡5min，滅菌水潤洗5次，將組織剪成2-3cm長的小塊，用綴子把根、莖 和葉分別接入RZA及邸A平板上，置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5d后把沒有任何污染的組織用 剪刀剪碎后研細，浸軟組織，滅菌棉布過濾，再用無菌0. 85%化CI溶液W 10倍梯度稀釋，分 別取梯度稀釋液0. 1血涂在RZA平板及邸A平板上（根部稀釋液涂10氣10氣ICT4和ICT5四 個濃度，莖、葉部稀釋液涂1〇^1、1〇氣1〇^3和IO^ 4四個濃度），3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進行根內、 莖內、葉內細菌的分離。根據平板上菌落大小及形態(tài)進行分離純化。細菌種群密度WC即/ g表示。將純化好的細菌進行編號，用80%滅菌甘油保存，放入-7(TC備用。
[0026] 按照平板枯抗活性、蛋白酶活性、幾下質酶活性、纖維素酶活性、葡聚糖酶活性W 及產嗜鐵素活性，采用賦值法，選擇出綜合得分較高菌株，通過溫室試驗最終篩選出防治效 果最好的wdcjxq2266。
[0027] 菌落特征：單個細胞0. 7?0. 8X2?3微米，著色均勻。無芙膜，周生鞭毛，能運 動。革蘭氏陽性菌，芽抱0. 6?0. 9X 1. 0?1. 5微米，楠圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏， 芽抱形成后菌體不膨大。菌落表面粗趟不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時， 常形成皺贈。需氧菌。可利用蛋白質、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成剛巧。
[0028] 將分離出的wdcjxq2266單菌落于LB液體培養(yǎng)基，28C 18化pm搖床振蕩培養(yǎng)12h， 獲得種子液。將種子液W 1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于3(TC 18化pm搖床振蕩培養(yǎng) 5山菌劑成品中活菌總濃度為lX108-lX109CFU/mL。LB培養(yǎng)基為；酵母粉5g/L、膜蛋白腺 lOg/U氯化軸lOg/L。發(fā)酵培養(yǎng)液為：藏糖2g/L、玉米粉20g/L、黃豆粉lOg/L、磯酸氨二鐘 0. 5g/L、走水硫酸鎮(zhèn)0. 2g/L、酵母膏0. 4g/L、碳酸巧Ig/L、氯化鐵0. 005g/L。
[0029] 2溫室盆鉢試驗檢測wdcjxq2266生防菌劑對辣椒疫霉的防效
[0030] 移栽之前，用生防菌wdcjxq2266 (10?即/mL)浸種處理辣椒幼苗30min ;移栽時采 用20mL IO7C即/mL菌劑灌根處理，移栽7天后接種1000個/mL辣椒疫霉病菌^^ophthora capsici Leonian游動抱子息液20mL。另外不用生防菌wdcjxq2266處理，直接接種辣椒疫 霉病菌游動抱子息液的處理作為對照Control。每個處理組24株，H次重復。在溫度25? 28C，相對濕度50 %，光照1化/1化條件下，培養(yǎng)3周后調查病級數，計算病害嚴重度和防 效。
[0031] 灌根接種法的分級標準：
[0032] DI 0,無任何癥狀；
[0033] DI 1，幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎慧或可恢復性萎慧；
[0034] DI 2,幼苗根莖部變黑達1?2cm，葉片不可恢復性萎慧，下部葉片偶有脫落；
[00巧]DI 3,幼苗根莖部變黑超過1?2cm，葉片明顯萎慧或落葉明顯；
[0036] DI 4,幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎慧；
[0037] DI 5,植株枯死.
[0038] 注：本標準經中華人民共和國農業(yè)部1999-01-25批準

【權利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌菌株（Bacillus subtilis)的名稱為wdcjxq2266,于2014年4月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 8993。
2. -種生防菌劑，其特征在于：所述的生防菌劑包括權利要求1所述的枯草芽孢桿菌 菌株 wdcjxq2266。
3. 權利要求2所述的生防菌劑，其特征在于：菌劑成品中活菌總濃度為IX 109? lX1010CFU/mL。
4. 權利要求3所述的生防菌劑，其特征在于：該生防菌劑主要由權利要求1所述的枯 草芽孢桿菌菌株WdcjXq2266經菌體活化、種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)后得到的。
5. 權利要求2-4任一項所述的生防菌劑的制備方法，其特征在于：將權利要求1所 述防治辣椒疫病的生防菌株wdcjXq2266在LB培養(yǎng)液28°C 180rpm振蕩培養(yǎng)12-24h，然 后4000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1X109? lX1010CFU/mL。
6. 權利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株在防治辣椒疫病中的應用。
7. 權利要求2所述的生防菌劑在防治辣椒疫病中的應用。
8. 權利要求7所述的應用，其特征在于：在使用前，將該菌劑成品稀釋10-100倍，在辣 椒種植時浸種處理或在移栽時進行灌根處理達到防治辣椒疫病的作用。
9. 權利要求2所述的生防菌劑在辣椒促生增產中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104357351SQ201410568661
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權日:2014年10月22日
【發(fā)明者】許泉, 吳強, 許嘉臻, 劉欣 申請人:南京農業(yè)大學