一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，特異性LAMP引物根據Msp5基因設計3對引物：外，內，環(huán)引物，正向外引物命名為Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內引物命名為Msp5-FIPb，反向內引物命名為Msp5-BIPb，為了加速反應設計環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物Msp5-LBb，三對的外引物用于PCR檢測。在63℃條件下進行LAMP反應20分鐘后，LAMP產物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳顯示呈階梯狀圖案。該方法具有高特異性，高靈敏度，時間短且操作簡便的特點。
【專利說明】一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的 試劑中的用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣 無漿體病原的試劑中的用途。

【背景技術】
[0002] 牛邊緣無漿體病是一種由邊緣無漿體經蜱傳播的專性寄生于紅細胞內的血液傳 染疾病,主要引起牛、羊等反芻動物發(fā)病，。其特征為高熱、貧血、消瘦、黃疸和膽囊腫大并 廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)引起奶牛和肉牛產業(yè)相當大的經濟損失（Katherine et al.，2010)。檢測牛邊緣無漿體的常見基因包括16S rRNA，熱休克蛋白（groEL基因） (Lew et al.，2003)，主要表面蛋白-Ia(Mspla) (Lew et al.，2002;Molad et al.，2004), Msp4(Molad et al·，2004)和 Msp5(Molad et al·，2004 ;Corona et al·，2009)。牛邊緣 無漿體主要表面蛋白Msp5是由633bp單拷貝基因編碼高度保守的19ku的蛋白，在免疫印 跡試驗中通過與單克隆抗體表面蛋白結合，Msp5 ANAF16C1證明在已知的無楽體屬的幾個 亞種中是高度保守的（Visser et al. ,1992 ;Ybafiezet al. ,2012)。因此，Msp5可以作 為一種有效的診斷抗原。傳統的檢測邊緣無漿體Msp5基因的方法是競爭性酶聯免疫吸 附法（CELISA) (Strik et al·，2007 ;Echaide et al·，1998)競爭抑制性酶聯免疫吸附法 (CI-ELISA) (NI et al.，2011)，間接熒光抗體試驗（IFAT) (0ΙΕ，2009)，套式PCR法（Echaide et al.，1998)，實時熒光定量 PCR(Picoloto et al.，2010)和半套式 PCR 測定法（Singh et al.，2012)。但是這些方法還有許多缺陷，例如，它們必須在實驗室進行并且反應需要 很長的時間。自2000年以來，Notomi開發(fā)出了環(huán)介導等溫擴增方法（LAMP)，在恒溫條件 (60°C _65°C )下，不到Ih的時間里進行核酸擴增，具有特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產物 易檢測等優(yōu)點。環(huán)介導等溫擴增技術已經廣泛應用于快速檢測動物病原（病毒、細菌、寄生 蟲）（Tomita et al.，2008)。然而，使用LAMP技術診斷牛邊緣無漿體病尚未見報道。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種環(huán)介導等溫擴增引物在 制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，根據牛邊緣無漿體保守基因 Msp5設計了引 物，評估LAMP技術的檢測方法。
[0004] 其具體技術方案為：
[0005] -種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，
[0006] 特異性LAMP引物根據Msp5基因設計3對引物：外，內，環(huán)引物，正向外引物命名 為Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內引物命名為Msp5-FIPb，反向內引物命名 為Msp5-BIPb，為了加速反應設計環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物 Msp5-LBb，三對的外引物用于PCR檢測；
[0007]

【權利要求】
1. 一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，其特征在 于， 特異性LAMP引物根據Msp5基因設計3對引物：外，內，環(huán)引物，正向外引物命名為 Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內引物命名為Msp5-FIPb，反向內引物命名 為Msp5-BIPb，為了加速反應設計環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物 Msp5-LBb，三對的外引物用于PCR檢測； Msp5-F3b ACCTTCTGCTGTTCGTTG Msp5-B3b GAGAAGCCATGCCTAACTC Msp5-FIPb GTTGAAAGACGCGGAGGCTAAATCGGCGA (Flc+F2) GAGGTTTAC Msp5-BIPb CCGTCAGTAGCGGCGATTTGTACTTACAGG (Blc+B2) CTGAGAAGC Msp5-LFb TGCCCTCACTTACAACTTCG Msp5-LBb CGGCAAGCACATGTTGGTA。
2. 根據權利要求1所述的環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑 中的用途，其特征在于，采用以下步驟完成： LAMP反應體系是25 μ L，包括0. 4 μ Μ外引物，1. 6 μ Μ內引物，0. 8 μ Μ環(huán)引物，1 μ LDNA 樣品，硫酸緩11111(11'01:>]\^11111111，11111]1甜菜喊，2.5 4 1^10\11161'1]1(^〇1131^€61'111的138七0嫩聚 合酶，加 ddH20共25 μ L ;混勻后，加入20 μ L油混勻并離心；在PCR管的中下部加入0. 5 μ L SYBR GREEN I染料然后輕輕蓋上，以防止SYBR GREEN I染料降入管底；將混合物在63°C下 恒溫反應20分鐘；反應后，在光亮視野下觀察到混合物與SYBR GREEN I染料在PCR管中的 顏色變化，并在紫外線照射下365nm處也可觀察到；之后LAMP產物3 μ L用0. 8 %瓊脂糖凝 膠電泳分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293936SQ201410509621
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權日:2014年9月18日
【發(fā)明者】倪宏波, 王欣, 王云光, 安先全, 蔣慧婷 申請人:黑龍江八一農墾大學