miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷試劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途。本發(fā)明還提供了miRNA-188聯(lián)合miRNA-30a、miRNA-e中任意一種或者兩種作為標(biāo)記分子在制備診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有miRNA-188。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-188可以用于早期診斷CI-AKI。miR-188單獨(dú)用于診斷CI-AKI的敏感性為52.11%，特異性為92.96%；與miR-30a和miR-30e聯(lián)合診斷CI-AKI的敏感性為71.8%，特異性為88.7%。采用上述標(biāo)記物早期診斷CI-AKI具有極大的應(yīng)用前景和市場(chǎng)前景。
【專利說明】miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷試劑中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種分子標(biāo)記物，具體來說是miRNA-188作 為標(biāo)記分子在制備診斷試劑中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷（ContrastInducedAcuteKidneyInjury,CI-AKI)是 指除外其他因素，對(duì)比劑給藥后新發(fā)生急性腎功能損傷或腎功能不全加重。CI-AKI是醫(yī)源 性急性腎功能衰竭的第3位病因，占醫(yī)源性急性腎功能衰竭的11%，目前臨床上主要見于 接受冠狀動(dòng)脈介入診療手術(shù)的患者。近年來隨著我國(guó)冠心病發(fā)病率的增加和冠脈介入技術(shù) 的廣泛開展，CI-AKI的發(fā)病率、發(fā)病絕對(duì)人數(shù)有逐年升高趨勢(shì)。
[0003] 雖然大多數(shù)CI-AKI患者表現(xiàn)為一過性血肌酐水平升高，真正導(dǎo)致腎功能衰竭需 要透析治療的比例還不到1%，但CI-AKI患者住院期間死亡、中風(fēng)及各種心血管事件的發(fā) 生率均顯著升高，長(zhǎng)期生存率也明顯低于無腎臟損傷表現(xiàn)的患者。CI-AKI的防治對(duì)改善患 者臨床預(yù)后有重要意義。
[0004] 研究表明，早期干預(yù)能夠提高腎功能障礙改善的機(jī)會(huì)，是防治CI-AKI的關(guān)鍵。 而早期干預(yù)的前提是早期診斷。目前CI-AKI診斷的難點(diǎn)在于缺乏類似急性心肌梗死中 肌鈣蛋白一樣的敏感性高、特異性好的早期診斷生物標(biāo)志物。臨床上正在使用的診斷 標(biāo)準(zhǔn)是以血肌酐為依據(jù)，規(guī)定接受對(duì)比劑48-72h血肌酐絕對(duì)值增加0. 5mg/dL以上或相 對(duì)值升高25%以上確診CI-AKI。但血肌酐不是一個(gè)反映腎功能急性改變的可靠指標(biāo)， 它在腎功能損失50 %以前濃度不會(huì)改變，升高通常在對(duì)比劑暴露后48-72小時(shí)，嚴(yán)重滯 后，且受患者體重、種族、年齡、性別、身體體積、藥物、肌肉代謝和蛋白質(zhì)攝入等許多非腎 性因素影響（ThomsenHS,etal·，BrJRadiol76(2003)513-518;TomlanovichS，et al.,AmJKidneyDis8 (1986)332-337;VanBiesenW，etal·，ClinJAmSocNephrol 1(2006) 1314-1319)。
[0005] 最近10年的一些研究探討了NAGL、IL-18、KM-I等新型標(biāo)記物作為CI-AKI早 期診斷指標(biāo)的可靠性及可行性（FergusonMA,etal·，Toxicology245(2008) 182-193; DevarajanP,etal.，ContribNephrol156(2007)203-212)。這些診斷標(biāo)記物中， 血NAGL相關(guān)研究最多，評(píng)價(jià)相對(duì)較好。BachorzewskaGajewska等發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后患 者血NGAL在 4h明顯升高（Bachorzewska-GajewskaH,etal.,KidneyBloodPress Res30(2007)408-415)。其靈敏度和特異度分別為 0· 9 和 0· 74(Bachorzewska-Gajewska H,etal.IntJCardiol127(2008)290-291)。但NAGL穩(wěn)定性和特異性較差，易受許多已 存的可變因素的影響，如基礎(chǔ)腎臟疾病和尿路感染，且不能進(jìn)一步鑒別不同因素導(dǎo)致的急 性腎功能損傷，因此不能代替血肌酐作為臨床CI-AKI的診斷標(biāo)記物。
[0006]目前迫切需要尋找到一個(gè)敏感性好、特異性強(qiáng)、易于測(cè)量、穩(wěn)定不受其他可變生物 因素影響的、可評(píng)價(jià)對(duì)比劑引起急性腎功能損傷的早期生物標(biāo)志物。
[0007]miRNAs是一類23-25個(gè)核苷酸大小的、進(jìn)化上高度保守、內(nèi)源性單鏈非編 碼RNA。同時(shí)，miRNA是一類具有生物活性的小RNA。miRNA通過與mRNA的配對(duì)結(jié)合， 降解mRNA或干擾其翻譯，起到生物調(diào)節(jié)作用（SaalS，etal·，CurrOpinNephrol Hypertensl8(2009)317-323)〇
[0008] 研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)具有組織特異性。YuLiang、PabloLandgraf等分別對(duì)不同 物種、不同組織miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)部分miRNAs在特定的組織特異性表達(dá)或富集。 例如，miR-122在肝臟特異性表達(dá)，而miR-133a、miR-499在骨骼肌、心肌特異性表達(dá)（Liang Y，etal·，BMCGenomics166(2007)8)。
[0009] 同時(shí)，miRNAs表達(dá)具有疾病特異性。研究發(fā)現(xiàn)不同種類的癌癥細(xì)胞miRNA表達(dá)特 點(diǎn)各不相同。Calin等首先發(fā)現(xiàn)miRNA-15、miRNA-16在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中表達(dá)下 調(diào)（BarbarottoE，etal·，CurrPharmDes14(2008)2040-2050)。而NozomuYahaihara 等的觀察到肺腺癌中miR-155高表達(dá)、let_7a_2低表達(dá)（YanaiharaN，etal.,Cancer Cell9 (2006) 189-198)。證明了miRNAs的表達(dá)具有疾病特異性。miRNA表達(dá)還具有時(shí)相性， miRNA表達(dá)譜隨疾病病程動(dòng)態(tài)改變。JonathanGodwin等對(duì)腎臟缺陷再灌注小鼠模型不同 時(shí)間點(diǎn)腎臟miRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，miRNAs呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。例如，miRNA-21 在再灌注早期迅速升高，達(dá)到平臺(tái)期。而miRNA-146a在再灌注第3-7天才開始逐漸升高 (GodwinJG，etal·，ProcNatlAcadSciUSA107(2010)14339-14344)。
[0010] 部分研究發(fā)現(xiàn)miRNA在病變組織、器官的表達(dá)改變能反應(yīng)在血漿中。研究 發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織高表達(dá)的miR-141在前列腺癌患者血清中也明顯高于健康人群， 且具有較高的敏感性和特異性（MitchellPS,etal·，ProcNatlAcadSciUSA 105 (2008) 10513-10518)。藥物性肝損模型小鼠中，肝臟特異的miRNA-122在小鼠肝臟中表 達(dá)下調(diào)，但在血漿中表達(dá)明顯上調(diào)，并具有劑量/時(shí)間相關(guān)性。血漿中miRNA還具有很好 的穩(wěn)定性（WangK，etal·，ProcNatlAcadSciUSA106(2009)4402-4407)。雖然血漿 中存在大量降解RNA的酶，血漿中基本不存在長(zhǎng)段的RNA，但miRNA在血漿中可以以某種形 式穩(wěn)定存在。研究發(fā)現(xiàn)血漿中的miRNAs在室溫（24小時(shí)）和反復(fù)凍融（8次）的情況下均 保持穩(wěn)定（ChenX，etal·，CellRes18(2008)997-1006)。
[0011] 正是由于miRNA的組織、疾病特異性，與疾病病理生理狀態(tài)密切相關(guān)的特性決定 了miRNA作為診斷標(biāo)記物具有較高的特異性。同時(shí)血漿或血清中miRNA能反映病變組織 miRNA表達(dá)的改變。因此血漿miRNA作為一種無創(chuàng)的、特異的疾病診斷標(biāo)記物越來越得到重 視和認(rèn)可。
[0012] 已有大量研究探討了miRNA在慢性腎臟疾病中的地位，其中包括多囊性腎病、 糖尿病腎病、腎臟腫瘤等（Sun H，et al.，Mol BiolR印 37(2011)2951-2958;Kato M，et al.,Proc Natl Acad Sci USA104 (2007)3432-3437；Zhang Z, et al. , FEBS Lett 583 (2009) 2009-2014;Hanke M，et al·，Urol Oncol28(2009)655-661)。但目前國(guó)內(nèi)外無 相關(guān)研究關(guān)注血漿miRNA作為CI-AKI的診斷標(biāo)記物。
[0013] 全血、血清或血漿是最廣泛使用的臨床途徑樣品源。尋找到提供早期診斷信息的 對(duì)比劑誘導(dǎo)急性腎損傷血漿標(biāo)記物，可產(chǎn)生一種診斷性實(shí)驗(yàn)，極大地幫助診斷和處理該疾 病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷試劑中的用途， 所述的這種用途解決了現(xiàn)有技術(shù)中診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷的分子標(biāo)記物穩(wěn)定性和 特異性較差，易受許多已存的可變因素影響的技術(shù)問題。
[0015] 本發(fā)明提供了miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試 劑中的用途，所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備早期診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎 損傷試劑中的用途，所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
[0017] 進(jìn)一步的，其中所述早期診斷是指對(duì)比劑暴露后的4-6小時(shí)。
[0018] 本發(fā)明還提供了miRNA-188聯(lián)合miRNA_30a、miRNA_30e中任意一種或者兩種作 為標(biāo)記分子在制備診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-188的堿 基序列如SEQIDN0:3所示，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQIDN0:1所示，所述的 miRNA-30e的堿基序列如SEQIDNO:2所示。
[0019] 本發(fā)明還提供了miRNA-188聯(lián)合miRNA-30a、miRNA-30e中任意一種或者兩種作為 標(biāo)記分子在制備早期診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-188的堿 基序列如SEQIDN0:3所示，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQIDN0:1所示，所述的 miRNA-30e的堿基序列如SEQIDNO:2所示。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有miRNA-188,所述的miRNA-188的堿基序列如 SEQ ID NO :3所示。
[0021] 本發(fā)明提供了涉及對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷診斷方法，該方法包括以下步驟：a) 提供由個(gè)體獲得的血漿樣品；b)測(cè)量對(duì)比劑暴露前后血漿樣品中miR-188濃度變化倍數(shù)， 和c)將（b)與CI-AKI診斷相關(guān)聯(lián)。
[0022] 本發(fā)明還提供了涉及對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案診斷方法， 該方法包括以下步驟：a)測(cè)量對(duì)比劑暴露前后血漿樣品中miR-188濃度變化倍數(shù)，b)任選 地測(cè)量血漿樣品中CI-AKI的一種或多種其他miRNA標(biāo)記的濃度變化倍數(shù)；和c)使用在步 驟（a)和任選的步驟（b)中測(cè)定的濃度變化倍數(shù)，診斷CI-AKI。
[0023] 如本文所使用的，下面術(shù)語的每一個(gè)在本部分中具有與它相關(guān)的含義。
[0024] 術(shù)語"個(gè)體"在本文中用于指接受冠脈介入診療手術(shù)的患者，這些患者未接受普通 肝素抗凝治療，或給予普通肝素抗凝治療超過4小時(shí)。
[0025] 術(shù)語"測(cè)量"在本文中用于指包括microRNA芯片、Solexa測(cè)序、Taqman低密度陣 列、實(shí)時(shí)熒光定量PCR或基于微球的各種microRNA檢測(cè)方法。
[0026] 術(shù)語"血漿樣品"在本文中用于指為體外評(píng)價(jià)目的而得到的患者血漿，該血漿自經(jīng) EDTA(工作濃度為1.8mg/ml)抗凝的個(gè)體全血離心后獲得。
[0027] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過各種microRNA檢測(cè)方法體外檢測(cè)血漿 miR-30a、miR-188和miR-30e濃度變化，和使用測(cè)定的濃度變化診斷CI-AKI。
[0028] 本發(fā)明提出了一種miR-188的新用途。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-188可以用于早 期（對(duì)比劑暴露后4-6小時(shí)）診斷CI-AKI。miR-188單獨(dú)用于診斷CI-AKI的敏感性為 52. 11%，特異性為92. 96% ;與miR-30a和miR-30e聯(lián)合診斷CI-AKI的敏感性為71. 8%， 特異性為88. 7%。采用上述標(biāo)記物早期診斷CI-AKI具有極大的應(yīng)用前景和市場(chǎng)前景。
[0029] 上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了詳細(xì)的描述，為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚本 發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
和技術(shù)效果，下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1說明通過miRNA芯片方法篩選對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷標(biāo)記物流程。
[0031] 圖2A為用real-time PCR方法檢測(cè)證明miR-188在大鼠腎臟組織特異表達(dá)。
[0032] 圖2B為檢索已發(fā)表的人組織miRNAs表達(dá)譜文獻(xiàn)顯示miR-188在人體腎臟組織特 異性表達(dá)。
[0033] 圖3用real-time PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果，CI-AKI大鼠血漿miR-188表達(dá)上調(diào)。
[0034] 圖4用real-time PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果，CI-AKI大鼠血漿miR-188在對(duì)比劑暴 露后4h上升達(dá)峰值。
[0035] 圖5用real-time PCR方法證明，CI-AKI大鼠血漿miR-188升高與對(duì)比劑誘導(dǎo)的 腎損傷特異相關(guān)。
[0036] 圖6用real-time PCR方法比較miR-188在CI-AKI和非CI-AKI患者血漿中的水 平，證明CI-AKI患者顯著升高。
[0037] 圖7miR-188作為CI-AKI診斷標(biāo)志物的ROC評(píng)價(jià)。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0039] 實(shí)施例1芯片篩選人腎臟特異性表達(dá)的目標(biāo)miRNA
[0040] 1.構(gòu)建CI-AKI大鼠模型
[0041] 本發(fā)明通過在禁水3天、利尿"預(yù)處理"的基礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈注射低滲對(duì)比劑的方法 建立CI-AKI大鼠模型。這是本發(fā)明人建立的一種新型CI-AKI大鼠模型，具體方案見相關(guān) 文獻(xiàn)（SunSQ,etal.IntJournalofCardiol172 (2014)e48_50)。
[0042] 2.miRNA芯片差異表達(dá)譜分析
[0043]DmiRNA芯片制備
[0044] 在采用上述方法成功造模的基礎(chǔ)上，留取造模后8小時(shí)CI-AKI大鼠血漿、腎臟，用 于芯片上樣。采用AgilentmiRNAs10.Oversion芯片技術(shù)，以血楽和腎臟總RNA進(jìn)行上樣， 以磷酸化Cyanine3-pCp進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行芯片雜交、洗滌和數(shù)據(jù)采集。
[0045] 2)生物信息學(xué)分析
[0046]芯片突光強(qiáng)度信號(hào)值米用AgilentG4450AAFeatureExtractionSoftware9. 5 以及AgilentScanControlSoftwareversionA7.0軟件進(jìn)行采集分析。樣品信號(hào)值用 原始數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化（normalization)后進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換表示。樣品信號(hào)Flag值A(chǔ)(Absent) 代表信號(hào)與背景差異不顯著，P(Present)代表信號(hào)與背景差異顯著。樣品數(shù)據(jù)分析采用 AgilentGeneSpringsoftware9.0,通過對(duì)比CI-AKI和非CI-AKI大鼠的腎臟和血楽芯 片數(shù)據(jù)，得到差異表達(dá)的microRNA，結(jié)果如表1所示。
[0047] 表I.miRNAs表達(dá)譜分析
[0048]

【權(quán)利要求】
1. miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途，所述 的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。 2. miRNA-188作為標(biāo)記分子在制備早期診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途， 所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述早期診斷是指對(duì)比劑暴露后的4-6小時(shí)。 4. miRNA-188聯(lián)合miRNA-30a、miRNA-30e中任意一種或者兩種作為標(biāo)記分子在制備診 斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3 所示，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的miRNA-30e的堿基序列如 SEQ ID NO :2 所示。 5. miRNA-188聯(lián)合miRNA-30a、miRNA-30e中任意一種或者兩種作為標(biāo)記分子在制備 早期診斷對(duì)比劑誘導(dǎo)的急性腎損傷試劑中的用途，所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID N0:3所示，所述的miRNA-30a的堿基序列如SEQ ID N0:1所示，所述的miRNA-30e的堿基 序列如SEQ ID NO : 2所示。
6. -種試劑盒，其特征在于：含有miRNA-188，所述的miRNA-188的堿基序列如SEQ ID NO :3所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104278100SQ201410550545
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】何奔, 沈玲紅, 張拓, 孫士群 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院