一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。所述人胃癌細(xì)胞系保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：2013154。該人胃癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，成瘤率高，潛伏期短，均一性好，為胃癌研究提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。該人胃癌細(xì)胞系具有成瘤性，而且產(chǎn)生的腫瘤具有順鉑耐藥性，可用來分析體外、體內(nèi)藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性，進(jìn)而建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的藥物篩選平臺(tái)，是人胃癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞系。CCTCC NO：C201315420131120
【專利說明】一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細(xì)胞系及其建立方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細(xì)胞 系及其建立方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病，其中，胃癌是全球發(fā)病率最高的 癌癥之一，也是世界上第2位癌癥死亡原因，僅次于肺癌。據(jù)2011年的Global Cancer Statistics報(bào)告，目前全球超過70%的胃癌新發(fā)病例和死亡都發(fā)生在發(fā)展中國家，其中東 亞高居榜首，發(fā)病率分別達(dá)到男性42. 4%和女性18. 3%。而根據(jù)中國抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤 協(xié)作中心（CSCO)列舉的數(shù)據(jù)，目前全球每年新發(fā)胃癌有九十三萬四千例，其中有近四十萬 在中國內(nèi)地，中國的胃癌發(fā)病已占全世界的42%。我國每年死于胃癌約30萬人，死亡率為 25. 2/10萬（男性：32. 8/10萬，女性：17. 0/10萬），占全部惡性腫瘤死亡的23. 2%。而在 上海，男性胃癌的發(fā)病率為47. 1/10萬?63. 2/10萬，女性為20. 1/10萬?24. 8/10萬，分 別占惡性腫瘤發(fā)病率的第1位和第2位。其中，胃腺癌的發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%。
[0003] 近年來，胃癌的治療模式已從單一的手術(shù)治療進(jìn)入綜合治療加規(guī)范化手術(shù)的新治 療模式，其中輔助化療作為綜合治療的方法之一，已得到越來越多的關(guān)注。目前胃癌臨床化 療主要存在如下問題：首先，常用的化療方案缺乏客觀指標(biāo)反應(yīng)藥物的抗癌敏感性；其次， 耐藥現(xiàn)象的發(fā)生仍然是胃癌化療中存在的最大問題。鑒于此，建立不同病理類型的胃癌細(xì) 胞系，尤其是具有耐藥特性的細(xì)胞系，對(duì)于有效指導(dǎo)臨床前研究和臨床不同分型的治療相 關(guān)性，具有必不可少的重要作用。同時(shí)由于運(yùn)用臨床腫瘤組織直接建立細(xì)胞系的成功率較 低，因此，通過運(yùn)用臨床腫瘤標(biāo)本先建立動(dòng)物模型，進(jìn)而通過原代培養(yǎng)建立人源腫瘤細(xì)胞更 具有可行性，同時(shí)也接近于腫瘤的臨床生物學(xué)特性，對(duì)藥物的耐藥性及敏感性具有良好的 預(yù)測(cè)性。
[0004] 胃癌細(xì)胞系在新藥開發(fā)臨床前應(yīng)用的一個(gè)重要方面就是建立小鼠異種移植瘤模 型，用于預(yù)測(cè)抗癌藥物的臨床療效。然而，目前建立的大多數(shù)胃癌細(xì)胞系受限于成瘤率低或 均一性差等問題，難以應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的人胃癌細(xì)胞系生物多樣性低，與臨床胃 癌的生物學(xué)性狀相差較大等不足，提供一種新的具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細(xì)胞系 及其建立方法和應(yīng)用。
[0006] 因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：一種人胃癌細(xì)胞系，其 保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :2013154。
[0007] 本發(fā)明所述人胃癌細(xì)胞系較佳地還包括如上所述的人胃癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：如上所述的人胃癌細(xì)胞系在 制備使免疫缺陷小鼠產(chǎn)生胃癌的試劑中的用途。
[0009] 本發(fā)明所述的使免疫缺陷小鼠產(chǎn)生胃癌的試劑為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑，該試劑的制 備方法較佳地為將本發(fā)明所述人胃癌細(xì)胞系混懸于各種溶劑中即得。其中所述溶劑為本 領(lǐng)域常規(guī)溶劑，較佳地為HBSS緩沖液，所述HBSS緩沖液的配方為：含500U/ml青霉素 G、 500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml兩性霉素 B。
[0010] 本發(fā)明所述試劑較佳地用于制備胃癌動(dòng)物模型。其中所述胃癌動(dòng)物模型的制備方 法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地包括以下步驟：將所述使免疫缺陷小鼠產(chǎn)生胃癌的試劑接種 于免疫缺陷小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，獲得胃癌動(dòng)物模型。其中所述免疫缺陷小鼠較佳地為裸小鼠或 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），優(yōu)選地為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），其中 所述裸小鼠較佳地為NU/NU品系的裸小鼠。利用本發(fā)明所述細(xì)胞系制備的胃癌動(dòng)物模型具 有5-氟尿嘧啶耐藥性。
[0011] 其中所述的接種的方式為本領(lǐng)域常規(guī)使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括 皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種，優(yōu)選地為皮下穿刺接種。所述接種的細(xì)胞量較 佳地為I. 0?2X IO7個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選地為5. OX IO6個(gè)細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述胃癌動(dòng)物模型的應(yīng)用方法較佳地為，利用所得胃癌動(dòng)物模型檢測(cè)待測(cè) 化合物的抑制胃癌活性，將待測(cè)化合物施用于胃癌動(dòng)物模型，觀察和測(cè)量動(dòng)物的體重與腫 瘤生長情況；施用后導(dǎo)致胃癌動(dòng)物模型胃癌癥狀改善或治愈的待測(cè)化合物具有抑制胃癌活 性。
[0013] 其中所述的待測(cè)化合物施用的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的施用方法，較佳地包括：尾靜 脈注射、腹腔注射、灌胃、口服和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用于胃癌的荷瘤動(dòng) 物。所述實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照例較佳地為：同時(shí)使用不含待測(cè)化合物的溶劑施用于胃癌的荷瘤動(dòng) 物作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
[0014] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是：一種待測(cè)化合物抑制胃癌細(xì) 胞活性的體外檢測(cè)方法，該體外檢測(cè)方法包括以下步驟：將待測(cè)化合物施用于細(xì)胞模型中， 施用后抑制細(xì)胞增殖或?qū)е录?xì)胞凋亡的待測(cè)化合物為具有抑制胃癌細(xì)胞活性的化合物，其 中所述的細(xì)胞模型是如上所述的人胃癌細(xì)胞系。
[0015] 本發(fā)明所述體外檢測(cè)方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法，該體外檢測(cè)方法較佳地包括 以下步驟：
[0016] (1)將本發(fā)明所述人胃癌細(xì)胞系或其子代細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，培養(yǎng) 24小時(shí)；
[0017] (2)將待測(cè)化合物稀釋成不同濃度施用于細(xì)胞，化合物作用72小時(shí)后通過測(cè)定細(xì) 胞的活力，計(jì)算不同濃度的化合物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制能力，計(jì)算化合物半數(shù)抑制濃度，用以 判斷待測(cè)化合物的抗胃癌細(xì)胞的能力。
[0018] 其中步驟（1)所述人胃癌細(xì)胞系或其子代細(xì)胞的接種量較佳地為5000/孔。其中 步驟（2)所述半數(shù)抑制濃度檢測(cè)方法較佳地包括ATP生物發(fā)光法或MTT法，本發(fā)明所述檢 測(cè)方法優(yōu)選地為ATP生物發(fā)光法。所述的ATP生物發(fā)光法是通過對(duì)細(xì)胞中的ATP進(jìn)行定量 測(cè)定來檢測(cè)培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目的一種均質(zhì)檢測(cè)方法，其中所述的ATP是活細(xì)胞新陳代謝 的一個(gè)重要指標(biāo)，所述ATP生物發(fā)光法可以利用市售檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。
[0019] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之四是：一種如上所述人胃癌細(xì)胞系 的建立方法，該建立方法包括以下步驟：
[0020] (1)獲得新鮮的臨床人胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小 鼠；
[0021] (2)穿刺接種70?90天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培 養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
[0022] 其中步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌手術(shù)切除標(biāo)本剪切而成的小塊的質(zhì)量較 佳地為20?50mg。其中所述的免疫缺陷小鼠較佳地為嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠） 或裸小鼠。其中所述的新鮮的臨床人胃癌切除標(biāo)本更佳的處理方式為：用新鮮的HBSS緩沖 液（所述HBSS緩沖液較佳地包含500U/ml青霉素 G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml 兩性霉素 B)漂洗。
[0023] 其中步驟（2)所述的原代培養(yǎng)方法是常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法；所述 的原代培養(yǎng)方法較佳地包括以下步驟：
[0024] 將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C孵箱5% CO2條件下培養(yǎng)；次日，將 培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)加入RPMI-1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清，lOOU/ml青霉素 G、 100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素 B)，靜置培養(yǎng)。
[0025] 其中所述的傳代培養(yǎng)方法是常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法；所述的傳代培養(yǎng) 方法較佳地包括以下步驟：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞鋪展到70%滿時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)和純化，吸棄 舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，終止消化，加入新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；離心接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
[0026] 所述傳代培養(yǎng)方法中較佳地還包括細(xì)胞純化的步驟，所述細(xì)胞純化的方法較佳地 包括以下步驟：利用腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁速率的不同，在傳代接種于新的培養(yǎng)瓶20 分鐘后吸取上清轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶，多次差速貼壁去除成纖維細(xì)胞。
[0027] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0028] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0029] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0030] 1、本發(fā)明建立的人胃癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，為胃癌研究提供新的 更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料；
[0031] 2、本發(fā)明建立的人胃癌細(xì)胞系在保留主要臨床生物學(xué)特征的前提下，具有成瘤率 高，潛伏期短，均一性好等特點(diǎn)，可以成功制備胃癌動(dòng)物模型，所制得的動(dòng)物模型可以用于 基礎(chǔ)研究及藥物篩選，為基于中國人群遺傳背景開展的研究提供了有力的科研資料，也為 新藥臨床前研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)針對(duì)臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的測(cè)試提供新的試驗(yàn)材料。
[0032] 3、本發(fā)明建立的人胃癌細(xì)胞系通過與裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤相比較，可用來分 析體外、體內(nèi)藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性，進(jìn)而可以建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的藥物篩 選平臺(tái)，是人胃癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞系。
[0033] 4、本發(fā)明建立的人胃癌細(xì)胞系所成的裸鼠腫瘤還具有對(duì)胃癌臨床一線藥物5-氟 尿嘧啶的耐藥性，是研究胃癌耐藥機(jī)制的良好試驗(yàn)材料，具有很高的科研價(jià)值和開發(fā)意義。
[0034] 5、本發(fā)明建立的細(xì)胞系具高成瘤率，高均一性，又保持有臨床胃癌分子背景，同時(shí) 來源于中國人群，符合中國人的遺傳特征，對(duì)研發(fā)適合國人的抗胃癌新藥具有十分重要的 理論和臨床意義。
[0035] 牛物材料保藏信息
[0036] 本發(fā)明的人胃癌細(xì)胞系，于2013年11月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中 心（CCTCC)，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學(xué)郵編：430072,培養(yǎng)物名稱為人胃癌細(xì)胞 GAXC066,保藏編號(hào)為 CCTCC NO :C2013154。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為GAXC066細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（放大一百倍視野）。
[0038] 圖2為GAXC066細(xì)胞的染色體分析。其中圖2 (A)為GAXC066細(xì)胞；圖2 (B)為小 鼠細(xì)胞染色體。
[0039] 圖3為GAXC066細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果（DAB法）。其中圖3 (A)為陰性對(duì)照； 圖3(B)為癌胚抗原（CEA);圖3(C)為細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin);圖3(D)為波形蛋 白（Vimentin);圖3(E)為糖類抗原19-9(CA19-9);圖3(F)為人類表皮生長因子受體 2(HER-2)。
[0040] 圖4為GAXC066細(xì)胞倍增時(shí)間曲線。
[0041] 圖5為GAXC066細(xì)胞周期分析結(jié)果。
[0042] 圖6為體外測(cè)試多個(gè)抗癌藥物對(duì)GAXC066細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果。其中圖6 (A) 為順鉬對(duì)GAXC066的生長抑制作用；圖6(B)為伊立替康對(duì)GAXC066的生長抑制作用；圖 6(C)為5-氟尿嘧啶對(duì)GAXC066的生長抑制作用；圖6(D)為紫杉醇對(duì)GAXC066的生長抑制 作用 ；圖6出）為表柔比星對(duì)6八乂0)66的生長抑制作用；圖6$)為多西紫杉醇對(duì)64乂0)66的 生長抑制作用。
[0043] 圖7為GAXC066細(xì)胞的成瘤性結(jié)果。
[0044] 圖8為GAX⑶66細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)成瘤的病理組織切片（放大10倍視野）。其中 圖8(A)為正常肺組織；圖8(B)為對(duì)應(yīng)標(biāo)本移植瘤塊；圖8(C)為GAXC066細(xì)胞接種瘤塊。
[0045] 圖9為體內(nèi)測(cè)試順鉬和5-氟尿嘧啶對(duì)GAXC066細(xì)胞裸小鼠模型的腫瘤生長抑制 作用結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0047] 順鉬購自江蘇豪森藥業(yè)，5-氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸有限公司，生理鹽水購 自浙江天瑞藥業(yè)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購買自美國Invitrogen公司。
[0048] 實(shí)施例1GAXC066細(xì)胞的制備
[0049] 從南通腫瘤醫(yī)院獲得新鮮的臨床胃癌切除標(biāo)本（患者性別：男，年齡：72歲，民族： 漢，籍貫：江蘇省南通市。），臨床診斷結(jié)果為低分化胃腺癌。
[0050] 用新鮮的HBSS緩沖液（含500U/ml青霉素 G、500 μ g/ml硫酸鏈霉素和1. 25 μ g/ml 兩性霉素 B)漂洗后，切成20?50mg的小塊，皮下穿刺接種于免疫缺陷動(dòng)物SCID鼠 （SCID 鼠購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。穿刺接種70?90天后，將荷瘤動(dòng)物處 死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
[0051] 原代培養(yǎng)步驟為：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C孵箱5% CO2條 件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)加入RPMI-1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清， 100U/ml青霉素 G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素 B)，靜置培養(yǎng)；待細(xì)胞鋪 展到70%滿時(shí)先進(jìn)行傳代，再純化，之后放入37%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代的方法是吸棄 舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，終止消化，加入新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；離心接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
[0052] 純化的方法是將所得細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶，20分鐘后，吸取上清轉(zhuǎn)移到新 的培養(yǎng)瓶，由于成纖維貼壁速率較快，在新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20分鐘后，細(xì)胞懸液中的成纖 維細(xì)胞大部分貼壁生長，所以細(xì)胞懸液中的腫瘤細(xì)胞得到了純化，將上述步驟重復(fù)多次，即 達(dá)到了純化腫瘤細(xì)胞的目的。
[0053] 本發(fā)明將來源于腫瘤組織的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)細(xì)胞系命名為人胃癌細(xì)胞 GAXC066,于2013年11月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :C2013154。提交保藏的細(xì)胞系是傳代30代后的細(xì)胞系。
[0054] 實(shí)施例2GAXC066細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用
[0055] 本發(fā)明采用RPMI1640培養(yǎng)并用差速貼壁法純化GAXC066細(xì)胞，使其能體外長期 生長和穩(wěn)定傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至20代以上，細(xì)胞性狀逐漸穩(wěn)定，進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)、遺傳學(xué) 和組織來源鑒定，直至第50代都具有相同的穩(wěn)定的性狀。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察與驗(yàn)證，體外生長的 GAXC066主體細(xì)胞呈大柳葉形，無接觸抑制特性。遺傳學(xué)研究證實(shí)該細(xì)胞為異倍體，染色體 數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。該細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)可形成腫瘤，具 有致瘤性。該細(xì)胞和其來源的臨床腫瘤標(biāo)本、裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤形成對(duì)應(yīng)關(guān)系，可為 研究體外、體內(nèi)和臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性提供新的試驗(yàn)材料。具體如下：
[0056] a.形態(tài)學(xué)觀察
[0057] 將培養(yǎng)GAXC066細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在明視野下進(jìn)行觀察，結(jié)果見 圖1(圖1為GAXC066細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察100X所示），可見GAXC066主體細(xì)胞呈大柳葉形， 無接觸抑制特性。
[0058] b.染色體的鑒定
[0059] 在培養(yǎng)的GAXC066細(xì)胞中加入秋水仙素，使其終濃度為0. 25 μ g/ml，再于37°C孵 箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。采集分裂中期的細(xì)胞，用固定液進(jìn)行固定，然后將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷 的載物片上，用Giemsa染色液染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)。結(jié)果見圖2,其中圖2 (A)為 GAXC066細(xì)胞；圖2(B)為小鼠細(xì)胞染色體。結(jié)果可見，GAXC066細(xì)胞連續(xù)傳代后，染色體仍 保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，染色體眾數(shù)為51±2,占80. 89%，表現(xiàn)為超二倍體，存 在多數(shù)中央及亞中央著絲粒染色體（圖2(A)，1000X);而裸小鼠的染色體數(shù)2n = 40,且均 為頂端著絲粒（圖2(B)，1000X)，據(jù)此可與人類染色體相區(qū)別?？梢娫摷?xì)胞為異倍體（超 二倍體），染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。
[0060] C.短片段重復(fù)序列（STR)鑒定
[0061] 短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat, STR)又稱為微衛(wèi)星DNA，是指染色體上， 由數(shù)個(gè)堿基對(duì)作為核心單位（2-6個(gè)堿基對(duì)），串聯(lián)重復(fù)形成的一類DNA序列（重復(fù)次數(shù)為 10?60多次，基因片段在400堿基對(duì)以下）；每個(gè)核心單位重復(fù)的次數(shù)會(huì)出現(xiàn)個(gè)體差異，從 而形成片段長度不同的等位基因。因此，一組STR序列的重復(fù)次數(shù)在不同個(gè)體中幾乎是唯 一的，是個(gè)體的基因身份特征，也是細(xì)胞生物學(xué)對(duì)細(xì)胞身份和來源進(jìn)行鑒定的主要方法。
[0062] 收集新鮮培養(yǎng)的GAXC066細(xì)胞，用AxyPr印基因組DNA小量試劑盒（購自Axygen 公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，貨號(hào)為 AP-MN-MS-GDNA)提取 細(xì)胞基因組DNA，用5'端熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算各個(gè)短 片段重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)。
[0063] 提取細(xì)胞的基因組DNA，對(duì)STR位點(diǎn)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過測(cè)序分析包括 Amelogenin，TH01，TPOX，D13S317, vWA，D16S539, D5S818, CSFlPO 以及 D7S820 等各個(gè) STR 位點(diǎn)的序列重復(fù)數(shù)，并和ATCC，DSMZ等細(xì)胞保存庫的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢對(duì)比，未返回相同的 遺傳圖譜，可證明其獨(dú)一無二性，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染，STR 位點(diǎn)的引物序列如序列表中SEQ ID NO: I-SEQ ID NO. 18所示，具體請(qǐng)參見表1和表2 :
[0064] 表I STR位點(diǎn)的引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種人胃癌細(xì)胞系，其特征在于，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :2013154。
2. 如權(quán)利要求1所述人胃癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。
3. 如權(quán)利要求1所述的人胃癌細(xì)胞系在制備使免疫缺陷小鼠產(chǎn)生胃癌的試劑中的用 途。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的使免疫缺陷小鼠為SCID小鼠或裸小 鼠。
5. -種待測(cè)化合物抑制胃癌細(xì)胞活性的體外檢測(cè)方法，其特征在于，該體外檢測(cè)方法 包括以下步驟：將待測(cè)化合物施用于細(xì)胞模型中，施用后抑制細(xì)胞增殖或?qū)е录?xì)胞凋亡的 待測(cè)化合物為具有抑制胃癌活性的化合物，其中所述的細(xì)胞模型是權(quán)利要求1所述的人胃 癌細(xì)胞系。
6. -種如權(quán)利要求1所述人胃癌細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，該建立方法包括以 下步驟： (1) 獲得新鮮的臨床人胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小鼠； (2) 穿刺接種70?90天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和 傳代培養(yǎng)。
7. 如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，步驟（1)所述的小塊的質(zhì)量為20? 50mg〇
8. 如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，步驟（1)所述的免疫缺陷小鼠為SCID 小鼠或裸小鼠。
9. 如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌切除 標(biāo)本用HBSS緩沖液漂洗后，再進(jìn)行皮下穿刺接種，所述的HBSS緩沖液包含500U/ml的青霉 素G，500 ii g/ml的硫酸鏈霉素和1. 25 ii g/ml的兩性霉素B。
10. 如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，步驟（2)所述的細(xì)胞的原代培養(yǎng)包括 以下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，于37°C孵箱5% C02條件下培養(yǎng)；次日 向瓶?jī)?nèi)加入RPMI-1640培養(yǎng)液，所述RPMI-1640培養(yǎng)液含5%胎牛血清，100U/ml青霉素G， 100 y g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 y g/ml兩性霉素B，靜置培養(yǎng)；步驟（2)所述的細(xì)胞的傳代培 養(yǎng)包括以下步驟：吸棄舊培養(yǎng)液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后， 加入新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)液，仔細(xì)吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；收集全部細(xì)胞，離 心，分別接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，所述百分比為質(zhì)量百分比。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104403996SQ201410499357
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】強(qiáng)福林, 胡剛, 湯旭蓁, 張一心, 方后順, 汪宗宇, 秦宵然 申請(qǐng)人:上海睿智化學(xué)研究有限公司, 南通市腫瘤醫(yī)院