一種高效擴(kuò)增核酸分子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效擴(kuò)增核酸分子的方法，在PCR反應(yīng)體系中加入HU蛋白、HUα或β亞基同源二聚體，HU蛋白、HUα或β亞基同源二聚體和模板DNA的摩爾比例在1-200區(qū)間。在PCR反應(yīng)的過(guò)程中，HU不但比SSB蛋白的更優(yōu)，還能抑制非特異性片段的擴(kuò)增。這與之前人們認(rèn)為只有單鏈DNA結(jié)合蛋白能促進(jìn)PCR效率，而雙鏈DNA結(jié)合蛋白會(huì)抑制PCR效率的認(rèn)識(shí)不一致。本發(fā)明的應(yīng)用，將有助于解決現(xiàn)有PCR技術(shù)所存在的擴(kuò)增效率低，存在非特異性產(chǎn)物污染等問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】-種高效擴(kuò)增核酸分子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸分子的擴(kuò)增及克隆【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效擴(kuò)增核酸分子的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] PCR是一種在體外模擬DNA復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)。Mullis于1985年發(fā)明該技術(shù)， 并于1995年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)模擬了體內(nèi)DNA的天然復(fù)制過(guò)程。PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物設(shè)計(jì)。PCR主要由循環(huán)進(jìn)行的高溫變 性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟構(gòu)成。具體而言，即在高溫下將待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈解鏈 成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫情況下，寡核苷酸引物與單鏈DNA模板結(jié)合，退火形成 部分雙鏈；在DNA聚合酶的最適溫度下，以引物3'端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿 5' 一 3'方向延伸，合成DNA新鏈。每經(jīng)過(guò)一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)，就成了 兩條新的雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)25?30個(gè) 循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增IO 9倍以上。
[0003] 因PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、簡(jiǎn)單快速、對(duì)樣本的純度要求低、可對(duì)模板 數(shù)定量等優(yōu)點(diǎn)，在生物科學(xué)眾多領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。在分子生物學(xué)研究中，PCR是必備的 基礎(chǔ)技術(shù)之一；在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)已應(yīng)用于乙肝病毒等病原體的檢 測(cè)；PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)、法醫(yī)鑒定、古生物學(xué)研究等方面也有不可替代的作用。
[0004] 在實(shí)際應(yīng)用中，PCR技術(shù)仍存在一些需要改進(jìn)的問(wèn)題，如特異性、靈敏度、反應(yīng)速度 等問(wèn)題，最突出的問(wèn)題就是存在不同程度的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其原因可能是引物模 板錯(cuò)配、引物結(jié)合形成二聚體等引起的擴(kuò)增等等?？茖W(xué)家們從不同的角度來(lái)嘗試解決這個(gè) 問(wèn)題，如從模板、引物、Mg 2+濃度、退火溫度等角度改善其特異性，或者將增效劑如聚乙二醇 (PEG)、右旋糖酐（Dextran)、聚鹿糖（Ficoll)、樹(shù)狀大分子等引入PCR體系。這些增效劑在 一定程度上可以實(shí)現(xiàn)增加 PCR擴(kuò)增效率的目的。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，有時(shí)效果仍不盡如 人意。高分子增效劑在加入反應(yīng)體系后，在提高PCR目標(biāo)產(chǎn)物靈敏度的同時(shí)，也增加了 PCR 非特異性產(chǎn)物的強(qiáng)度。如何提高PCR擴(kuò)增的特異性是必須解決的問(wèn)題。
[0005] 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，美國(guó)專利US PATENT 5, 646, 019公開(kāi)了"一種利于 引發(fā)擴(kuò)增核酸模板的制備方法"，該方法是在PCR體系里加入了耐熱的單鏈結(jié)合蛋白（SSB， single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只結(jié)合單鏈DNA，但不結(jié)合雙 鏈DNA，通過(guò)結(jié)合并抑制含有單鏈的非特異性片段的擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)了 PCR擴(kuò)增的優(yōu)化。
[0006] 單鏈 DNA 結(jié)合蛋白（single-strand DNA blinding protein，SSB)，即結(jié)合在單鏈 DNA上的一類蛋白，它參與所有生物中的大部分的細(xì)胞途徑。SSB(單鏈DNA結(jié)合蛋白）在 DNA進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)等生理過(guò)程中起著重要的角色，主要表現(xiàn)在于dsDNA (雙鏈DNA) 解旋時(shí)結(jié)合在ssDNA(單鏈DNA)上，保障ssDNA的穩(wěn)定，以防ssDNA重新配對(duì)成雙鏈或被核 酸酶降解，從中對(duì)ssDNA起到相應(yīng)的保護(hù)作用。除了對(duì)ssDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用之外，SSB還 促進(jìn)同源的核苷酸鏈進(jìn)行配對(duì)。在PCR體系里加入耐熱的SSB，SSB蛋白只結(jié)合單鏈DNA， 但不結(jié)合雙鏈DNA，通過(guò)結(jié)合并抑制含有單鏈的非特異性片段的擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的 優(yōu)化。美國(guó)專利5, 646, 019公開(kāi)了"一種利于引發(fā)擴(kuò)增核酸模板的制備方法"，該方法就是 在PCR體系里加入了耐熱的SSB。
[0007] 大腸桿菌菌株U93來(lái)源的組蛋白樣蛋白（HU)是一種與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的 蛋白。細(xì)菌染色體的有效高度壓縮并有序排列，需要許多蛋白的參與。其中HU是一種主要 蛋白，除了維持DNA的超螺旋和壓縮狀態(tài)外，對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)也起到具體的作用，例如DNA的 彎曲，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，核蛋白復(fù)合物的裝配所需的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，和起始于復(fù)制原點(diǎn) 的復(fù)制，和通過(guò)蛋白質(zhì)-RNA相互作用控制翻譯起始等。HU由兩個(gè)同源亞基（α和β)組 成，可非特異性結(jié)合雙鏈DNA，也有發(fā)現(xiàn)其對(duì)于缺口和彎曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但 能像結(jié)合單鏈DNA的SSB蛋白一樣與單鏈DNA結(jié)合，同時(shí)還能結(jié)合雙鏈的DNA。目前從沒(méi)有 人報(bào)道雙鏈DNA結(jié)合蛋白對(duì)PCR擴(kuò)增影響的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種高效擴(kuò)增核酸分子的方法，該方法能夠特異性地、高效 地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸序列。在該核酸擴(kuò)增方法中，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中，添加一定濃度的HU 蛋白，就能夠成功地只對(duì)目標(biāo)核酸序列特異性地進(jìn)行高效擴(kuò)增。
[0009] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種高效擴(kuò)增核酸分子的方法，在PCR反應(yīng)體系中 加入HU蛋白、HUa或β亞基同源二聚體。
[0010] 本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，所述HU蛋白、HUa或β亞基同源二聚體和模板DNA的摩 爾比例在1-200區(qū)間。
[0011] 引物的核苷酸序列如下：上游引物為5' -ATGACCAAGTCAGAATTGATAG-3'，其核苷酸 序列如SEQIDN0. 3所示；下游引物為5' -ACCGTAAATATTGGCGCGATCG-3'，其核苷酸序列如 SEQIDN0. 4 所示。
[0012] HU蛋白具體按照以下步驟制備：
[0013] 步驟1、將來(lái)源于大腸桿菌U93的HU的2個(gè)亞基的基因片段，插入ρ ETDuet 載體中，通過(guò)連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá)載體 pETDuet-HU，其中，HU的2個(gè)亞基為HU a和HU β，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示；
[0014] 步驟2、將構(gòu)建好的重組載體pETDuet-HU轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，取含重組質(zhì)粒的陽(yáng) 性菌株經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜，菌液按1 %比例接種到30ml的LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖床培養(yǎng)至其OD 值為1. 〇 ;將菌液放入42°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)；
[0015] 步驟3、取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心，收集菌體；
[0016] 菌體重選于溶液A中；離心30分鐘；上清中加入PEG6000至終濃度15% ;混合物 在4度攪拌2小時(shí)，混勻；離心30分鐘；上清液4度透析24小時(shí)，透析液為溶液B ;離心20 分鐘；上清過(guò)肝素 S印harose色譜柱，以溶液B為洗脫溶液，用0. 2M至IM的NaCl鹽濃度梯 度洗脫；合并含HU的洗脫液，以溶液B為透析液透析過(guò)夜；透析后經(jīng)磷酸纖維素柱純化，以 溶液B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫，得到HU蛋白。
[0017] HUa或β亞基同源二聚體具體按照以下步驟制備：
[0018] 步驟1、將來(lái)源于大腸桿菌U93的HUa或Ηυβ亞基分別插入ρΕΤ22表達(dá)載體中， 通過(guò)連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá)載體pET22-HU α或 者 PET22-HU3 ;
[0019] 步驟2、將構(gòu)建好的重組載體pET22-HU α或者PET22-HU β轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 取含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜，菌液按1%比例接種到30ml的LB培養(yǎng)液中，放入 37°C搖床培養(yǎng)至其OD值為I. 0 ;將菌液放入42°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)；
[0020] 步驟3、取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心，收集菌體；
[0021] 菌體重選于溶液A中；離心30分鐘；上清中加入PEG6000至終濃度15%。混合物 在4度攪拌2小時(shí)，混勻；離心30分鐘；上清液4度透析24小時(shí)，透析液為溶液B ;離心20 分鐘；上清過(guò)肝素 S印harose色譜柱，以溶液B為洗脫溶液，用0. 2M至IM的NaCl鹽濃度梯 度洗脫；合并含HU的洗脫液，以溶液B為透析液透析過(guò)夜；透析后經(jīng)磷酸纖維素柱純化，以 溶液B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫，得到HUa或者蛋白β同源二聚體。
[0022] 溶液 A 為 20mM Tris-HCl, I. 7Μ NaCl, ImM EDTA，ImM 巰基乙醇，ρΗ7· 8。
[0023] 溶液 B 為 20mM Tris-HCl，ImM EDTA，ρΗ7· 8。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是：大腸桿菌菌株U93來(lái)源的組蛋白樣蛋白（HU)是一種與DNA 非特異性結(jié)合的蛋白。細(xì)菌染色體的有效高度壓縮并有序排列，需要許多蛋白的參與。其 中HU是一種主要蛋白，除了維持DNA的超螺旋和壓縮狀態(tài)外，對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)也起到具體的 作用，例如DNA的彎曲，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，核蛋白復(fù)合物的裝配所需的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)， 和起始于復(fù)制原點(diǎn)的復(fù)制，和通過(guò)蛋白質(zhì)-RNA相互作用控制翻譯起始等。HU由兩個(gè)同源亞 基（α和β)組成，可非特異性結(jié)合雙鏈DNA，也有發(fā)現(xiàn)其對(duì)于缺口和彎曲的DNA有特定偏 好。HU蛋白不但能像結(jié)合單鏈DNA的SSB蛋白一樣與單鏈DNA結(jié)合，同時(shí)還能結(jié)合雙鏈的 DNA。
[0025] 本發(fā)明在研究HU的功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)在一定條件下，其可以顯著地促進(jìn)PCR擴(kuò)增的效 率。也就是說(shuō)：在PCR反應(yīng)的過(guò)程中，HU不但比SSB蛋白的更優(yōu)，還能抑制非特異性片段的 擴(kuò)增。這與之前人們認(rèn)為只有單鏈DNA結(jié)合蛋白能促進(jìn)PCR效率，而雙鏈DNA結(jié)合蛋白會(huì) 抑制PCR效率的認(rèn)識(shí)不一致。本發(fā)明的應(yīng)用，將有助于解決現(xiàn)有PCR技術(shù)所存在的擴(kuò)增效 率低，存在非特異性產(chǎn)物污染等問(wèn)題。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是HU蛋白對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物影響的電泳圖；
[0027] M:DNA分子量Marker ;1 :市售PCR試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入 0· lpmol HU蛋白；3 :PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入0· 2pmol HU蛋白；4 :PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入0· 5pmol HU蛋白；5:PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入lpmol HU蛋白；6:PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入5pmol HU蛋白；7: PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入IOpmol HU蛋白；
[0028] 圖2是HU蛋白同源二聚體對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物影響的電泳圖；
[0029] M :DNA分子量Marker ;1 :市售PCR試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物；2-5 :PCR反應(yīng)體系內(nèi)分別 加入0. 1，0. 5，l，2pmol HUa亞基同源二聚體蛋白；6-9:PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入0. 1，0. 5，1， 2pmol Ηυβ亞基同源二聚體蛋白；
[0030] 圖3是HU的表達(dá)質(zhì)粒載體；采用雙表達(dá)載體pETDuet，同時(shí)表達(dá)HU的兩個(gè)亞基；
[0031] 圖4是HUa或β亞基的表達(dá)質(zhì)粒載體；采用表達(dá)載體PET22,表達(dá)HU的a或β 亞基。
[0032] 圖5是HU蛋白對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響的量效關(guān)系。M :DNA分子量Marker ;泳道1-13 : HU 與模板 DNA 的摩爾比例分別為 0· 2,0. 5,1，2, 5,10, 20, 50,100, 200, 500,1000, 2000。
[0033] 圖6是HU α亞基的同源二聚體對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響的量效關(guān)系。M :DNA分子量 Marker ;泳道1-8 :HUa亞基的同源二聚體與模板DNA的摩爾比例分別為1，2, 5,10, 20, 50， 100,200。
[0034] 圖7是HU β亞基的同源二聚體對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響的量效關(guān)系。M :DNA分子量 Marker ;泳道1-9 :Ηυβ亞基的同源二聚體與模板的摩爾比例分別為0. 001，0. 05,0. 5,1，2， 5,10, 20, 50〇

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。但本發(fā)明保護(hù)范圍不局 限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方 法。
[0036] 實(shí)施例I :HU蛋白、HUa或β亞基同源二聚體的制備
[0037] ①將來(lái)源于大腸桿菌U93的HU的2個(gè)亞基的基因片段（HUa和β亞基，其核苷 酸序列如SEQ ID :1和SEQ ID :2所示）插入pETDuet-Ι載體中（如圖3所示），通過(guò)連接 轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá)載體pETDuet-1-HU。
[0038] ②將構(gòu)建好的重組載體PET22-HU轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a。取含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株 經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜，菌液按1 %比例接種到30ml的LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖床培養(yǎng)至其OD值為 1. 〇 ;將菌液放入42°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。
[0039] ③取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心。菌體重懸于溶液A(4度）中。溶液A為：20mM Tris-HCl, I. 7M NaCl, ImM EDTA, ImM 巰基乙醇，ρΗ7· 8。
[0040] 將細(xì)胞重懸液離心（6000g) 30分鐘，上清中加入PEG6000至終濃度15%?；旌衔?在4度攪拌混勻2小時(shí)后，離心（12000g) 30分鐘。
[0041] 上清加入飽和硫酸銨溶液至80%，4度離心（13000g) 20分鐘。收集沉淀，以溶液 B(20mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH7. 8)溶解。然后在4度透析24小時(shí)，透析液為溶液B，離心 (12000g)20 分鐘。
[0042] 上清過(guò)肝素 S印harose色譜柱，以溶液B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫。合 并含HU的洗脫液，以溶液B為透析液透析過(guò)夜。
[0043] 透析后經(jīng)磷酸纖維素柱純化，以溶液B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫。得到 HU蛋白。保存在4°C待用。
[0044] 若制備HUa或β亞基同源二聚體，只需要HUa或HUβ亞基插入pET22表達(dá)載 體（如圖4所示）中，通過(guò)連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá) 載體pET22_HUa或者 ΡΕΤ22-Ηυβ，其余步驟同上，即可制備得到HUa或β亞基同源二聚 體。
[0045] 實(shí)施例2 :HU蛋白對(duì)PCR反應(yīng)的影響
[0046] ①PCR反應(yīng)體系
[0047] 每10 μ 1體系包含：
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，在PCR反應(yīng)體系中加入HU蛋白、或 HU a亞基同源二聚體、或HUP亞基同源二聚體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述HU蛋白、或 HU a亞基同源二聚體、或HUP亞基同源二聚體和模板DNA的摩爾比例在1-200區(qū)間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述引物的核苷酸 序列如下：上游引物為5'-ATGACCAAGTCAGAATTGATAG-3'，其核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示； 下游引物為5' -ACCGTAAATATTGGCGCGATCG-3'，其核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述HU蛋白具體按 照以下步驟制備： 步驟1、將來(lái)源于大腸桿菌U93的HU的2個(gè)亞基的基因片段，插入pETDuet載體中， 通過(guò)連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá)載體pETDuet-HU，其 中，HU的2個(gè)亞基為HU a和HU 0，其核苷酸序列分別如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示； 步驟2、將構(gòu)建好的重組載體pETDuet-HU轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，取含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌 株經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜，菌液按1%比例接種到30ml的LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖床培養(yǎng)至其0D值 為1. 〇 ;將菌液放入42°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)； 步驟3、取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心，收集菌體； 菌體重選于溶液A中；離心30分鐘；上清中加入PEG6000至終濃度15% ;混合物在4 度攪拌2小時(shí)，混勻；離心30分鐘；上清液4度透析24小時(shí)，透析液為溶液B ;離心20分 鐘；上清過(guò)肝素S印harose色譜柱，以溶液B為洗脫溶液，用0. 2M至1M的NaCl鹽濃度梯度 洗脫；合并含HU的洗脫液，以溶液B為透析液透析過(guò)夜；透析后經(jīng)磷酸纖維素柱純化，以溶 液B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫，得到HU蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述HUa或0亞基 同源二聚體具體按照以下步驟制備： 步驟1、將來(lái)源于大腸桿菌U93的HUa或HUP亞基分別插入pET22表達(dá)載體中，通 過(guò)連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，即可得到重組表達(dá)載體pET22-HU a或者 pET22-卿； 步驟2、將構(gòu)建好的重組載體pET22-HU a或者PET22-HU 0轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，取含 重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜,菌液按1 %比例接種到30ml的LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖 床培養(yǎng)至其0D值為1. 0 ;將菌液放入42°C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)； 步驟3、取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心，收集菌體； 菌體重選于溶液A中；離心30分鐘；上清中加入PEG6000至終濃度15%，混合物在4度 攪拌2小時(shí)，混勻；離心30分鐘；上清液4度透析24小時(shí)，透析液為溶液B ;離心20分鐘； 上清過(guò)肝素S印harose色譜柱，以溶液B為洗脫溶液，用0. 2M至1M的NaCl鹽濃度梯度洗 脫；合并含HU的洗脫液，以溶液B為透析液透析過(guò)夜；透析后經(jīng)磷酸纖維素柱純化，以溶液 B為洗脫溶液，NaCl鹽濃度梯度洗脫，得到HU a或者0同源二聚體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述溶液A為 20mMTris-HCl, 1. 7MNaCl, ImMEDTA，ImM 巰基乙醇，pH7. 8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的高效擴(kuò)增核酸分子的方法，其特征在于，所述溶液B為 20mMTris-HCl, ImMEDTA, pH7. 8。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104388419SQ201410539899
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】戚智青, 刁勇, 杜民 申請(qǐng)人:戚智青, 刁勇, 杜民