一種狂犬病病毒滅活蛋白疫苗、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型的重組狂犬病病毒蛋白，所述重組蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白和狂犬病病毒基質(zhì)蛋白自主組裝而成；所述融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指將仿生核肽通過反向遺傳技術(shù)整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白C端所形成的重組蛋白。本發(fā)明還提供利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)所述重組蛋白的方法。將所述桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備的重組狂犬病病毒蛋白滅活后，與防腐劑混合，即制備得到狂犬病病毒滅活蛋白疫苗。本發(fā)明制備的疫苗具有免疫原性好、耐熱性好、安全性高、無需佐劑等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種狂犬病病毒滅活蛋白疫苗、其制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)、基因工程以及動(dòng)物疫苗領(lǐng)域，具體地說，涉及一種狂犬病 病毒滅活蛋白疫苗、其制備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病，民間俗稱為"瘋狗病"或"恐水癥"，是一種極為古老的人獸共患傳染病，該 病是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV或RABV)感染所致，幾乎所有的溫血?jiǎng)游锖腿硕家?感，病毒侵入機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起急性致死性腦脊髓炎，其特點(diǎn)是潛伏期長(zhǎng)，一旦發(fā) 病，致死率近乎100%。目前為止尚無特效的治療藥物，最為有效的辦法是通過注射狂犬病 疫苗進(jìn)行預(yù)防。
[0003] 流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示，我國(guó)人的狂犬病95%由狂犬病病犬/貓或帶毒犬/貓， 經(jīng)抓傷、撓傷、咬傷所傳染，所以控制人類狂犬病的關(guān)鍵是要控制住犬/貓狂犬病，綜合防 控，以達(dá)到消滅人間狂犬病的目的。在我國(guó)，犬/貓的飼養(yǎng)量大，特別是偏遠(yuǎn)農(nóng)村，雖然現(xiàn)有 狂犬疫苗能有效的保護(hù)犬貓免受狂犬病病毒的感染，但是由于疫苗價(jià)格昂貴，而且疫苗的 熱穩(wěn)定不佳運(yùn)輸保存不便，導(dǎo)致狂犬病疫苗接種率低，因此制備耐熱、價(jià)廉、高效、易接種的 狂犬病疫苗是預(yù)防控制動(dòng)物狂犬病的重要且可行方式。
[0004] RABV為單股不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，屬?gòu)棤畈《究瓶袢《緦俚某蓡T。RABV粒子 直徑75nm，長(zhǎng)100-300nm，結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出子彈狀。RABV粒子分為外殼和核衣殼，前者為一層 脂質(zhì)雙分子膜，是病毒復(fù)制過程中來源于宿主細(xì)胞的成分。糖蛋白（G)鑲嵌于其中，形成穗 狀的突起，與宿主細(xì)胞受體作用，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的唯一結(jié)構(gòu)蛋白?；|(zhì)蛋白 (M)，屬連接蛋白，在核衣殼和包膜間起連接作用，連接內(nèi)外兩部分。核衣殼是由一條核糖核 酸及包裹其外的核蛋白（N)構(gòu)成，N蛋白和基因組RNA構(gòu)成復(fù)合物，使基因組免遭核酸酶降 解，保證RNA完整性。L蛋白同P蛋白協(xié)同行使RNA依賴的RNA聚合酶功能。N、P、L蛋白同 RNA互相作用構(gòu)成核糖核蛋白（RNP)復(fù)合物，是基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄模板。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的耐熱重組狂犬病病毒蛋白疫苗、其制備方法及應(yīng) 用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種重組狂犬病病毒蛋白，所述重組蛋白是由融 合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白與狂犬病病毒基質(zhì)蛋白組成；所述重組了仿生核肽的 狂犬病病毒囊膜蛋白是指將仿生核肽通過反向遺傳技術(shù)整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白上 所形成的重組蛋白。
[0007] 其中，所述重組了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列； 所述狂犬病病毒基質(zhì)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加 一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] 本發(fā)明還提供上述重組狂犬病病毒蛋白的制備方法，其是利用桿狀病毒/昆蟲細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)所述重組蛋白：將狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因，狂犬病 病毒基質(zhì)蛋白基因分別按昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因序列一起克隆到 具有多個(gè)啟動(dòng)子與表達(dá)盒（例如雙啟動(dòng)子與雙表達(dá)盒）的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體中，并位于不同啟 動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì) 粒，用重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞拯救獲得重組桿狀病毒（例如，待昆蟲細(xì)胞 的細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染），將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后 收獲上清，即得到狂犬病病毒重組蛋白顆粒。
[0009] 其中，優(yōu)化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，優(yōu)化后的狂犬病病毒基質(zhì)蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 所述轉(zhuǎn)移表達(dá)載體選自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、 pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、 pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAc JcC5、 pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、 pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEX I. 1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、 pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT EkpFastBacHT C、pFastBacDual 或 其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體中的至少一種。
[0011] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)移表達(dá)載體為PFastBacDual，優(yōu)化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿 生核肽的融合基因位于Pltl啟動(dòng)子下游，優(yōu)化后的狂犬病病毒基質(zhì)蛋白基因位于Ph啟動(dòng)子 下游，形成兩個(gè)高效表達(dá)盒。
[0012] 所述昆蟲細(xì)胞選自草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9、Mimic Sf9 細(xì)胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua)Se 301 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 細(xì)胞系、 BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 細(xì)胞系、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni)H5 細(xì)胞系、BTI-Tn-5C1 細(xì)胞 系、BTI-Tn-5F2 細(xì)胞系、斜紋貪夜蛾（Spodoptera litura) ZSU-Sl-I 細(xì)胞系、IBL-SLlA 細(xì)胞 系和家蠶卵巢細(xì)胞系BmN等中的至少一種。
[0013] 優(yōu)選地，用Sf9細(xì)胞進(jìn)行重組桿狀病毒的拯救和滴定，用H5昆蟲細(xì)胞進(jìn)行重組蛋 白顆粒的表達(dá)。
[0014] 前述制備方法中，將獲得的重組桿狀病毒按MOI = 0. 1接種昆蟲細(xì)胞，4-5天后收 獲上清，即得狂犬病病毒重組蛋白顆粒。
[0015] 本發(fā)明還提供所述重組狂犬病病毒蛋白在制備狂犬病病毒滅活蛋白疫苗中的應(yīng) 用。將所述重組蛋白輔以滅活劑、防腐劑制備狂犬病病毒滅活蛋白疫苗。所述滅活劑為二 乙烯亞胺，終濃度為0. 025%，所述防腐劑為疊氮鈉，終濃度為0. 01 %。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供由所述重組狂犬病病毒蛋白制備的狂犬病病毒滅活蛋白疫苗， 所述疫苗為肌肉注射疫苗或口服疫苗。
[0017] 本發(fā)明提出了一種能改善疫苗熱穩(wěn)定性和活疫苗免疫原性的組合設(shè)計(jì)方法，將仿 生核肽（biomimetic nucleating peptides)通過反向遺傳學(xué)技術(shù)整合到狂犬病病毒囊膜 糖蛋白上，這樣就能在生理?xiàng)l件下將磷酸鈣礦化引入到疫苗表面，獲得一個(gè)礦化表殼。這種 方法能利用疫苗自我生物礦化（self-biomineralization)作用，提高其穩(wěn)定性和免疫原 性。
[0018] 這種自我生生物礦化工程蛋白復(fù)合體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，病毒學(xué)和化學(xué)性質(zhì)。與許 多礦化物質(zhì)相似，這種礦化外殼令封閉的疫苗產(chǎn)生了一些新特性，例如，自我礦化疫苗能儲(chǔ) 存在26 °C下超過9天，在37 °C下保存約1周的時(shí)間，依然能有效地產(chǎn)生抗體的作用，這也就 減少了對(duì)于冷凍環(huán)境的依賴。
[0019] 制備包括囊膜糖蛋白作為外殼，基質(zhì)蛋白作為內(nèi)殼的蛋白復(fù)合物，去掉免疫抑制P 蛋白，既保有了保護(hù)性抗原，又具備一定的空間形態(tài)。嵌合的仿生核肽能夠自動(dòng)吸附培養(yǎng)基 中的鈣離子（生物礦化），克服了通常純化的蛋白并沒有免疫原性，或免疫原性較弱，需要 強(qiáng)大的佐劑來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，一些外源性抗原無法到達(dá)APCs的細(xì)胞質(zhì)，因此不 能夠刺激CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)。本發(fā)明制備的重組狂犬病病毒蛋白具有高的免疫原性，注射 免疫不需要任何佐劑。
[0020] 本發(fā)明提供的嵌合狂犬病病毒蛋白，是通過將空衣殼技術(shù)與生物礦化相結(jié)合從而 獲得的新型耐熱重組狂犬病病毒蛋白，這將有助于減少目前疫苗生產(chǎn)過程中的成本，尤其 適用于缺乏昂貴的制冷基礎(chǔ)設(shè)施的發(fā)展中國(guó)家。
[0021] 本發(fā)明基于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞生物反應(yīng)器中安全、高效 地生產(chǎn)狂犬病病毒重組蛋白顆粒，并且在培養(yǎng)過程中狂犬病病毒重組蛋白顆粒能自動(dòng)包裹 一層鈣離子，使得該復(fù)合物的耐熱性和免疫原性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的狂犬病病毒抗原。本發(fā)明 方法制備的狂犬病病毒重組蛋白顆粒，表達(dá)量高、耐熱性好、無需佐劑、免疫原性好、易發(fā) 酵，且制備方法成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明高效表達(dá)轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建模式圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明重組桿狀病毒基因組的PCR鑒定結(jié)果；其中，1.陰性對(duì)照，2和3. GBP 目的帶，4和5. M目的帶，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0024] 圖3為本發(fā)明重組桿狀病毒Bacmid桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后的細(xì)胞病變情況。
[0025] 圖4為本發(fā)明重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。
[0026] 圖5為本發(fā)明包含仿生核肽的重組狂犬病病毒蛋白Western Blot檢測(cè)結(jié)果。
[0027] 圖6為本發(fā)明重組蛋白的電鏡檢測(cè)結(jié)果。
[0028] 圖7為本發(fā)明重組蛋白的降解情況；其中，A. 25°C條件，B. 37°C條件。
[0029] 圖8為本發(fā)明包含仿生核肽的狂犬病病毒重組蛋白顆粒體外刺激小鼠脾細(xì)胞，細(xì) 胞因子檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖9為本發(fā)明包含仿生核肽的重組狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后中和抗體水 平。
[0031] 圖10為本發(fā)明包含仿生核肽的重組狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后，攻毒保護(hù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0033] 以下實(shí)施例中使用的試驗(yàn)材料：
[0034] 大腸桿菌株E. coli DH5 α購(gòu)自Promega公司；克隆載體pEASY_T3購(gòu)自全式金公 司；克隆載體PMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司；原核表達(dá)載體pET-28a+、受體菌E. coli TOPlO和 BL21(DE3)購(gòu)自長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司，運(yùn)載載體pFastBacDual購(gòu)自Invitrogen公 司；狂犬病病毒HuNPB3株、SR9株，Sf9和H5昆蟲細(xì)胞、N2A細(xì)胞、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體 病毒親本株AcMNPV由長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司保存。
[0035] 酶與試劑：限制性內(nèi)切酶和配套的緩沖液均購(gòu)自Promega公司；T4 DNA Ligase及 緩沖液為Promega公司產(chǎn)品；LA Taq聚合酶及緩沖液購(gòu)自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs購(gòu) 自Sigma公司；各種規(guī)格的DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為TranGen Biotech公司產(chǎn)品；DEPC、 M-MLV-Rtase (逆轉(zhuǎn)錄酶）購(gòu)自Promega公司。
[0036] 生化試劑：bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal 購(gòu)自 Promega 公司；Tris、 Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED (Ν，Ν, Ν'，Ν'-Tetram ethylethylene diamine)、過硫酸銨（Ammonium Persulfate)、卡那霉素（Kanamycin)、細(xì) 胞培養(yǎng)基TC-100購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖為Sunbiotech公司產(chǎn)品；酵母抽提物（Yeast Extract)、胰蛋白胨均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；溴化乙錠（EB)、考馬斯亮蘭R-250購(gòu)自Fluka 公司；瓊脂粉為日本進(jìn)口分裝；Proteinase K、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；其它均為國(guó) 產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。引物由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
[0037] 試劑盒：IFN- γ、IL-2和IL-4細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&DSYSTEMS公司；狂犬病 病毒糖蛋白定量試劑盒購(gòu)自DRG公司。
[0038] 培養(yǎng)基：大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基。
[0039] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6_8周齡雌性BALB/C小鼠購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所沖華田園犬（6-8 月齡，抗狂犬病病毒中和抗體滴度小于0. 5IU)購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所。
[0040] 狂犬病病毒滅活蛋白疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在國(guó)家規(guī)定的隔離實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
[0041] 實(shí)施例1耐熱狂犬病病毒蛋白滅活疫苗、制備方法、小鼠免疫及攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0042] 1實(shí)驗(yàn)方法
[0043] 1. 1有關(guān)溶液和培養(yǎng)基的配制
[0044] 溶液 I :50mmol/L 葡萄糖，2Smmol /T, Tris-HCl (pH8. 0), 10mmol/L EDTA。
[0045] 溶液 II :0· 2mol/L NaOH，I % SDS (現(xiàn)用現(xiàn)配）。
[0046] 溶液 III : IOOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL，CldH2O 8mL。
[0047] TAE(50X) :242g Tris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0· 5mol/L EDTA(pH8. 0)，無菌水 定容至lOOOmL。
[0048] TER 溶液：胰 RNAse (RNAse A)溶解于 IOmM Tris-HCl、15mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的儲(chǔ)存液_20°C凍存，用I X TE緩沖液稀釋成20 μ g/mL的工作液4°C保存。
[0049] PPt 緩沖液：異丙醇 22mL ；5mol/mL KAc ImL ;ddH20 2mL。
[0050] IXTE 緩沖液：10mmol/L Tris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA(pH8. 0)，121°C 高溫高 壓蒸汽滅菌20min后儲(chǔ)存于4°C。
[0051] 溴化乙錠（EB)溶液母液：將EB配成濃度為10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器儲(chǔ)存 于室溫即可。
[0052] 6 mol/L NaI :將(λ 75g Na2SO3 溶于 40mL CldH2O 中，加入 45g NaI 并攪拌至完全溶 解，4°C儲(chǔ)存。
[0053] 玻璃奶（Glassmilk):將 IOg (100mg/mL，Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS 中，沉淀2h，棄上清，重復(fù)該步驟2?3次；2000g離心2min，將沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。
[0054] New Wash 洗液：Tris-HCl (pH 7. 4) 20mmol/L ;EDTA lmmol/L ;NaCl lOOmmol/L ;與 等體積的無水乙醇配制而成。
[0055] 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)物IPTG為I mol/L，超純水配制后用0. 2 mm濾器過濾除菌。
[0056] 蛋白上樣緩沖液（2X) :100mmol/L Tris-HCl (pH6. 8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇 (DTT)、4% SDS、0. 2%溴酚藍(lán)、10%甘油。
[0057] 30%丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，Ig N，f -亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，過 濾。
[0058] 考馬斯亮藍(lán)染液：0· 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇：水（1: 1，v/v)和IOmL 冰乙酸中。
[0059] 脫色液：90mL甲醇：水（I: 1，v/v)和IOmL冰乙酸。
[0060] 裂解緩沖液（ρΗ8· 0) :50mmol/L Tris_Base、0. IM NaCl。
[0061] 包涵體洗滌液 I (ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、l% TritonX-100。
[0062] 包涵體洗滌液 II (pH8. 0) :20mmol/L Tris-Base、0. 2M NaCl、2M 尿素。
[0063] 包涵體蛋白溶解液（ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、8M 尿素。
[0064] 脲 NTA-O 緩沖液：20mM Tris-HCl ρΗ7· 9,0· 5 M NaCl，10% Glycerol，8M Urea。 脲 NTA-500 緩沖液：20mM Tris-HCl ρΗ7·9,0· 5MNaCl，10 %Glycerol，8M Urea，0.5M Imidazole。
[0065] Bradford 試劑為 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。
[0066] ELISA 所需試劑：包被液（pH9. 6) I. 59g Na2C03、2. 93g NaHC03、ddH20 定容至 1L，保 存于4°C;臨用前配制封閉液，BSA溶于PBS中至終濃度為I 洗滌液為含0. 05% Tween-20 的PBS ;底物緩沖液為I. 84g Na2PO4 · 12H20、0. 51g檸檬酸、CldH2O定容至IOOmL ;0PD顯色 液是4mg OPD溶于10 mL底物緩沖液，加15 μ L 30% H2O2，臨用前配制；終止液為2 mol/L H2SO4。
[0067] Western Blot試劑：半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)膜緩沖液是14. 41g甘氨酸、12. llgTris_Base、50 mL甲醇、CldH2O定容至I L、4°C保存；IXPBS加 Tween-20至終濃度為0. 1 %配成洗滌液；BSA 溶于PBS中至終濃度為3%為封閉液；純化的多克隆抗體用封閉液按1:1000稀釋；HRP標(biāo) 記的羊抗兔IgG抗體用封閉液按1:1000稀釋；臨用前配制DAB顯色液，4mg DAB溶于10 mL 100 mmol/L ρΗ7· 5 的 Tris-Cl 中，力口 15μ L 30% H202。
[0068] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調(diào)整pH值7. 0(固體培養(yǎng) 基含1. 5%瓊脂）。液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉，121°C高溫高壓蒸汽滅菌15 min，在溫 度低于45°C且還未凝固時(shí)，加入相應(yīng)抗生素溶液，混勻后倒入平板，為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，4°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0069] I. 2狂犬病病毒糖蛋白和基質(zhì)蛋白基因原始序列的獲得
[0070] I. 2. 1狂犬病病毒SRV9株
[0071] 狂犬病病毒SRV9株由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。
[0072] L 2. 2 TRIzol 法提取基因組 RNA
[0073] (1)將狂犬病病毒放入盛有Trizol (50-100mg組織/ImL)的玻璃勻漿器中混勻，液 體體積不要超過Trizol體積的10% ;
[0074] (2)將勻漿液在室溫下放置5min以使核蛋白質(zhì)復(fù)合體完全裂解；
[0075] (3)加入氯仿（0· 2mL/lml Trizol)，蓋緊管蓋并漩渦劇烈震蕩15sec ;室溫放置 2-15 min ；
[0076] (4)4°C，12000g離心15min。離心后，混合液被分為三相：處于下層的淺紅色酚-氯 仿有機(jī)相、中間相和上層無色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存留于間相和有 機(jī)相中，水相體積約為用于勻漿的Trizol體積的60% ;
[0077] (5)將水相移入新管，加異丙醇（0· 5mL/lmLTrizol);室溫放置5-10min ;
[0078] (6)4-25°C，12000g離心8min，RNA沉淀在管壁或管底形成膠狀的或白色的小球；
[0079] (7)棄上清，用ImL 75%乙醇清洗RNA沉淀；然后4-25°C，7500g離心5min ;
[0080] (8)棄上清，干燥；沉淀重溶于20 μ L DEPC處理的雙蒸水（CldH2O)或去離子甲酰胺 中，-70°C保存?zhèn)溆?。若沉淀難溶，可用吸管吹打數(shù)次并55-60°C溫育10_15min。
[0081] 1.2. 3目的基因的擴(kuò)增
[0082] 引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank公布的序列AF499686,設(shè)計(jì)狂犬病病毒G基因和M基 因原始序列的擴(kuò)增引物為：
[0083] SRV9G 上游：5, -AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3,（BamHI)
[0084] SRV9G 下游：5，-GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3,（EcoR I)
[0085] SRV9M 上游：5, -TTTCTCGAGATGAACTTCCTGCGCAAGATCG-3,（XhoI)
[0086] SRV9M 下游：5, -TTTGCTAGCTTATTCCAGCAGCAGGGAGGAG-3,（NheI)
[0087] L 2. 4 RT-PCR 反應(yīng)
[0088] 1. 2. 4. I cDNA 第一鏈的合成
[0089] 取 2 μ LRNA (彡 1 μ g) +2 μ L RHDV-RT+13. 75 μ L DEPC 處理水；7(TC，5min，迅速置 冰上 5min ;加入 5 μ L 5 XM-MLV 緩沖液 +1. 25 μ LlOmM dNTPs+1 μ L M-MLV-RT (200U)，使終 體積為25μ L ;混勻后室溫放置IOmin ;42°C反應(yīng)Ih ;70°C 2min滅活RTase，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0090] L 2. 4. 2 PCR擴(kuò)增目的基因
[0091] 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表1。
[0092] 表1反應(yīng)體系及反應(yīng)程序
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 重組狂犬病病毒蛋白，其特征在于，所述重組蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病 毒囊膜蛋白與狂犬病病毒基質(zhì)蛋白組成；所述融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指 將仿生核肽通過反向遺傳技術(shù)整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白C端上所形成的重組蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組狂犬病病毒蛋白，其特征在于，所述融合了仿生核肽的 狂犬病病毒囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè) 或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；所述狂犬病病毒基質(zhì)蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 4所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求1或2所述重組狂犬病病毒蛋白的制備方法，其特征在于，其是利用桿狀病 毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)所述重組蛋白：將狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基 因，狂犬病病毒基質(zhì)蛋白基因分別按昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因序列 一起克隆到具有多個(gè)啟動(dòng)子與表達(dá)盒的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體中，并位于不同啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性質(zhì)粒即為重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，用重組桿狀病 毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞拯救獲得重組桿狀病毒，將獲得的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì) 胞，培養(yǎng)后收獲上清，即得到重組狂犬病病毒重組蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，優(yōu)化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核 肽的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，優(yōu)化后的狂犬病病毒基質(zhì)蛋白基因的核 苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移表達(dá)載體選自AcRP23-lacZ、 AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、 p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、 pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、 pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、 pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、 pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVPIO、pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、 pSHONEXL UpSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL 1393、pVL941、 pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、 pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體 中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移表達(dá)載體為pFastBacDual,優(yōu)化 后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因位于P ltl啟動(dòng)子下游，優(yōu)化后的狂犬病病 毒基質(zhì)蛋白基因位于Ph啟動(dòng)子下游。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞選自草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9 細(xì)胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua) Se 301 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 細(xì)胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 細(xì)胞系、粉紋夜 蛾（Trichoplusia ni)H5細(xì)胞系、BTI-Tn-5C1細(xì)胞系、BTI-Tn-5F2細(xì)胞系、斜紋貪夜蛾 (Spodoptera litura) ZSU-Sl-I細(xì)胞系、IBL-SLlA細(xì)胞系和家蠶卵巢細(xì)胞系BmN中的至少 一種。
8. 權(quán)利要求1或2所述重組狂犬病病毒蛋白在制備狂犬病病毒滅活蛋白疫苗中的應(yīng) 用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述重組狂犬病病毒蛋白輔以滅活劑、 防腐劑制備狂犬病病毒滅活蛋白疫苗；所述滅活劑為二乙烯亞胺，終濃度為〇. 025%，所述 防腐劑為疊氮鈉，終濃度為〇. 01 %。
10. 由權(quán)利要求1或2所述重組狂犬病病毒蛋白制備的狂犬病病毒滅活蛋白疫苗，其特 征在于，所述疫苗為肌肉注射疫苗或口服疫苗。
【文檔編號(hào)】C12N15/866GK104211817SQ201410469258
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】夏振強(qiáng), 鄭文文, 鄭學(xué)星, 王化磊, 金宏麗 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司