位于簇毛麥6vs dna滲入到小麥抗白粉病近等基因系序列及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗白粉病近等基因系京411/6VS.6AL/京4117配制方法和6VS滲入近等基因系DNA片段序列。該近等基因系的獲得是以抗白粉病小麥易位系T6VS.6AL為抗病基因供體親本，以農(nóng)藝性狀優(yōu)良但不抗白粉病的栽培小麥京411為輪回親本，T6VS.6AL與京411雜交后，獲得的F1再與京411連續(xù)回交7代，自交1代育成近等基因系411/6VS.6AL/京4117。每一次的雜交和回交，均在白粉菌脅迫下選擇抗病單株。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EACG/M14-301是6VS上的專一分子標(biāo)記，它可以用于小麥抗白粉病種質(zhì)資源的篩選和 Pm21 高抗、廣譜抗病特性的機(jī)理研究以及小麥起源進(jìn)化、遠(yuǎn)緣雜交親本選擇等方面的研究。
【專利說明】位于簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系序列 及應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明得到國家自然科學(xué)基金(編號：31071671)和天津市科技支撐重點(diǎn) (11ZCKFNC00700)資助。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，涉及抗白粉病近等基因系配制、簇毛麥6VS DNA滲 入到小麥抗白粉病近等基因系的序列證據(jù)以及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 近等基因系（Near isogenic line, NIL)是通過一個重要農(nóng)藝性狀優(yōu)良但某一性 狀不夠理想的栽培種作為輪回親本（Recurrent parent, PR)與一個具目標(biāo)基因的品種或 品系雜交、回交6-8代后再自交一代培育而成，因此NIL與PR是遺傳背景相同僅目標(biāo)基因 有差異的一對品種。由于NIL可以用于目標(biāo)基因的分離、基因的精細(xì)定位與克隆及基因多 效性分析，目前，已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)研究以及育種實(shí)踐中。但由于NIL的培育時間長， 在回交選育過程中，容易受發(fā)育、環(huán)境條件及人為因素的影響，因此，為保證NIL的培育質(zhì) 量與選擇效果，對NIL遺傳背景評估與檢測十分重要。早期研究者們利用回交世代與外觀 形態(tài)對NIL的遺傳背景進(jìn)行評價，但這種方法多側(cè)重于NIL與PR的遺傳相似性分析上，對 特定目標(biāo)基因的跟蹤即供體基因在NIL中的檢測則報道較少。雖然近10多年來，利用分子 標(biāo)記技術(shù)追蹤NIL目標(biāo)基因的工作取得進(jìn)展，如Kaczorowski等在黃豆抗Kagl NIL中篩選 到與目標(biāo)基因相連鎖的22個SFPS，Martin等在番茄抗Pro NIL中發(fā)現(xiàn)存在抗病基因供體 片段，Stan等發(fā)現(xiàn)在10個NIL中有目標(biāo)基因片段的存在，我們在以Brock為供體基因配制 的小麥抗白粉病NIL中也篩選到了與供體基因相連鎖的P15/M14-160AFLP分子標(biāo)記。上述 工作為提高NIL的培育質(zhì)量與篩選效益發(fā)揮了積極作用。
[0004] 儀毛復(fù)(Masypyrum villosum，2 ^\=2Χ=]Α，Ψ〇 是普通/\、復(fù)(Jriticum aestivum, 2N=6X=42, MBBDD)的野生近緣種。我國學(xué)者陳佩度等利用簇毛麥與小麥雜交結(jié)合輻射培育 了小麥-簇毛麥染色體易位系（T6VS. 6AL)，細(xì)胞與抗性遺傳學(xué)研究表明，抗小麥白粉病基因 ZfeW位于6VS上。ZfeW被證實(shí)對所有的菌株都是免疫的。近期，他們的研究又發(fā)現(xiàn)抗 白粉病基因基因區(qū)域中的一個關(guān)鍵基因絲氨酸/蘇氨酸激酶基因泣K。本發(fā)明以 T6VS. 6AL為抗白粉病基因供體，以生產(chǎn)上已推廣種植多年但對白粉病敏感的小麥優(yōu)良品種 京411為輪回親本，在白粉菌脅迫下，經(jīng)過連續(xù)8年的回交轉(zhuǎn)育，培育了具強(qiáng)抗白粉病特性的 NIL，用AFLP分子標(biāo)記方法，對NIL中供體基因進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，找到了簇毛麥6VS基因組滲入 NIL中的分子證據(jù)和NIL中來源于簇毛麥6VS上的部分同源分子序列。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入到小 麥抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于具有SEQ ID N0:1 所述的核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明公開的位于簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系序列的制備方 法，其特征在于包括如下步驟 1、抗白粉病近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117配制： 供試材料普通栽培小麥京411 aeWira?，2N=6X=42，AABBDD)，農(nóng)藝性狀 優(yōu)良，但易感染白粉??；抗白粉病小麥-簇毛麥染色體易位系6VS. 6AL (T6VS. 6AL)，易位系 中的6VS來源于簇毛麥2N=2X=14, VV)。以6VS. 6AL為抗病供體親 本，京411為輪回親本配制的近等基因系京411/6VS.6AL/京4117( Near-isogenic Lines, NIL)。其過程為T6VS.6ALX京411雜交，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代 育成抗白粉病近等基因系411/6VS. 6AL/京4117 ;每一次的雜交和回交，均在白粉菌脅迫下 選擇抗病單株。
[0007] 2、簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列證據(jù)的獲得： 提取栽培小麥京411、T6VS. 6AL、簇毛麥和NIL基因組DNA，用AFLP分析技術(shù)，尋找在普 通小麥中不存在，但同時存在于NIL、簇毛麥和T6VS. 6AL的差異譜帶，克隆并測序這些差異 帶，通過BLAST比對確定同時存在于NIL、簇毛麥和T6VS. 6AL的差異片段的DNA堿基序列， 同源性高達(dá)100%的片段即為簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列證據(jù)。
[0008] 3、簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列證據(jù) 一種通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基 因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列為： GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCA TTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCC TGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTT GTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
[0009] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入 到小麥抗白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在制備抗白粉病育種中的應(yīng)用。我們 用EACG/M14為引物，在輪回親本京411、簇毛麥、抗白粉病小麥-簇毛麥易位系T6VS.6AL、 近等基因系（京411/6VS. 6AL/京4117) 120個單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段EACG/M14-301與 6VS緊密連鎖。
[0010] 本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下： 1材料 供試材料普通栽培小麥京411 aesiira?，2N=6X=42, AABBDD)，農(nóng)藝性 狀優(yōu)良，但易感染白粉病；抗白粉病小麥-簇毛麥染色體易位系6VS.6AL (T6VS.6AL);以 6VS. 6AL為抗病供體親本，京411為輪回親本配制的近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117 ( Near-isogenic Lines, NIL)。散毛"復(fù) iDasypyrum villosum，2N=2X=14, VV) 2材料培養(yǎng)及抗病性鑒定 將小麥種子放置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，20°C下于人工氣候箱中催芽，待根長Icm 時轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)土中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：白天溫度25°C，濕度60%，光照強(qiáng)度 80,16h ;夜間溫度22°C，濕度60%，黑暗，8h。小麥長至一葉一心期時，用毛筆蘸取新鮮的白粉 菌孢子均勻刷在葉片表面，培養(yǎng)7-10天后，調(diào)查小麥感病情況?？共〉燃壈凑帐殮J（1988) 提出的O?4級分級法(0型為免疫，1?4型分別表示高抗、抗、敏感、高度感?。┓椒ㄟM(jìn)行。 [0011] 3不同抗性材料接種白粉菌后的顯微觀察 分別剪取不同染菌時間（211、411、811、1211、1611、2011、2411、3611、4811、6011、7211)小麥葉片，各 取中間2cm左右葉段4段，置于固定透明液(無水乙醇：冰乙酸3:1，0. 15%三氯乙酸沖固定 72h，再用染色液（0. 6%考馬斯亮藍(lán)R-250甲醇溶液:15%三氯乙酸=:11)染色24h，沖洗葉片 表面的染色液后于保存液(冰乙酸：甘油：水=1:4:15)中保存待用。取葉段于載玻片上，用 保存液作浮載液制成臨時裝片，于顯微鏡下（Nikon Al)觀察附著胞形態(tài)及宿主抗性反應(yīng)等 互作情況，統(tǒng)計白粉菌孢子數(shù)、孢子萌發(fā)芽管數(shù)、正常附著胞數(shù)、畸形附著胞數(shù)以及寄主細(xì) 胞的結(jié)構(gòu)特征變化等。
[0012] 4 NIL 的 AFLP 分析 4. 1小麥DM的提取采用CTAB法，略有改動：稱取0. 2g幼嫩葉片剪碎于研缽中，加液氮 迅速研磨成粉狀轉(zhuǎn)入5ml離心管，加 ImlDNA提取緩沖液（0. IM Tris ·α，ρΗ8. 0 ;0. 02mM EDTA， ρΗ8· 0 ;1· 4M NaCl ;4%CTAB ;1%PVP)，65°C水浴 90min，期間每 IOmin 振搖一次；10000rpm，4°C 離心lOmin，取上清液于新的5ml離心管，加等體積的酚-氯仿-異戊醇（25 :24 :1)輕輕上 下顛倒充分混勻，IOOOOrpm離心IOmin,吸取上清液于新的5ml離心管，再次加等體積酚-氯 仿-異戊醇抽提，IOOOOrpm離心lOmin，吸取上層水相于2ml離心管；加等體積冷異丙醇，于一 20°C放置20min以上。待DNA沉淀后于12000rpm離心10min，收集沉淀；加72〇μ175%乙醇， 8(^lNaAc (3Μ，ρΗ5. 2)洗滌沉淀，靜置 20min，12000rpm 離心 IOmin ;加 80〇μ175% 乙醇，洗滌沉 淀，靜置 l〇min，12000rpm 離心 10min，收集沉淀；加 ΙΟΟμΙΤΕ (Tris ·α，1Μ，Ε?ΤΑ，0. 5Μ，ρΗ8· 0) 溶解DNA，加2PlRNAse，于37°C孵育Ih降解RNA ;加等體積氯仿-異戊醇（24 :1)去除RNAse， IOOOOrpm離心IOmin,取上清；重復(fù)一次；取上清，加2倍體積冷無水乙醇，1/10體積NaAc,混 勻后于一20°C放置20min，12000rpm離心10min，收集沉淀，沉淀用75%乙醇洗2次，稍離心， 去掉洗滌液，晾干后溶于4〇μ1ΤΕ。取5μ1?ΝΑ樣品在0. 7%的瓊脂糖凝膠上檢測DM的完整性。 取2μ1樣品用Nanodrop 2000C測定DNA的濃度。
[0013] 4. 2 AFLP擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 AFLP分析參照Vos等的方法。所用接頭和引物見表1?；蚪MDNA雙酶切及接頭連接、 預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測參照張榮等[7 ]的方法。
[0014] 表！ AFLP分析所用接頭和引物

【權(quán)利要求】
1. 一種通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等 基因系的DNA片段EACG/M14-301基因序列，其特征在于具有SEQ ID N0:1所述的核苷酸序 列。
2. 權(quán)利要求1所述位于簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系序列的制備方 法，其特征在于包括如下步驟： (1) 抗白粉病近等基因系京411/6VS. 6AL/京4117配制 以6VS. 6AL為抗病供體親本，京411為輪回親本配制的近等基因系京411/6VS. 6AL/京 4117 ( Near-isogenic Lines, NIL);其過程為 T6VS.6ALX 京 411 雜交，所得 抗白粉 病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系411/6VS. 6AL/京4117 ;每一次的 雜交和回交，均在白粉菌脅迫下選擇抗病單株； (2) 族毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列的獲得 通過BLAST比對確定同時存在于NIL、簇毛麥和T6VS. 6AL的差異片段的DNA堿基序列， 同源性高達(dá)100%的片段即為簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列； (3) 簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基因系的序列 一種通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗白粉病近等基 因系的DNA片段EACG/M14-301，其序列為： GACTGCGTACCAATTCACGACGCAGCAGCCTGTGAAGCAGAAAAGCTACGACGAGTATCCAGGTGGTCTCCA TTACGAGCATTATACCTGTTTTATACACCATTTCGCAGCCTACCCCTGTAGGGAGACATGTTACTCAGGACTCATCC TGAGTCCTGAGTAACATGGGGGACTCTGCTCTTTTCTGGACTGATGCCTGGTTCATTGGTGGTTCCTCACGACCCTT GTGTTGAAGGTTGCCTAGATTATTCTCCTTTGTCAACGATGATAAGGTATCAGTGCGTGAATTGGTACGCAGTCA。
3. 權(quán)利要求1所述通過近等基因系和AFLP方法獲得的簇毛麥6VS DNA滲入到小麥抗 白粉病近等基因系的DNA片段EACG/M14-301在制備抗白粉病育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104278028SQ201410470561
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王振英, 劉曉穎, 彭永康, 范寶莉, 陳宏
申請人:天津師范大學(xué)