與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于編碼黃瓜轉(zhuǎn)錄因子Csa5G157230基因(Bt基因)起始密碼子上游第1601bp處(SNP-1601)。此處堿基為G的黃瓜果實(shí)苦味表型不穩(wěn)定，易受到外界環(huán)境的影響，在逆境條件(如低溫、干旱等)下，黃瓜果實(shí)易變苦；此處堿基為A的黃瓜則不苦。本發(fā)明以控制果實(shí)苦味合成的轉(zhuǎn)錄因子Bt基因?yàn)榫€索，通過遺傳群體分析篩選到與黃瓜果實(shí)苦味性狀緊密相關(guān)的SNP標(biāo)記，并借助黃瓜無苦味天然突變體闡釋了SNP-1601與Bt基因、Bi基因、逆境脅迫及果實(shí)苦味性狀之間的關(guān)系。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了黃瓜果實(shí)苦味形成的分子機(jī)制，為無苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，利用SNP-1601可加快無苦味黃瓜的育種進(jìn)程。
【專利說明】與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與黃瓜果實(shí)苦味性 狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜的苦味是由一類稱為葫蘆素C的H聰化合物導(dǎo)致的。黃瓜果實(shí)中積累葫蘆素 C會嚴(yán)重影響黃瓜的品質(zhì)。早期的經(jīng)典遺傳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃瓜的苦味有Bi和化兩個(gè)基因控制。 Bi基因主要控制葉片苦味，化基因主要控制黃瓜果實(shí)苦味。其中隱性M基因?qū)蚓?有上位效應(yīng)。通過大規(guī)模重測序W及遺傳分析我們先后克隆了 Bi和化基因，它們分別編 碼氧化角蠻帰環(huán)化酶及bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。Bi基因是苦味合成的關(guān)鍵限速酶，在葉片或黃瓜 中參與苦味的合成?；蛟邳S瓜果實(shí)中特異表達(dá)，通過調(diào)控Bi基因的表達(dá)，控制黃瓜果 實(shí)苦味性狀。通過掲示黃瓜苦味合成、調(diào)控及馴化的分子遺傳機(jī)理，為利用分子標(biāo)記輔助無 苦味黃瓜育種打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位 于編碼黃瓜轉(zhuǎn)錄因子Csa5G157230基因起始密碼子上游第16(Ubp處，此處堿基為G的黃瓜 果實(shí)表型不穩(wěn)定，易受到外界環(huán)境的影響，在逆境條件下黃瓜果實(shí)易變苦，此處堿基為A的 黃瓜則不苦。其中，所述逆境條件包括但不限于低溫、干旱等逆境條件。
[0005] 本發(fā)明中涉及的黃瓜轉(zhuǎn)錄因子Csa5G157230的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。 已在CN 103739685A中公開。
[0006] 本發(fā)明還提供用于檢測所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對，包括 正向引物巧' -TGGTAGGTGTAGCTTAATCATTCTCCTTTG-3' 和反向引物貼' -AAGTTGGTGAAGTAATA GTGTCCAACC-3'。
[0007] 本發(fā)明還提供所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定苦味黃瓜品種中 的應(yīng)用。包括W下步驟：
[000引 1)提取待測黃瓜的基因組DNA ;
[000引 2) W待測黃瓜的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)；
[0010] 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0011] 其中，步驟。中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系W 20y 1計(jì)為；10-20ng/y 1模板DNA Iy l，10pmol/y 1 引物F和 R各 Iy l，10mmol/L dNTP mix 0. 4y 1,0. 5U/UL Taq DNA聚合 酶0.3 y 1，IOXPCR反應(yīng)緩沖液2 y 1，余量為水。
[001引 PCR反應(yīng)條件為；94 °C 5分鐘；94 °C 20砂，58 °C 20砂，72 °C 30砂，35個(gè)循環(huán)； 72 C 10分鐘。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在黃瓜分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用，即根據(jù)基因型進(jìn)行苦味或不苦黃瓜品種的選育，從而加快無苦味黃瓜的 育種進(jìn)程。
[0014] 本發(fā)明首先對115份黃瓜核也種質(zhì)材料進(jìn)行重測序分析，并對該115份材料進(jìn)行 果實(shí)苦味表型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)與黃瓜果實(shí)苦味性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，位于編碼黃瓜轉(zhuǎn) 錄因子Csa5G157230基因炬t基因）起始密碼子上游第16(Ubp處（SNP-1601)。115份材 料中，有9份不能合成苦味的M材料，因此果實(shí)必然是不苦表型。在剩余106份可W合成 苦味的Bi材料中，有69份在SNP-1601處為G，22份為A，剩余15份材料在該位點(diǎn)為雜合 或是不明確。其中，22份在SNP-1601為A的材料在兩年的田間實(shí)驗(yàn)中均未不苦；而69份 在SNP-1601為G的材料中，大部分的材料（42份）在兩年的田間實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)表型不一致情 況，即不苦和苦的表型都出現(xiàn)過，說明其苦味表型易受外界環(huán)境影響，表型不穩(wěn)定。隨機(jī)選 取不同基因型材料的果實(shí)進(jìn)行基因表達(dá)分析及苦味含量檢測，發(fā)現(xiàn)在SNP-1601處為A的不 苦黃瓜材料中Bi和化基因表達(dá)非常低，而在在SNP-1601處為G的黃瓜果實(shí)中Bi和化基 因表達(dá)相對較高（圖1)。因此，SNP-1601有可能通過調(diào)節(jié)黃瓜果實(shí)中的化基因表達(dá)，來控 制其Bi基因的表達(dá)及苦味的含量。
[0015] 此外，還發(fā)現(xiàn)了對逆境脅迫不響應(yīng)的天然突變體han，可W用來進(jìn)一步解析 SNP-1601與化基因、Bi基因、逆境脅迫及果實(shí)苦味表型之間的關(guān)系。在正常生長環(huán)境中， 野生型HAN及其突變體ban均為果實(shí)不苦的黃瓜，但在逆境條件下，如低溫、干旱等，HAN的 果實(shí)變苦，而ban的果實(shí)則仍為不苦。通過對該兩種黃瓜進(jìn)行重測序分析，發(fā)現(xiàn)ban中的突 變就位于SNP-1601，即HAN在SNP-1601中為G;han在SNP-1601中為A。然后構(gòu)建了一個(gè) 由223個(gè)單株組成的巧群體，通過鑒定該些單株的基因型和果實(shí)表型數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)SNP-1601 與果實(shí)苦味表型共分離（圖2)。通過檢測正常環(huán)境下和逆境環(huán)境下，HAN和ban的果實(shí)中 Bi和化基因的表達(dá)量及苦味含量，發(fā)現(xiàn)逆境脅迫使HAN的果實(shí)中化基因的表達(dá)升高，從而 導(dǎo)致Bi基因表達(dá)也升高，最終使果實(shí)中苦味含量升高，黃瓜變苦；突變后該種逆境脅迫則 不能誘導(dǎo)Bi和化基因的表達(dá)（圖3)。因此SNP-1601對于栽培黃瓜響應(yīng)逆境脅迫是不可 或缺的關(guān)鍵因素之一。
[0016] 本發(fā)明可用于大規(guī)模篩選育種材料，大大加快黃瓜的育種進(jìn)程；也可W用于通過 基因工程改良技術(shù)提高黃瓜的品質(zhì)性狀。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中用qPCR和HPLC分別檢測不同黃瓜核也種質(zhì)材料果實(shí)中 Bt (A)、Bi基因做的表達(dá)情況及苦味物質(zhì)的含量似。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中223個(gè)巧遺傳群體進(jìn)一步確認(rèn)SNP-1601與果實(shí)苦味表 型共分離。
[0019] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中用qPCR和HPLC分別檢測HAN及其天然突變體han在正 常和低溫脅迫下，果實(shí)中化(A)、Bi基因炬）的表達(dá)情況及苦味物質(zhì)的含量（C)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a 1油oratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0021] 實(shí)施例1挖掘與黃瓜果實(shí)苦味性狀關(guān)聯(lián)的SNP
[0022] 從世界各地收集了 3000多份黃瓜資源，從其中挑選115份作為黃瓜核也種質(zhì)資 源，它們代表了 80%的遺傳多樣性。對每份資源進(jìn)行重測序，產(chǎn)生5G左右的數(shù)據(jù)量，平均覆 蓋10倍黃瓜基因組。同時(shí)還對該115份種質(zhì)資源進(jìn)行了果實(shí)苦味表型鑒定。通過比較不 同材料的化基因，發(fā)現(xiàn)了在其編碼黃瓜轉(zhuǎn)錄因子Csa5G157230基因炬t基因）起始密碼子 上游第16(Ubp處（SNP-1601)。此處堿基為G的黃瓜果實(shí)表型不穩(wěn)定，易受到外界環(huán)境的影 響，在逆境條件下，如低溫、干旱等，黃瓜果實(shí)易變苦，此處堿基為A的黃瓜則不苦（表1)。
[0023] 表1黃瓜核也種質(zhì)資源中SNP-1601與果實(shí)苦味性狀的關(guān)系

【權(quán)利要求】
1. 與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于編碼黃瓜轉(zhuǎn)錄因子 Csa5G157230基因起始密碼子上游第1601bp處，此處堿基為G的黃瓜果實(shí)表型不穩(wěn)定，易受 到外界環(huán)境的影響，在逆境條件下黃瓜果實(shí)易變苦，此處堿基為A的黃瓜則不苦； 其中，所述逆境條件包括但不限于低溫、干旱。
2. 用于檢測權(quán)利要求1所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對，其特征在 于，包括正向引物 F5' -TGGTAGGTGTAGCTTAATCAITCTCCTTTG-3' 和反向引物 R5' -AAGITGGTGA AGTAATAGTGTCCAACC-3'。
3. 權(quán)利要求1所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定苦味黃瓜品種中的應(yīng) 用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測黃瓜的基因組DNA ; 2) 以待測黃瓜的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)； 3) 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 其中，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以20iil計(jì)為：10-20ng/iil模板DNAliil， 10pmol/iil 引物F和 R各 liil，10mmol/L dNTP mix0.4iil，0.5U/iiL Taq DNA 聚合酶 0. 3 ill，10 X PCR反應(yīng)緩沖液2 ill，余量為水； PCR反應(yīng)條件為：94°C 5分鐘；94°C 20秒，58°C 20秒，72°C 30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C 10分 鐘。
5. 權(quán)利要求1所述與黃瓜果實(shí)苦味性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在黃瓜分子標(biāo)記輔助育種中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357441SQ201410529172
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】黃三文, 尚軼, 陳慧明, 馬永碩, 周倩, 張忠華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所