一種聯(lián)合檢測禽流感h4和h6亞型的雙色熒光定量pcr試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聯(lián)合檢測禽流感H4和H6亞型的雙色熒光定量PCR試劑盒及檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測出待測標(biāo)本中是否含禽流感病毒H4亞型和禽流感病毒H6亞型兩種病原體，并能夠?qū)崟r精確檢測并對病毒進(jìn)行定量，應(yīng)用極為方便。由于引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高、容易漏診和誤診的問題，基于上述優(yōu)點(diǎn)，該試劑盒適合在各級動物衛(wèi)生監(jiān)督所、動物疫病預(yù)防控制中心動物醫(yī)院和各種動物疾病研究機(jī)構(gòu)等大規(guī)模篩查的推廣應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種聯(lián)合檢測禽流感卜4和卜6亞型的雙色熒光定量試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種聯(lián)合檢測禽流感財和冊亞型的雙色熒光定量試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬八型病毒引起的一種禽類感染或疾病綜合征。禽流感的發(fā)病情況取決于病毒的致病性及一級宿主的易感性，也受環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件及并發(fā)疾病等因素的影響，可表現(xiàn)為無癥狀感染、輕度上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋量下降及急性的致病性死亡。
[0003]2008年我國南方活禽市場監(jiān)測到一株鴨源亞型禽流感病毒(?相2),而從2009年起在中國南方禽流感疫情監(jiān)測中分離到多株財亞型禽流感病毒(八IV〉，目前發(fā)現(xiàn)的禽流感亞型尚未形成對哺乳動物的全身性感染，但病毒來源復(fù)雜，抗原和基因型差異大，若
亞型禽流感與高致病禽流感發(fā)生重組有可能構(gòu)成巨大的危害。
[0004]冊亞型禽流感，在家禽中廣泛存在，致病性和傳播力都比較低。2013年6月，臺灣出現(xiàn)全球首例冊附患者，雖然只是個案，但表明冊亞型禽流感有潛在的傳染人的能力。
[0005]由于!14、冊禽流感不具備高致病性，且未出現(xiàn)規(guī)模性的哺乳動物感染，目前常規(guī)的!14和冊檢測方法，還是血清學(xué)診斷方法，其中最常用的為血凝(撤)及血凝抑制(?)試驗(yàn)，市場上鮮有相應(yīng)的？(?試劑盒檢測產(chǎn)品。血清學(xué)診斷方法建立在已發(fā)生病毒感染并產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)上，而且由于禽流感病毒具備高度變異性和重組性，很容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。使用病毒分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行檢測，操作繁瑣，耗時長，難以大規(guī)模推廣。用普通？(?的方法，相比前面所說的方法靈敏度和可操作性都有提升，然而后續(xù)的瓊脂糖凝膠電泳仍然不夠簡便，且容易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增和產(chǎn)物污染。
[0006]實(shí)時町-？邙(1631 “1116町-？邙，冊1-？00又稱I叫1冊？⑶。冊1-？邙檢測禽流感快速、敏感、特異，由于其不僅采用了特異性引物，而且采用了特異性探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)？(?，大大減少了非特異性擴(kuò)增造成的假陽性結(jié)果。全封閉反應(yīng)的熒光尺丁-？0？技術(shù)是通過計算機(jī)記錄并分析過程中產(chǎn)生的熒光信號，實(shí)現(xiàn)了對擴(kuò)增過程實(shí)時監(jiān)測，無需電泳檢測，徹底杜絕了產(chǎn)物的氣溶膠污染和￡8對環(huán)境的污染。應(yīng)用一步法奶-？0？和熒光水解探針，用于檢測八型禽流感，其敏感度很高，可達(dá)10 # (約100個)的靶觀八分子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種聯(lián)合檢測禽流感和冊亞型的雙色熒光定量試劑盒及檢測方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種聯(lián)合檢測禽流感財和冊亞型的雙色熒光定量試劑盒，所述試劑盒包含: 用于檢測禽流感病毒財亞型的引物和探針，其序列如下:
！！4-？:5’^ (820 10 ^0.1),
??！4-尺:5’ -00^11016^0^6000^0^-3^ (820 10 ^0.2),
??！4-？:5’ - 1601161^60^016011116600110^ -3’ (820 10 勵.3)；
和用于檢測禽流感病毒冊亞型的引物和探針，其序列如下:
冊-？:5’ - 106^60^6101^61111661^66^ -3’ (820 10 ^0.4),
冊-尺:5’ - 0^0X60^1X6^00^X1X6^0^ -3’ (820 10 ^0.5),
冊-？:5’ - 16^10^X660^X^66 - 168-3^ (820 10 勵.6)；
其中，熒光探針財-？和冊-？的報告基團(tuán)不相同。
[0009]優(yōu)選的，所述試劑盒還包含10父雙色熒光定量？⑶1x1打61'，其含有以下成分:5001111 11-18-1101 (邱8.0)、50禮 1 甙 12、250禮 1(01 以及 15乂八% 的 0130。
[0010]優(yōu)選的，所述試劑盒還包含病毒核酸提取液八、病毒核酸提取液8 ；病毒提取液八每 10001111 中含有:異硫氰酸胍 4808,0.1I 丁士-魁(邱 6.4) 5001111,0.21 201'八(邱8.0)1201111 ；病毒提取液8為異丙醇。
[0011]一種聯(lián)合檢測禽流感??！4和冊亞型的雙色熒光定量方法，包括以下步驟:
1)提取待測樣品中的總八；
2)以得到的總I？嫩為模板，使用用于檢測禽流感病毒財亞型的引物和探針 ！！4-？:5’^ (820 10 ^0.1),
??！4-尺:5’ -00^11016^0^6000^0^-3^ (820 10 ^0.2),
??！4-？:5’ - 1601161^60^016011116600110^ -3’ (820 10 ^0.3),
和用于檢測禽流感病毒冊亞型的引物和探針冊-？:5’ - 106^60^6101^61111661^66^ -3’ (820 10 ^0.4),
冊-尺:5’ - 0^0X60^1X6^00^X1X6^0^ -3’ (820 10 ^0.5),
冊-？:5’ - 16^10^X660^X^66 -168 -3’ (820 10 勵.6)；
進(jìn)行雙色熒光定量？(?檢測，其中，熒光探針財-？和冊-？的報告基團(tuán)不相同；
3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光以值判斷待測樣品是否為禽流感病毒114亞型、禽流感病毒冊亞型陽性。
[0012]優(yōu)選的，雙色熒光定量？⑶反應(yīng)體系總體積為25^ 1，其組成如下:雙色熒光定量組X 20耵，反轉(zhuǎn)錄酶、酶混合液1沿，以及提取的待測樣品中的總I？嫩或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品仙1 ；其中，雙色熒光定量？⑶中含有!！4-？、?。?-1？、！14-？、冊-？、冊-尺、冊-？以及10 X雙色熒光定量？⑶1x1打61'、伽??？3。
[0013]優(yōu)選的，所述10父雙色熒光定量？⑶1x1打6含有以下成分:500禮！^18-此1(邱8.0)、50禮 1 甙 12、250禮 1(01 以及 15乂八% 的 0130。
[0014]雙色熒光定量的組成為:
10 X雙色熒光定量？⑶1X1打61~2.5沿
??！4-？ (10 剛)1耵
114-1？ (10 剛)1耵
冊-？(10剛)1耵
116-1？ (10剛)1耵 114-？ (10剛)0.5耵
冊-？ (10剛)0.5耵
(101111)1耵
己冊# (1^11886 ^1-06)11.5)^-1
總體積20.0 9 1。
[0015]優(yōu)選的，雙色熒光定量？⑶反應(yīng)條件為:931 2分鐘，931 5?30秒，55?58145秒，40個循環(huán)。
[0016]優(yōu)選的，步驟3)結(jié)果分析的條件設(shè)定如下:
1)設(shè)置基線:對八817000、7500、7700儀器設(shè)為6?15個循環(huán)，對？￡5700設(shè)為3?15個循環(huán)，對町1？68681~011 0^)1:10112儀器設(shè)為6?12個循環(huán)；
2)設(shè)置閾值:以閾值線剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為原則。
[0017]優(yōu)選的，步驟3)結(jié)果分析判斷方法如下:
1)陽性:以值小于等于35.0，且曲線有指數(shù)增長期；
2)可疑:以值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果以值仍小于40.0，且曲線有指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
3)陰性:檢測不到樣品以值或以值為40。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了一種聯(lián)合檢測禽流感財和冊亞型的雙色熒光定量？(?試劑盒及檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測出待測標(biāo)本中是否含禽流感病毒財亞型和禽流感病毒冊亞型兩種病原體，并能夠?qū)崟r精確檢測并對病毒進(jìn)行定量，應(yīng)用極為方便。由于引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高、容易漏診和誤診的問題，基于上述優(yōu)點(diǎn)，該試劑盒適合在各級動物衛(wèi)生監(jiān)督所、動物疫病預(yù)防控制中心動物醫(yī)院和各種動物疾病研究機(jī)構(gòu)等大規(guī)模篩查的推廣應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為應(yīng)用本發(fā)明聯(lián)合檢測禽流感!14和冊亞型的雙色熒光定量？(?試劑盒對禽流感病毒財亞型(八^-財)檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為1 X 108、1 X 107、1 X 106、IX 105、1X104、1X103、1X102拷貝/ 9 1的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0020]圖2為應(yīng)用本發(fā)明聯(lián)合檢測禽流感和冊亞型的雙色熒光定量試劑盒對禽流感病毒冊亞型(八^-冊)檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 XI。5、IX 104、1X103、1X102拷貝/^1的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0021]圖3為應(yīng)用本發(fā)明聯(lián)合檢測禽流感!14和冊亞型的雙色熒光定量？⑶試劑盒對檢測的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0022]圖4為應(yīng)用本發(fā)明聯(lián)合檢測禽流感和冊亞型的雙色熒光定量試劑盒對檢測的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0024]特異性引物及探針的設(shè)計:
根據(jù)從66111351111^上檢索到的禽流感病毒(八111^11161128 ^11*118 )111?!116的核酸序列，設(shè)計用于檢測禽流感病毒財亞型和禽流感病毒冊亞型的引物和探針，其序列如下:禽流感病毒財亞型(八^-財)的
上游引物出4-？:5’^ (820 10 ^0.1),
下游引物砸-尺:5，-00^11016^0^6000^0^-3^ (卿 10 ^0.2),
熒光探針出4-？:5’- 1601161^60^016011116600110^ -3，(卿 10 勵.3),擴(kuò)增片段長度為75恥；
和
禽流感病毒冊亞型(八^-冊)的
上游引物:冊-？:5’ - 106^60^6101^61111661^66^ -3’ (820 10 ^0.4),
下游引物:冊-尺:5’ — 0^0X60^1X6^00^X1X6^0^ -3，(卿 10 ^0.5),
熒光探針:冊-？:5’- 16^10^X660^X^66 -168 -3’ (820 10勵.6),擴(kuò)增片段長度為136如。
[0025]進(jìn)行雙色熒光定量？(?檢測，其中，禽流感病毒!14亞型報告基團(tuán)為1?%禽流感病毒冊亞型的突光探針報告基團(tuán)為乂化。
[0026]標(biāo)本采集和預(yù)處理:
本方法及試劑盒適用標(biāo)本類型包括禽類的組織、血清、咽拭子、分泌排泄物等。
[0027]組織標(biāo)本:無菌條件下取組織約100?200呢，置入1.5^1潔凈2？管中，保存待檢。
[0028]血清:用一次性無菌注射器抽取受檢鳥靜脈血3-51111，留取血清，保存待檢。
[0029]咽及泄殖腔等拭子:用棉拭子取咽或泄殖腔分泌物，將拭子放入盛有1.0“ ？88的離心管中，立即送檢。
[0030]分泌排泄物:無菌條件下采集，保存待檢。采集的標(biāo)本應(yīng)該盡快送檢，或者保存于-20。。。
[0031]陽性質(zhì)控品的制備:
分別以禽流感病毒財亞型(八^-財)和禽流感病毒冊亞型(八^-冊)^標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行？⑶擴(kuò)增，步驟如下:
反轉(zhuǎn)錄體系:
011職(11(50 111) 111 1,^1？ 11x^111-6 (101111 ) 19 1 以及總尺嫩 211 8,65^0
5111111，激冷，然后加入811 打 61~ 4^1 (1711(4狀公司〉、觀386 1111111311:01-
(40口/9 1) 0.511 1,^1-11116801-11)^ 尺丁已86 (200 口/9 1) 19 1 和陬886 ^1-66 ??！20 4.5 91。
[0032]反轉(zhuǎn)錄條件:
3000 10111111,然后421，30111111,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和成嫩。
[0033]？01？體系:
10 X？。??？ 811^61- 5 11 1,I'叫(51/^1) 111 1、做I？ 11x^11*6 (各 2.5^)
4 9 1、上述！14和冊上下游引物(10 ^1)各0.5^1 1、上述嫩0.5^1^^2186仕66 ??！2039.25 9 1。
[0034]？邙條件:
按照941 3分鐘預(yù)變性，941 30秒，601 30秒，721 45秒，共35個循環(huán)，721延伸10分鐘。
[0035]反應(yīng)后取5^1 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，將切膠純化的產(chǎn)物與1)10-181載體連接，重組質(zhì)粒1)10-181'-!14或￠10-181'-冊涂布于培養(yǎng)皿上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)0冊0細(xì)胞，挑取陽性菌落抽提質(zhì)粒，取品5 9 1稀釋測其八26011111和八28011111吸光度值，計算其濃度并換算成絕對拷貝數(shù)，稀釋成1.0X107拷貝1，作為雙色熒光定量？(?的陽性質(zhì)控品。
[0036]謂\的提取:
1)固體組織:取0.左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入1.501生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻衆(zhòng)后轉(zhuǎn)至1.51111的2？管中，1000011)111離心2111111，取上清100 1于1.51111的管中，加入200 4 1 ^提取液八充分震蕩，靜置3111111 ；
2)血清或病毒液:取100^1血清加入200^ 1 I？嫩提取液八充分震蕩，靜置3-11,然后加入200 口1 I？嫩提取液8，用力震蕩158，41 13，00(^,離心5-11 ；
3)棄上清，加入1111175%乙醇，充分混勻，13，00011)111離心5111111，小心吸去大部分殘留液體；
4)將提取管敞口在室溫空氣中干燥10111111，使液體揮發(fā)干凈，用20^1 029(:處理水溶解沉淀即為待檢測的病毒八。
[0037]雙色熒光定量擴(kuò)增:
每個測試反應(yīng)體系配制如下，雙色？(? 20^ 1、反轉(zhuǎn)錄酶系0.5耵、1^酶系0.5沿，瞬時離心，然后加入待檢測的價仏4耵；同樣按照上述體系設(shè)置陽性和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品4^ 1進(jìn)行擴(kuò)增。
[0038]將各反應(yīng)管放入定量？(?儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類(檢測八的報告基團(tuán)選擇？八1，檢測八^-冊的報告基團(tuán)選擇VII淬滅基團(tuán)選擇 I'艦狀)，設(shè)定循環(huán)條件:八817700、八81 ？豇315700、八81 66116^ 7000、八81^1^1817300/7500,11 0的1(3011等儀器循環(huán)條件為93。〇2分鐘，931 30秒，55。。45秒，40個循環(huán)山1曲比％161'等使用毛細(xì)管的儀器循環(huán)條件為931 2分鐘，931 5秒，581 45秒，共40個循環(huán)。
[0039]結(jié)果分析和判定:
1、結(jié)果分析條件設(shè)定
1)設(shè)置基線(1^8611116):對八81 7000、7500、7700 等儀器設(shè)為 6-15。7。16，對？25700 設(shè)為3-15。7。16，對町1^68681-011 0的10112設(shè)為6-12。7。16。特殊情況可對基線適當(dāng)調(diào)整。
[0040]2)設(shè)置閾值“匕⑶““):以閾值線剛超過陰性對照擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最聞點(diǎn)。
[0041]2、結(jié)果判斷
(1)陽性:檢測樣本以值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；
(2)可疑:檢測樣本以值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果以值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
(3)陰性:檢測不到樣本以值或以值為40。
[0042]靈敏度實(shí)驗(yàn):
上述陽性質(zhì)控品(107拷貝/9 1),依次稀釋為1.0 XI。5、1.0X103、1.(^10^1.0X10?？截?，進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。
[0043]雙色熒光定量體系中八檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)見圖1，雙色熒光定量體系中八^-冊檢測的敏感性實(shí)見圖2。圖1為雙色熒光體系中八檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為 1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102 拷貝 / 9 1 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。圖2為雙色熒光體系中八^-冊檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為1 X 108.1 X 107.1 X 106.1 X 105.1 X 10\ 1 X 103.1 X 102 拷貝 / II 1 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0044]結(jié)果證實(shí)本試劑盒檢測靈敏度為丄0\10、1—\該雙色熒光定量？(?的方法敏感度為普通的200倍，精確性優(yōu)于普通方法。
[0045]特異性實(shí)驗(yàn):
根據(jù)上述的雙色熒光定量檢測方法，用禽流感病毒財亞型、禽流感病毒冊亞型、二者雙陽性以及其它病毒如豬流感犯附、新城疫病毒(冊V〉、禽流感病毒冊附亞型(八^-冊附)、禽流感病毒??！7卿亞型(八禽流感病毒冊吧(八17-?撕2\陰性對照進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并對產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明方法及試劑盒特異性好，未出現(xiàn)假陽性，吻合度為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4。
[0046]圖3為雙色方法？⑶體系中禽流感病毒!14亞型(八^-財)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，八1乂-?。?為陽性、317-?謂1、六IV-冊附、六^-冊附、六1乂-??！7啪、六1乂-！1撕2、冊乂及陰性質(zhì)控品均為陰性。
[0047]圖4為雙色方法？⑶體系中禽流感病毒冊亞型(八^-冊)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，八1乂-冊為陽性、317-?謂1、六1乂-！1相2、六^-冊附、六1乂-！！7啪、六1乂-！1撕2、冊乂及陰性質(zhì)控品均為陰性。
【權(quán)利要求】
1.一種聯(lián)合檢測禽流感H4和H6亞型的雙色熒光定量PCR試劑盒，所述試劑盒包含: 用于檢測禽流感病毒H4亞型的引物和探針，其序列如下:
H4-F:5’ -GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’ (SEQ ID N0.1),
H4-R:5’ -CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’ (SEQ ID N0.2),
H4-P:5’ - TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’ (SEQ ID N0.3)； 和用于檢測禽流感病毒H6亞型的引物和探針，其序列如下:
H6-F:5> - TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’ (SEQ ID N0.4),
H6-R:5’ - CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’ (SEQ ID N0.5),
H6-P:5’ - TGATCATGGCAATAGG -MGB-3’ (SEQ ID N0.6)； 其中，熒光探針H4-P和H6-P的報告基團(tuán)不相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含10X雙色熒光定量PCR buffer，其含有以下成分:500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2、250mM KC1 以及 15v/v% 的 DMSO。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B ;病毒提取液A每1000ml中含有:異硫氰酸胍480g，0.1M Tris-HCl(pH 6.4) 500ml, 0.2M EDTA (pH8.0) 120ml ;病毒提取液 B 為異丙醇。
4.一種聯(lián)合檢測禽流感H4和H6亞型的雙色熒光定量PCR方法，包括以下步驟: 1)提取待測樣品中的總RNA； 2)以得到的總RNA為模板，使用用于檢測禽流感病毒H4亞型的引物和探針 H4-F:5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’ (SEQ ID N0.1),
H4-R:5’ -CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’ (SEQ ID N0.2),
H4-P:5’ - TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’ (SEQ ID N0.3), 和用于檢測禽流感病毒H6亞型的引物和探針
H6-F:5> - TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3’ (SEQ ID N0.4),
H6-R:5’ - CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’ (SEQ ID N0.5),
H6-P:5’ - TGATCATGGCAATAGG -MGB -3’ (SEQ ID N0.6)； 進(jìn)行雙色熒光定量PCR檢測，其中，熒光探針H4-P和H6-P的報告基團(tuán)不相同； 3)結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光Ct值判斷待測樣品是否為禽流感病毒H4亞型、禽流感病毒H6亞型陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:雙色熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μ1，其組成如下:雙色熒光定量PCR Mix 20μ1，反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶混合液?μ?，以及提取的待測樣品中的總RNA或者陽性質(zhì)控品或者陰性質(zhì)控品4μ1 ;其中，雙色熒光定量PCR Mix中含有 H4-F、H4-R、H4-P、H6-F、H6-R、H6-P 以及 10 X 雙色熒光定量 PCR buffer、dNTPS。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述10X雙色熒光定量PCR buffer含有以下成分:500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2、250mM KC1 以及 15v/v% 的 DMSO。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:雙色熒光定量PCRMix的組成為: 10 X雙色熒光定量PCR buffer2.5μ1 H4-F (10μΜ)?μ? H4-R (10μΜ)?μ? H6-F (ΙΟμΜ)?μ? H6-R (ΙΟμΜ)?μ? Η4-Ρ (ΙΟμΜ)0.5μ1 Η6-Ρ (ΙΟμΜ)0.5μ1 dNTPS (10mM)?μ? ddH20 (Rnase free)11.5M-1總體積20.0μ1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4?7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:雙色熒光定量PCR反應(yīng)條件為:93°C 2分鐘，93°C 5?30秒，55?58°C 45秒，40個循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4?7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟3)結(jié)果分析的條件設(shè)定如下: 1)設(shè)置基線:對ABI7000、7500、7700儀器設(shè)為6?15個循環(huán)，對PE5700設(shè)為3?15個循環(huán)，對MJ Research 0pt1n2儀器設(shè)為6?12個循環(huán)； 2)設(shè)置閾值:以閾值線剛好超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為原則。
10.根據(jù)權(quán)利要求4?7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:步驟3)結(jié)果分析判斷方法如下:1)陽性:ct值小于等于35.0，且曲線有指數(shù)增長期； 2)可疑:Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性； 3)陰性:檢測不到樣品Ct值或Ct值為40。
【文檔編號】C12Q1/70GK104313181SQ201410529309
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】徐貴峰, 張曉瑋 申請人:廣州維伯鑫生物科技有限公司