臨床治療級(jí)細(xì)胞治療用成纖維細(xì)胞規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了皮膚臨床治療級(jí)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選、擴(kuò)增技術(shù)，這些瓶頸一直是生物學(xué)細(xì)胞領(lǐng)域研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，目前利用基底膜顯著黏附特性進(jìn)行分離純化，采用三維培養(yǎng)擴(kuò)增手段獲得。該發(fā)明適合依賴擴(kuò)增貼壁型細(xì)胞并提供三維高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞水平的篩選與分離。高模擬體內(nèi)貼附環(huán)境，體外培養(yǎng)成體(胚胎皮膚)細(xì)胞的生物細(xì)胞新培養(yǎng)技術(shù)。高模擬底物所在環(huán)境黏附篩選培養(yǎng)目標(biāo)成纖維細(xì)胞，具有高傳代能力，高增殖能力，并可在體外環(huán)境下形成皮層結(jié)構(gòu)。篩出免疫原性細(xì)胞安全獲得免疫逃逸，延長(zhǎng)移植時(shí)間增加組織工程臨床應(yīng)用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合與皮膚疾病提供了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)臨床治療級(jí)細(xì)胞的解決方案。
【專利說(shuō)明】臨床治療級(jí)細(xì)胞治療用成纖維細(xì)胞規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外 基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法 一、【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。涉及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi)貼附環(huán) 境分離篩選，皮膚細(xì)胞成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)。獲得臨床治療級(jí)成纖維細(xì)胞應(yīng)用于組 織工程皮膚構(gòu)建技術(shù)中的活性種子細(xì)胞。
[0002] 二、【背景技術(shù)】介紹：
[0003] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調(diào)節(jié) 體溫維持個(gè)體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統(tǒng)組成的重要的一部 分，而皮膚細(xì)胞是構(gòu)成這器官的基本單元，皮膚細(xì)胞基礎(chǔ)研究領(lǐng)域是揭示皮膚健康、發(fā)育、 預(yù)防、治療的重要科研途徑。
[0004] 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分， 是細(xì)胞新陳代謝、生長(zhǎng)、繁殖、分化、表達(dá)、傳遞、互惠所依賴的極其重要場(chǎng)所。早期研究學(xué)者 認(rèn)為.外基質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象。并在兩年之后，得以證 明學(xué)者們才對(duì)這種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識(shí)和思考。
[0005] Hay在11年后報(bào)道了 ECM對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行 為的現(xiàn)象得以關(guān)注并進(jìn)行廣泛的研究，但是并沒(méi)有成型的理論基礎(chǔ)佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動(dòng)態(tài)互惠"的模 型。在這個(gè)模中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞 漿中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達(dá)。
[0006] 并證明這些基因的表達(dá)產(chǎn)物又可以反過(guò)來(lái)對(duì)ECM發(fā)生作用，今天的許多研究證實(shí) 了這個(gè)模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用直接參與了細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過(guò)程；外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的活性；還能夠直接 激活、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。由于這種對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)作用。因此，我們 必須充分了解細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)的、物理的、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的形成和修復(fù) 中的作用，才能更好地應(yīng)用這些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深入開展對(duì)ECM 的認(rèn)也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，這種研究模式促進(jìn)學(xué)科前行及發(fā)展。
[0007] 皮膚干細(xì)胞在正常皮膚組織中含量極少，干細(xì)胞公認(rèn)是一種在體內(nèi)具有無(wú)限更新 能力，且可分化形成相應(yīng)全層組織分化細(xì)胞，體外培養(yǎng)具有長(zhǎng)期生長(zhǎng)潛能并可形成無(wú)限克 隆。是愈合修復(fù)創(chuàng)面，皮膚更新代謝再生的重要參與者。但由于目前缺乏理想篩選方法，對(duì) 干細(xì)胞進(jìn)行篩選及鑒定方法報(bào)道較少。
[0008] 三、皮膚細(xì)胞名稱概述
[0009] 成纖維細(xì)胞（fibroblast)也稱為纖維母細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分， 由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal cell)分化而來(lái)。成纖維細(xì)胞較大，輪廓清楚，多 為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。根據(jù)不同 功能活動(dòng)狀態(tài)，可將細(xì)胞劃分成成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì) 嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，在一定條件下，它可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相 轉(zhuǎn)化。成纖維細(xì)胞對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重 要的作用。
[0010] 四、成纖維細(xì)胞概述
[0011] 成纖維細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核 仁明顯。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體，表明 它具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能。成纖維細(xì)胞尚可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖 維及有機(jī)基質(zhì)。它合成的前膠原蛋白分子經(jīng)內(nèi)切酶作用，聚合和重排，可形成與成骨細(xì)胞合 成分泌的膠原原纖維一樣具有64nm周期橫紋的膠原原纖維，膠原原纖維經(jīng)互相粘合形成 膠原纖維。經(jīng)檢測(cè)，這兩種細(xì)胞合成分泌的膠原纖維均是I型膠原纖維，在形態(tài)和生化結(jié)構(gòu) 上完全相同。處于成熟期或稱靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞，胞體變小，呈長(zhǎng)梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和 高爾基復(fù)合體均不發(fā)達(dá)，被稱為纖維細(xì)胞。在外傷等因素刺激下，部分纖維細(xì)胞可重新轉(zhuǎn)變 為幼稚的成纖維細(xì)胞，其功能活動(dòng)也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù)。另外，在結(jié)締組織 中，仍保留著少量具有分化潛能的間充質(zhì)細(xì)胞，它們?cè)趧?chuàng)傷修復(fù)等情況下可增殖分化為成 纖維細(xì)胞。
[0012] 五、成纖維細(xì)胞應(yīng)用的特點(diǎn)
[0013] 一般創(chuàng)傷修復(fù)
[0014] 各種創(chuàng)傷均會(huì)造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損，必須通過(guò)細(xì)胞增生和 細(xì)胞間基質(zhì)的形成來(lái)進(jìn)行組織修復(fù)。在此修復(fù)過(guò)程中，成纖維細(xì)胞起著十分重要的作用。以 傷口愈合過(guò)程為例，成纖維細(xì)胞通過(guò)有絲分裂大量增殖，并從4?5天或6天開始合成和分 泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)傷口組織缺損， 為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。在傷口愈合中，成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于真皮乳頭層的局部成 纖維細(xì)胞和未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，以及血管周圍的成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞。內(nèi)臟損傷時(shí)，參與 修復(fù)過(guò)程的成纖維細(xì)胞多來(lái)自間質(zhì)和包膜，以及粘膜下或漿膜下層的結(jié)締組織。有人認(rèn)為 創(chuàng)傷愈合過(guò)程中傷處聚集的大量成纖維細(xì)胞，一方面是由成纖維細(xì)胞通過(guò)分裂增殖而來(lái)， 另一方面，更多地是由鄰近的間充質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等演變或游走到傷 處。在創(chuàng)傷修復(fù)的后期，成纖維細(xì)胞通過(guò)分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。在某些病理 條件下，以成纖維細(xì)胞為主要細(xì)胞成分的肉芽組織或增生組織塊還可以在非骨組織內(nèi)發(fā)生 隹丐化，引起異位骨化（ectopic ossification)。但對(duì)于異位骨化的參與細(xì)胞及其機(jī)制尚不十 分清楚，未分化間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管周細(xì)胞等可劃歸為誘導(dǎo)性骨 祖細(xì)胞的細(xì)胞都有可能參與這一過(guò)程骨創(chuàng)傷修復(fù)
[0015] 最簡(jiǎn)單和常見的骨創(chuàng)傷即是骨折，其愈合過(guò)程須經(jīng)過(guò)炎性反應(yīng)、清掃、纖維骨痂和 骨性骨痂4個(gè)階段。不同階段參與的細(xì)胞主體不同。成纖維細(xì)胞從骨折第3天起就出現(xiàn)于 骨折局部血腫中，骨折后5天即在機(jī)化血腫及骨折斷端的間隙及其周圍大量存在，是參與 纖維骨痂階段的主要細(xì)胞成分。在此階段成纖維細(xì)胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成 和分泌大量I型膠原，使肉芽組織逐步變成疏松的結(jié)締組織，將骨斷端包圍起來(lái)，形成接合 兩骨折斷端的巨大的纖維骨痂。然而，這種由無(wú)數(shù)成纖維細(xì)胞和豐富的肉芽組織為主體構(gòu) 成的纖維結(jié)締組織卻不會(huì)演變?yōu)樵谄渌M織創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)常見的瘢痕組織，而是通過(guò)鈣鹽結(jié) 晶在其內(nèi)部不斷沉積，逐漸演變?yōu)楣切怨丘瑁构钦劬植康男迯?fù)達(dá)到骨性愈合，恢復(fù)骨組織 的結(jié)構(gòu)。此時(shí)，骨折愈合部只有骨組織而不再存在成纖維細(xì)胞。
[0016] 六、成纖維細(xì)胞的分離及鑒別
[0017] 顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞呈梭形，呈放射狀，漩渦狀生長(zhǎng)，抗結(jié)蛋白單克隆抗體和 肌動(dòng)蛋白單克隆抗體免疫組化染色呈陰性，抗波形蛋白單克隆抗體呈陽(yáng)性。
[0018] 七、傳統(tǒng)篩分方法介紹
[0019] 因?yàn)槠つw細(xì)胞對(duì)基底膜有較強(qiáng)的粘附性，對(duì)細(xì)胞胞外基質(zhì)的粘附速度要比其它類 型細(xì)胞快得多，所以利用該種特性進(jìn)行培養(yǎng)篩選。目前傳統(tǒng)的皮膚干細(xì)胞篩選如下闡述：
[0020] 方法一（3T3滋養(yǎng)層法）：人類皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)研究已有一個(gè)世紀(jì)的歷史背景， 建立體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系于1975年由學(xué)者Rheinwald和Green所設(shè)計(jì)3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細(xì)胞株3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞，并用γ射線致死劑量照射，防止細(xì)胞受到異種物種的影響。 滅活3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞作為培養(yǎng)表皮細(xì)胞的滋養(yǎng)層能促進(jìn)表皮干細(xì)胞篩選的貼附和生長(zhǎng)，并 具有未被論證的接觸性抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。實(shí)驗(yàn)室所選用的、功能較穩(wěn)定的各亞 系但還不能完全排除對(duì)它的顧慮，還需繼續(xù)觀察和探索有效的替代方法。Green研究這種方 法的3T3雖然它是一個(gè)異種的具有問(wèn)變性質(zhì)的細(xì)胞，有不少實(shí)驗(yàn)室曾試圖用其他措施予以 取代，但至今為止，它的效果在各種方法中仍是最有效的，繼續(xù)被廣泛應(yīng)用。從第1例臨床 應(yīng)用至令已近30年，尚未發(fā)現(xiàn)因它而造成的不良后果。
[0021] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）=Graziella P學(xué)者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質(zhì)分離皮膚細(xì)胞；
[0022] 方法三（IV型膠原黏附法）Jone PH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經(jīng)消 化，利用IV型膠原做底物基質(zhì)分離皮膚細(xì)胞，所選用底物為異種膠原，存在不同種屬的污 染可能性，并且底物昂貴，不適合產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；蜷L(zhǎng)期培養(yǎng)，適合試驗(yàn)性小劑量研究；
[0023] 方法四（流式細(xì)胞儀篩選法）：學(xué)者Van Rossum麗j與Kaur P等從人小塊活檢 組織中得到角朊細(xì)胞，利用整合素標(biāo)記異性標(biāo)志物利用流式細(xì)胞儀分離皮膚細(xì)胞，選用方 法復(fù)雜且技術(shù)要求高，大體應(yīng)用integrinii 1，細(xì)胞黏附分子⑶49,增列細(xì)胞核抗原（PCNA) 等多種標(biāo)記進(jìn)行特征分離，雖然細(xì)胞得以篩選，但是會(huì)留有標(biāo)記物標(biāo)記滯留細(xì)胞無(wú)法有效 去除，存在是否影響細(xì)胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標(biāo)記鑒定測(cè)定細(xì)胞，并不適合臨 床應(yīng)用的細(xì)胞富集方法；
[0024] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學(xué)者Hagar B利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細(xì) 胞條件培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，不用滋養(yǎng)層細(xì)胞。但有研究報(bào)導(dǎo)表皮干細(xì)胞與基底膜脫離可誘 發(fā)進(jìn)入分化周期，分化為過(guò)渡性擴(kuò)充細(xì)胞，據(jù)猜想表皮干細(xì)胞與基底膜的高粘附性有可能 是維持表皮干細(xì)胞控制分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養(yǎng)層，有可能長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò) 程中干細(xì)胞分化引起后續(xù)研究的不可控發(fā)展；
[0025] 方法六（同體成纖維貼附篩選法）：學(xué)者金巖等利用參考改進(jìn)學(xué)者Hagar B和 Dunnwald鼠成纖維細(xì)胞，改成供體預(yù)先體外擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞為附著底物作為滋養(yǎng)層，培 養(yǎng)同體皮膚細(xì)胞，但是專利并沒(méi)有明確如何制備滋養(yǎng)層平皿的詳細(xì)步驟，鋪皿周期短，成纖 維貼壁力低，篩選反復(fù)PBS清洗純化過(guò)程會(huì)損失部分培養(yǎng)的目標(biāo)貼附成功的成纖維細(xì)胞， 從而降低目標(biāo)干細(xì)胞的得率，干細(xì)胞理論上具有同體同原性，另一技術(shù)問(wèn)題在于，兩種細(xì)胞 在共有同一培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)考慮培養(yǎng)液的復(fù)雜性，兩種細(xì)胞可能出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)增殖抑制等 現(xiàn)象，后續(xù)分離皮膚細(xì)胞存在技術(shù)難度，并不能優(yōu)于現(xiàn)有的六中常見方法，建議其可把此方 法改成復(fù)方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增加目標(biāo)細(xì)胞得率，或 滅活成纖維鋪皿層細(xì)胞。
[0026] 方法七（甲基纖維素培養(yǎng)皿貼附篩選法）：
[0027] 國(guó)外學(xué)者利用添加甲基纖維素 B27的DMEN/F12進(jìn)行培養(yǎng)。
[0028] 綜上所述，皮膚細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附強(qiáng)快速特性，體外篩選培養(yǎng)的人成纖維 細(xì)胞得以在國(guó)內(nèi)外方法特異性快速發(fā)展。而成纖維細(xì)胞生物學(xué)性能，可以做到增進(jìn)功能、避 免潛在有害基因及對(duì)成纖維細(xì)胞控制分化時(shí)間與控制不同分化方向等，在基礎(chǔ)科研、臨床 治療、皮膚細(xì)胞研究方向、皮膚再生損傷修復(fù)、高擬組織工程皮膚的構(gòu)建方面等均有歷史時(shí) 期的重要不可取代的指導(dǎo)意義。
[0029] 八、組織工程皮膚背景介紹
[0030] 再生組織工程細(xì)胞建立系工作始于本世紀(jì)（Harrison 1907, Carrel 1912)，指導(dǎo) 引領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，成為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻(xiàn)者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進(jìn)行孵化培養(yǎng)、使得組織細(xì)胞健康生長(zhǎng)。
[0031] 組織工程皮膚建立早期應(yīng)用于修復(fù)燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領(lǐng)域，麻省總醫(yī) 院的John F. Burke與MIT的Yannas I.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)，隸屬于組織工程皮膚支架材料學(xué)范疇。隨著細(xì)胞生物 學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展，人們開始整合兩大學(xué)科，共同協(xié)作解決創(chuàng)傷皮膚修復(fù)構(gòu)建，真正的含活 性細(xì)胞組織工程皮膚在哈福大學(xué)Honward Green與MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學(xué)醫(yī)學(xué)介矚目關(guān)注。
[0032] 20世紀(jì)80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網(wǎng)格組成的復(fù)合皮膚移植材 料被創(chuàng)造出來(lái)，內(nèi)層為牛膠原和硫酸軟骨素構(gòu)成，外層為硅膠樹脂，創(chuàng)面移植后內(nèi)層與創(chuàng)面 接觸被緩慢降解，數(shù)周后硅樹脂層移除，清創(chuàng)后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0033] MIT的科學(xué)家Bellhe把材料學(xué)和生物學(xué)完美結(jié)合創(chuàng)造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科學(xué)界商人的典范。這家活性組 織工程皮膚先驅(qū)引領(lǐng)公司仍然是在人工皮膚市場(chǎng)占有率最高的組織工程公司之一。
[0034] 1997年通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的第一個(gè)組織工程產(chǎn)品由Advanced Bionhealing 公司生產(chǎn)的TransCyte。用于燒傷創(chuàng)面修復(fù)治療。該產(chǎn)品屬于膠原支架材料種植滅活性 的纖維細(xì)胞，成為商業(yè)化的第一個(gè)"異體無(wú)活性細(xì)胞組織工程真皮療法"。Dermagraft和 Integra以及Organogenesis Inc制造的Apligraf也獲得FDA批準(zhǔn)，利用新生兒包皮經(jīng)生 物學(xué)體外培養(yǎng)活性細(xì)胞，制備的組織工程皮膚，用于潰瘍皮膚和大面積燒傷再生治療。該產(chǎn) 品是嚴(yán)格意義上具有類皮膚組織工程人工皮膚，含活性4?8傳代的細(xì)胞并具有完整表皮 真皮細(xì)胞構(gòu)建在組織工程支架之上可降解全層人工皮膚。并且部分剔除減少朗格漢斯細(xì) 胞，降低了受體的免疫排斥反應(yīng)，無(wú)活性的死亡細(xì)胞經(jīng)過(guò)創(chuàng)面組織液及相關(guān)體液因子代謝 的作用被分解可用于創(chuàng)面修復(fù)的小分子片段基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)愈合物質(zhì)被創(chuàng)面吸收利用。這種產(chǎn)品 制成后置于_70°C保存，37°C迅速?gòu)?fù)蘇，復(fù)蘇后有50 %的活性細(xì)胞具有活性，活性維持5天 通過(guò)快遞郵寄到指定的醫(yī)療部門。
[0035] 這些產(chǎn)品的市場(chǎng)準(zhǔn)入引領(lǐng)了嶄新的再生醫(yī)學(xué)組織工程皮膚時(shí)代開創(chuàng)。
[0036] 基于國(guó)內(nèi)國(guó)際組織工程人工皮膚現(xiàn)狀，建立組織工程皮膚干細(xì)胞-高擬體內(nèi)細(xì)胞 外基質(zhì)，基質(zhì)附著體外篩選方法設(shè)計(jì)首例含有表皮干細(xì)胞成纖維細(xì)胞的全層組織工程人工 皮膚產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0037] 1. -種用于篩選和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基組合，
[0038] 配制培養(yǎng)液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 B4 0· 5?I X 1CT4/L、維生素 Cl?3 μ g/ml、胰島素2?4 μ g/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、 EGF5 ?25ng/ml、氫化可的松 0· 4 μ g/ml、DMEM/F12 (3 : 1)定容到 500ml。
[0039] 配制培養(yǎng)液B :配制培養(yǎng)液B :滅活胎牛血清80ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷 10 ?25mg/ml、維生素 M 0· 5 ?IX 1(T4/L、霍亂霉素 2. 5 ?3. 5u/L、青霉素 50-100u/ml、 膜島素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1 ?3mg/ L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF)5?15ng/ml、氫化可的松0.3yg/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7. 4。
[0040] 配制培養(yǎng)液C :滅活胎牛血清60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ ml、維生素 MO. 5?I X 10_4/L、胰島素4?6 μ g/ml、bFGFlO?20ng/ml、牛腦垂體提取物 (BPE)2?3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF)IO?30ng/ml、霍亂霉素2. 5?3. 5u/L、鏈霉素 50 ?100μ g/ml、氫化可的松 0· 3μ g/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7. 4。
[0041] 2. -種制備高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處 理；b)脫細(xì)胞處理；優(yōu)選地，還進(jìn)一步包括將消毒或經(jīng)脫細(xì)胞處理的皮膚進(jìn)一步進(jìn)行低溫、 脫水、輻照滅菌處理；更優(yōu)選地步驟b)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶-非離子表面活 性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液法。
[0042] 3.權(quán)利要求2所述方法，其中冷酶交聯(lián)劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷 消12?48h。用含0.25%戊二醛磷酸緩沖溶液，pH在7. 20?7. 40之間，交聯(lián)4?6h，超 純水或注射用水沖洗8?10次。
[0043] 4.權(quán)利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法是：0. 1? 0· 25%中性蛋白酶與0· 01?0· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用 24 ?48h。
[0044] 5.權(quán)利要求2所述方法，其中絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0.01? 0·02%EDTA含0·6?0·8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0·2?0·5%SDS 溶液，室溫下作用30?60min)。
[0045] 6.權(quán)利要求2所述方法，其中胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是：0. 25?0. 40%胰蛋白酶 和0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯(lián)液中交聯(lián)4?6h。交聯(lián) 后用超純水或注射用水沖洗8?10次。
[0046] 7.由權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。
[0047] 8.權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)或者權(quán)利要求7所述的 高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)在篩選成纖維細(xì)胞中的用途。
[0048] 9. -種利用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合和權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基 質(zhì)篩選和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的方法，包括：
[0049] a)制備表皮細(xì)胞懸液：取材，消化，剝離表皮收集皮片，消化，用權(quán)利要求1所述的 培養(yǎng)液A終止消化，收集細(xì)胞混懸液。離心后加入培養(yǎng)液A養(yǎng)液；
[0050] b)成纖維細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)：將權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)加入權(quán)利 要求1所述的培養(yǎng)液B，加入步驟a)制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標(biāo)表皮干細(xì)胞貼壁粘附 于高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0051] c)消化富集傳代培養(yǎng)：消化，離心后加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培 養(yǎng)。優(yōu)選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細(xì)胞，免疫逃逸方法可以為射線法、低溫 凍融法

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備流程
[0053] 圖2細(xì)胞篩選培養(yǎng)
[0054] -、高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)種類
[0055] (涉及的皮膚均為器官捐獻(xiàn)，包皮環(huán)切皮膚、以及醫(yī)療救治過(guò)程中植皮取皮廢棄皮 膚組織）
[0056] I. 1其特征在于：針對(duì)本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體 內(nèi)真皮層作為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚成纖維細(xì)胞篩選分離和體外培養(yǎng)的 方法，并使獲得的高純度成纖維細(xì)胞。
[0057] 1. 2其特征在于：針對(duì)本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體 內(nèi)全層皮膚作為為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚皮膚干細(xì)胞篩選分離和體外培 養(yǎng)的方法，并使獲得的高純度皮膚干細(xì)胞。皮膚細(xì)胞包括：（成纖維細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、表皮 干細(xì)胞、及其它皮膚附件附屬相關(guān)的干細(xì)胞及皮膚相關(guān)細(xì)胞）。
[0058] 這種篩選分離和體外培養(yǎng)的方法，獲得的成纖維細(xì)胞細(xì)胞克服以上傳統(tǒng)七種方法 的缺陷。
[0059] 發(fā)明屬生物成體（胎兒）皮膚細(xì)胞細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 方法。方法特征包括：同體表皮脫細(xì)胞表皮底物預(yù)備；同體真皮細(xì)胞的分離；利用高擬體內(nèi) 附著基質(zhì)成纖維細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。目前用該法在體外已穩(wěn)定培養(yǎng)傳代超過(guò)43?60 (代）， 經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒，具有強(qiáng)的增殖能力，并可以形成成熟的全層分化真皮 皮層結(jié)構(gòu)為有關(guān)皮膚細(xì)胞在科研、教學(xué)及臨床的應(yīng)用起到不可估量的作用，同時(shí)孕育著巨 大學(xué)術(shù)方向與社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)此種方法理論基礎(chǔ)推進(jìn)我國(guó)其他器官細(xì)胞的學(xué)術(shù) 基礎(chǔ)建立。
[0060] 二、高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)成：
[0061] 經(jīng)分析含有多種膠原并包含IV型、其中I型膠原含量最大（I與III型膠原的比 例為10 : 1)，同時(shí)還保留了完整的基底膜結(jié)構(gòu)。
[0062] 三、高擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)底物孔隙率與黏附表面特征：
[0063] 高擬底物電鏡觀察，測(cè)定表皮黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32? 145 μ m，促進(jìn)黏附真皮組織再生底物基底膜多孔孔隙直徑為72?191 μ m。這種孔隙率所購(gòu) 建的空間黏附表面均有利干細(xì)胞黏附附著生長(zhǎng)、增殖、分化。
[0064] 通過(guò)以上制備方法；有效的保留了皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的微觀構(gòu)架和完整的基底膜結(jié) 構(gòu)，其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質(zhì)成分，可為真 皮干細(xì)胞等快速粘附、表皮干細(xì)胞、增殖擴(kuò)展提供有力的支持。因此，高擬底物是目前最理 想的組織工程皮膚干細(xì)胞篩選的解決方案。
[0065] 四、皮膚細(xì)胞高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)制備具體實(shí)施步驟與方法：
[0066] 一、包括以下兩個(gè)步驟種方法：
[0067] 步驟一：皮膚消毒處理過(guò)程：取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、頭 皮、腋下皮膚、及軀干皮膚均可）含表皮真皮結(jié)構(gòu)的斷層皮膚，剪切成組織塊浸泡在生理鹽 水稀釋含〇. 05?0. 1 %苯扎溴銨溶液中10?15min，消毒處理，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗 殘余苯扎溴銨。
[0068] 步驟二：低溫-60?_80°C冷凍干燥，真空度達(dá)到20?llOpa，脫去組織塊90? 95%以上水分，取出密封與真空包裝，經(jīng)輻照25?60KGY劑量滅菌。終品可以在室溫中保 存長(zhǎng)達(dá)5年。啟動(dòng)只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營(yíng)養(yǎng)液復(fù)蘇15?30min即可應(yīng)用，浸 泡延長(zhǎng)至10?12h效果更佳。使用后并且應(yīng)用去細(xì)胞漂洗液（見下方法中相應(yīng)提及適合 的脫細(xì)胞液）脫細(xì)胞處理、再經(jīng)過(guò)上述過(guò)程永生反復(fù)使用的特點(diǎn)。
[0069] 1 :步驟二【具體實(shí)施方式】：
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于篩選和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基組合， 配制培養(yǎng)液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 Μ 0. 5? 1 X 1CT4/L、維生素 Cl?3 μ g/ml、胰島素2?4 μ g/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、EGF5? 25ng/ml、氫化可的松 0· 4 μ g/ml、DMEM/F12 (31)定容到 500ml。 配制培養(yǎng)液B :配制培養(yǎng)液B :滅活胎牛血清80ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10? 25mg/ml、維生素 Μ 0. 5?1X1(T4/L、霍亂霉素2. 5?3. 5u/L、青霉素50-100u/ml、胰島素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1 ?3mg/L、干細(xì) 胞生長(zhǎng)因子（SCF)5?15ng/ml、氫化可的松0. 3μ g/ml、DMEM/F12(1 : 1)定容到500ml， ρΗ7· 2 ?7· 4。 配制培養(yǎng)液C :滅活胎牛血清60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、維生 素 B40. 5?1 X 1(T4/L、胰島素 4?6 μ g/ml、bFGF10?20ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 2? 3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF) 10?30ng/ml、霍亂霉素 2. 5?3. 5u/L、鏈霉素 50?100 μ g/ ml、氫化可的松 0· 3μ g/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7· 4。
2. -種制備高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處理；b) 脫細(xì)胞處理；優(yōu)選地，還進(jìn)一步包括將消毒或經(jīng)脫細(xì)胞處理的皮膚進(jìn)一步進(jìn)行低溫、脫水、 輻照滅菌處理；更優(yōu)選地步驟b)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶-非離子表面活性 劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液法。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其中冷酶交聯(lián)劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷消 12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，pH在7. 20?7. 40之間，交聯(lián)4?6h，超純 水或注射用水沖洗8?10次。
4. 權(quán)利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法是：0. 1?0. 25% 中性蛋白酶與〇· 01?〇· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用24? 48h。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其中絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0. 01?0. 02% EDTA含0. 6?0. 8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0. 2?0. 5% SDS溶液， 室溫下作用30?60min)。
6. 權(quán)利要求2所述方法，其中胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是：0. 25?0. 40 %胰蛋白酶和 0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯(lián)液中交聯(lián)4?6h。交聯(lián)后用 超純水或注射用水沖洗8?10次。
7. 由權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。
8. 權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)或者權(quán)利要求7所述的高擬 體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)在篩選成纖維細(xì)胞中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合和權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)篩 選和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的方法，包括： a) 制備表皮細(xì)胞懸液：取材，消化，剝離表皮收集皮片，消化，用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng) 液A終止消化，收集細(xì)胞混懸液。離心后加入培養(yǎng)液A養(yǎng)液； b) 成纖維細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)：將權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)加入權(quán)利要求 1所述的培養(yǎng)液B，加入步驟a)制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標(biāo)表皮干細(xì)胞貼壁粘附于高 擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； C)消化富集傳代培養(yǎng)：消化，離心后加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。 優(yōu)選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細(xì)胞，免疫逃逸方法可以為射線法、低溫凍融 法。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104263698SQ201410482323
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】朱寧文, 王凌儀 申請(qǐng)人:江蘇華億細(xì)胞組織工程有限公司