同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重pcr引物及其擴(kuò)增方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同步檢測莓類植物上兩種檢疫性疫霉的三重PCR引物及其擴(kuò)增方法與用途，涉及3套引物，即疫霉屬通用引物、草莓疫霉特異引物和樹莓疫霉特異引物，其中通用引物用于菌絲基因組DNA的質(zhì)量控制，建立三重PCR分子檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，疫霉屬菌株均應(yīng)出現(xiàn)884bp的擴(kuò)增片段，草莓疫霉還應(yīng)出現(xiàn)615bp特異片段，樹莓疫霉還應(yīng)出現(xiàn)559bp特異片段，三套引物可有效用于兩種疫霉的菌絲基因組DNA三重PCR特異擴(kuò)增。
【專利說明】同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物及其擴(kuò)增方 法和用途
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明設(shè)計(jì)PCR技術(shù)檢測寄生于莓類水果上草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物及其 擴(kuò)增方法和用途，屬于莓類水果上草莓疫霉和樹莓疫霉檢測領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 草莓（aflaftassa Duch)屬薔薇科草莓屬多年生縮根楽果類水果，果實(shí) 柔軟多汁，色澤艷麗，酸甜適口，營養(yǎng)豐富，富含多酚黃酮類等抗氧化物質(zhì)，能預(yù)防或減少 心血管腫瘤和貧血等疾病的發(fā)生，備受消費(fèi)者青睞，被譽(yù)為水果皇后（陳衛(wèi)平.不同草莓 品種果實(shí)品質(zhì)的比較研究.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010,22 ( 9) : 46 - 48)。目前世界上大多數(shù) 國家都有草莓栽培，世界各大洲中，亞洲草莓產(chǎn)量最多，主要分布在中國、土耳其、日本、韓 國、伊朗、以色列等，并高度集中在中國。早在2003年我國草莓年生產(chǎn)量已達(dá)134萬t，栽培 面積7.6萬hm2,分別占世界產(chǎn)量和面積的1/3和1/4,產(chǎn)量和面積均居世界第一位。草莓 年生產(chǎn)量由多至少的國家依次是：中國、美國、西班牙、波蘭、日本、意大利、韓國、墨西哥、 俄羅斯、土耳其、德國等(王忠和.草莓市場分析及其對策.北方園藝，北方園藝，2007， (7):110?111)。
[0003] 草莓疫霉(/^ /ragariae)和樹莓疫霉0°. rMi )是寄生于草莓的兩種重要檢疫性 真菌。/ragariae和rwAi是草莓疫霉的兩個(gè)變種，/ragariae主要寄主為草莓， A rMi主要寄主為樹莓。A /ragariae和A rMi均可侵染草莓，引起草莓紅心病，使草 莓植株枯萎和根部腐爛。1920在蘇格蘭的拉納克郡地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)并研究A /ragariae， 隨后在美國、澳大利亞、奧地利等報(bào)導(dǎo)，幾乎遍布主要栽培草莓的地區(qū)。1937年首次在患有 根腐病的樹莓植株上分離得到A rMi，隨后在美國，英國、澳大利亞等地報(bào)道。草莓植株發(fā) 生被侵染后幼根根尖開始腐爛，根上有長裂口時(shí)，中柱上面出現(xiàn)紅色腐爛，由于腐爛發(fā)展， 側(cè)根很快地被破壞，引起主根呈現(xiàn)鼠尾狀，中柱紅色常常擴(kuò)展到根頸。地上部癥狀取決于根 部腐爛的嚴(yán)重程度，當(dāng)條件有利于植物快速生長時(shí)，重病植株矮化，并在某些環(huán)境里，幼葉 呈淺蘭綠色、老葉是紅色、橙色或黃色。少數(shù)嚴(yán)重感病植株生長比健株差，但葉子顏色沒有 變化，輕度感病植株的地上部分不易發(fā)現(xiàn)（Maas JL，et al. Compendium of strawberry diseases. 1998)。1971年加拿大新斯科舍生發(fā)生此病害，損失達(dá)當(dāng)季栽培草莓總量的78%， 每公頃經(jīng)濟(jì)損失達(dá) 1500加幣（Gourley et al. Economic loss from strawberryred stele disease in Nova Scotia. Report, Research Station Kentville, Nova Scotia, Canada for 1971， 1972: 63-64)。
[0004] 隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快和我國對外開放的深入發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口數(shù)量日益 增大，檢疫性有害生物傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)也逐年增加。因此，急需加強(qiáng)進(jìn)境草莓及其種子上攜 帶有害生物快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定，有效保護(hù)和促進(jìn)我國草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。草莓作為一 種重要的水果，可傳帶多種有害生物，疫霉菌常規(guī)生物學(xué)檢測方法是水果帶菌檢測，經(jīng)過分 離培養(yǎng)可通過肉眼直接觀察菌落、孢子囊、卵孢子等形態(tài)特征來鑒定真菌病害。病原菌菌 株培養(yǎng)時(shí)間需達(dá)20天左右才能誘激產(chǎn)生孢子囊，此種情況不僅耗時(shí)費(fèi)力，且P. fragariae 和P. rubi均是草莓疫霉的變種，二者形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及生理特性等極為相似，很難根 據(jù)菌落形態(tài)、孢子囊的形態(tài)和脫落性、有性器官的產(chǎn)生和形態(tài)、厚垣孢子的有無、菌絲的生 長溫度等特性準(zhǔn)確、快速有效地鑒定出兩種病原菌（Brunner-Keinath, et al. On the diagnosis of phytophthora root rot of raspberry. Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes. 1992，44:179-182)，分子生物學(xué)方法如 ELISA (Mohan. Evaluation of antisera raised against Phytophthora fragariae for detecting the red core disease of strawberries by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Plant Pathologyl988, 37:206-216)、單克隆抗體（Burns et al. The use of monoclonal antibodies for the detection of fungi. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1995, 25:31-38)等已被應(yīng)用于草莓疫霉的檢測，但是只能檢測到疫霉屬的水平，不能準(zhǔn)確診斷出 P. fragariae和P.rubi。目前的檢測方法不能滿足口岸檢測"快驗(yàn)快放"的要求，導(dǎo)致錯(cuò) 過最佳防治時(shí)間，使病害在我國傳播。因此，加強(qiáng)對口岸進(jìn)境草莓及其種子攜帶有害生物快 速、準(zhǔn)確的檢測顯得極為重要，對保護(hù)和促進(jìn)我國草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明索要解決的技術(shù)問題是：設(shè)計(jì)同步檢測莓類水果上草莓疫霉和樹莓疫霉的 三重PCR引物，包括草莓疫霉特異引物和樹莓疫霉特異引物，與自行設(shè)計(jì)的疫霉屬通用引 物18SUF/18SUR，建立同步檢測柑橘屬上莓類水果上草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物 及其擴(kuò)增方法和用途。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種同步檢測草莓疫霉和樹 莓疫霉的三重PCR引物，實(shí)現(xiàn)兩種檢疫性真菌病害同步分子檢測的特異引物，序列如下： 草莓疫霉特異引物： PFSF ：TGT ΑΤΑ TTT AAT ACG ΤΑΑ ΤΤΑ GCT C PFSR ：ΑΑΤ CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 樹莓疫霉特異引物： PRSF ：ACT CCA TAA TAG ATA TAT ACG TG PRSR ：AAC CAC TTA ATG GAA AG 所述PFSF/PFSR擴(kuò)增片段為615bp，PRSF/PRSR擴(kuò)增片段為559bp，特異引物用于草莓 疫霉和樹莓疫霉的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴(kuò)增。還包括檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的 通用引物，序列如下： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 所述引物用于草莓疫霉和樹莓疫霉菌絲基因組DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為884bp，作為提取 和擴(kuò)增過程的質(zhì)量檢測。
[0007] -種同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物的擴(kuò)增方法，包括下述的擴(kuò)增 體系和擴(kuò)增程序： (1)擴(kuò)增體系 建立30yL的擴(kuò)增體系為，包括10XBuffer3. OyL (其中含終濃度為1.5mmol/L的 MgC12) ;2· 5mmol/L dNTPs 為 2· Ο μ L ;0· 4 μ L Taq DNA 聚合酶（5U/ μ L);濃度為 10 μ mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次為 0· 1 μ L/0. 1 μ L、0. 8 μ L/0. 8 μ L、 1· 5 μ L/l. 5 μ L ;DNA模板1 μ L (約為20ng),余量為雙蒸水； (2)反應(yīng)程序 設(shè)立反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，54°C復(fù)性40s，72°C延伸45s，35個(gè)循 環(huán)；72°C延伸 7min。
[0008] 上述同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物在檢測冬草莓疫霉和樹莓疫 霉方面的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是：建立了方法簡便、重現(xiàn)性好的A /ragariae和A rwW的 三重PCR引物，能將A /ragariae和A rMi區(qū)別開來。采用引物檢測試驗(yàn)過程，避免假 陰性。實(shí)現(xiàn)了在同一 PCR管中3組引物檢測A /ragariae和A rMi，該三重PCR檢測體 系的建立簡化和方便了對A /ragariae和A rMi的檢測，節(jié)約了試劑盒時(shí)間，檢測快速、 可靠，可有效在口岸檢測中推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明菌絲基因組DNA三重PCR擴(kuò)增。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 本發(fā)明的同步檢測檢疫性真菌草莓疫霉A /ragariae和樹莓疫霉A rMi的四 重PCR引物，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測/hagariae和rw辦i。
[0012] (1)設(shè)計(jì)草莓疫霉和樹莓疫霉的各自的特異性引物，引物序列如下： 草莓疫霉特異引物： PFSF ：TGT ΑΤΑ TTT AAT ACG ΤΑΑ ΤΤΑ GCT C PFSR ：ΑΑΤ CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 樹莓疫霉特異引物： PRSF :ACT CCA ΤΑΑ TAG ΑΤΑ TAT ACG TG PRSR ：AAC CAC TTA ATG GAA AG PFSF/PFSR擴(kuò)增片段為615bp，PRSF/PRSR擴(kuò)增片段為559bp，這兩套特異引物用于草莓 疫霉和樹莓疫霉的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴(kuò)增。
[0013] (2)自行設(shè)計(jì)的草莓疫霉和樹莓疫霉的通用引物，序列如下： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 上述引物用于草莓疫霉和樹莓疫霉菌絲基因組DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為884bp，作為提取 和擴(kuò)增過程的質(zhì)量檢測。
[0014] 本發(fā)明建立檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的是重PCR引物及其擴(kuò)增方法，包括擴(kuò)增體 系的建立及反應(yīng)程序的設(shè)立。
[0015] (1)擴(kuò)增體系 建立30 μ L的擴(kuò)增體系為，包括10XBuffer3. 0 μ L (其中含終濃度為1. 5mmol/L的 MgC12) ;2· 5mmol/L dNTPs 為 2. 0 μ L ;0· 4 μ L Taq DNA 聚合酶（5U/ μ L);濃度為 10 μ mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次為 0· 1 μ L/0. 1 μ L、0. 8 μ L/0. 8 μ L、 1· 5 μ L/l. 5 μ L ;DNA模板1 μ L (約為20ng),余量為雙蒸水； (2)反應(yīng)程序 設(shè)立反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，54°C復(fù)性40s，72°C延伸45s，35個(gè)循 環(huán)；72°C延伸 7min。
[0016] 本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了三套引物，包括A /hagariae和A rMi的特異引物PFSF/ PFSR和PRSF/PRSR以及通用引物18SUF/18SUR，對所有實(shí)驗(yàn)材料菌絲DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，避 免假陰性，三套引物對A /ragariae和A rMi進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增。
[0017] 所述同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物在檢測草莓疫霉和樹莓疫霉 方面的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明建立了簡便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的A /ragariae和A rw辦i的三重PCR分子檢測方法，能將A /ragariae和A rMi區(qū)別開來。該方法的建立為 兩種檢疫性真菌病害的同步分子檢測提供了特異可行的方法，節(jié)約了世界和時(shí)間，檢測快 速、可靠，整個(gè)過程在一個(gè)工作日內(nèi)完成，可有效在口岸檢測中推廣應(yīng)用。
[0019] 下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明： 實(shí)施例1 :實(shí)驗(yàn)材料菌絲的培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)供試菌株為A /ragariai?和A 同屬菌株，共計(jì)17個(gè)菌株(見表1)。實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)的材料包括5株ATCC菌株購買于美國菌種保藏中心，7株CBS菌株購買于荷蘭菌種保 藏中心，3株ACCC菌株購買于中國微生物菌種保藏中心，Ljf2012-4和Ljf2011-9為天津出 入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心從美國臍橙和澳大利亞柑橘上截獲，供試材料的相 關(guān)信息見表1. 表1供試材料

【權(quán)利要求】
1. 一種同步檢測檢疫性真菌病害草莓疫霉A /ragariae和樹莓疫霉A /ragariae. raW的三重PCR引物，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測/hagariae和rwAi，引物序列如下： 通用引物： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 草莓疫霉特異引物： PFSF ：TGT ΑΤΑ TTT AAT ACG TAA TTA GCT C PFSR ：AAT CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 樹莓疫霉特異引物： PRSF ：ACT CCA TAA TAG ATA TAT ACG TG PRSR ：AAC CAC TTA ATG GAA AG 所述通用引物18SUF/18SUR擴(kuò)增片段為884bp，作為DNA提取和擴(kuò)增過程的質(zhì)量控制； 特異引物PFSF/PFSR擴(kuò)增片段為615bp，PRSF/PRSR擴(kuò)增片段為559bp，這三套特異引物用 于草莓疫霉和樹莓疫霉的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴(kuò)增。
2. -種權(quán)利要求1所述的同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物及其擴(kuò)增方 法，其特征在于，包括下述的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序： (1) 擴(kuò)增體系 建立30yL的擴(kuò)增體系為，包括10XBuffer3. OyL (其中含終濃度為1.5mmol/L的 MgC12) ;2· 5mmol/L dNTPs 為 2. 0 μ L ;0· 4 μ L Taq DNA 聚合酶（5U/ μ L);濃度為 10 μ mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次為 0· 1 μ L/0. 1 μ L、0. 8 μ L/0. 8 μ L、 1· 5 μ L/l. 5 μ L ;DNA模板1 μ L (約為20ng),余量為雙蒸水； (2) 反應(yīng)程序 設(shè)立反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，54°C復(fù)性40s，72°C延伸45s，35個(gè)循 環(huán)；72°C 延伸 7min。
3. 如權(quán)利要求1所述同步檢測草莓疫霉和樹莓疫霉的三重PCR引物及在檢測冬草莓疫 霉和樹莓疫霉方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104195259SQ201410472466
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】崔鐵軍, 郭京澤, 劉躍庭, 羅加鳳, 朱林慧, 李關(guān)榮, 廖芳 申請人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心