具有益生作用的短小芽孢桿菌315及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)315，保藏編號為CGMCC NO.8878。短小芽孢桿菌315具有提高飼料利用率，促進飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；增強動物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；無污染，無殘留，生物環(huán)保等特點。本發(fā)明的短小芽孢桿菌可作為一種新型的益生菌添加劑，廣泛應用于飼料中。CGMCC No.88782014.03.03
【專利說明】具有益生作用的短小芽孢桿菌315及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及一種具有益生作用的短小芽孢桿菌315 及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，其數(shù)量與質(zhì)量、生產(chǎn)與環(huán)境以及效益與資源之間的 矛盾越來越突出。尤其是畜禽排泄物對環(huán)境造成的污染日趨嚴重，大量的有害物排放使得 畜禽場污染物中的BOD(生化需氧量）和COD(化學需氧量）值急劇上升，同時也成為一些 疾病發(fā)生和傳播的潛在誘因。
[0003] 另一方面，食品安全問題正引起越來越多的關(guān)注，在造成食品安全問題的諸多原 因中，重要原因之一是飼料中使用抗生素作為促生長劑。客觀上，抗生素自20世紀50年代 以來廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，在促進動物生長，保證動物健康，節(jié)約飼料成本，提高經(jīng)濟效 益等方面做出了巨大貢獻。但由于抗生素在動物養(yǎng)殖業(yè)中的長期使用，近些年來，由其所致 的毒副作用和藥物殘留問題已引起人們的關(guān)注。2006年，歐盟已經(jīng)全面禁止了飼料中抗生 素的使用，美國和日本等國家也對其做出了嚴格的限制。2011年，韓國全國禁止在動物飼料 中添加抗生素。
[0004] 隨著人們對畜產(chǎn)品安全和環(huán)境保護意識的不斷加強，作為抗生素的替代品，益生 菌越來越多的應用于動物營養(yǎng)和飼料中。益生菌是一類能改善動物胃腸道微生態(tài)平衡，有 益于動物健康和生產(chǎn)性能發(fā)揮的微生物添加劑。其主要作用效果體現(xiàn)在改善動物新陳代 謝，提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用，提高免疫力，減少環(huán)境污染等方面發(fā)揮重要作用。
[0005] 由于芽孢桿菌對干燥、高溫、高壓、氧化等不良環(huán)境抵抗力很強，這種穩(wěn)定性增加 了它作為益生菌的潛力。因此，獲得新型具有益生特性的芽孢桿菌的研究具有重大意義。分 離和篩選抗病原菌且具有益生效果的短小芽孢桿菌，可以更好的應用于飼料添加劑，以代 替抗生素。但短小芽孢桿菌作為益生菌制劑或飼料添加劑的研究與應用較少，尤其是在替 代飼養(yǎng)抗生素和減少環(huán)境污染等方面。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有益生作用的短小芽孢桿菌315及其在動物飼料中 的應用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的短小芽孢桿菌315(BacillUS pumilus)是從養(yǎng) 豬場附近土壤中篩選到的一株芽孢桿菌。經(jīng)16S rRNA基因序列分析和體外益生效果評價， 該菌株為能夠抑制病原菌且具有益生和減少畜禽養(yǎng)殖環(huán)境污染效果的短小芽孢桿菌，其 16S rRNA序列如SEQ ID NO. 1所示。該菌株已于2014年3月3日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)， 保藏號為 CGMCC No. 8878。
[0008] 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus) 315的微生物學特性為：革蘭氏陽性菌，無鞭 毛和莢膜；菌體表面干燥，有褶皺，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉。
[0009] 本發(fā)明提供含有該短小芽孢桿菌315的菌劑。
[0010] 本發(fā)明還提供短小芽孢桿菌315或上述菌劑在廣譜抗菌中的應用。其中，短小芽 孢桿菌315的抑菌譜包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌；所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄 球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心）；所述革蘭氏陰性菌為致病性大腸桿菌，如K88(Escherichia coli IVDC C83901)， 鼠傷寒沙門氏菌，如Salmonella typhimurium IVDC C79_13(中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心）。
[0011] 本發(fā)明還提供一種含有該短小芽孢桿菌315的動物飼料添加劑。該飼料添加劑含 有短小芽孢桿菌315的活菌數(shù)為I X 109CFU/g?I X 101(lCFU/g ;優(yōu)選地，含有短小芽孢桿菌 315的添加劑的活菌數(shù)為5X109CFU/g。
[0012] 本發(fā)明還提供一種含有該具有益生作用的短小芽孢桿菌315飼料添加劑的動 物飼料。其中，所述動物飼料中短小芽孢桿菌315飼料添加劑的添加量為質(zhì)量百分比的 1%。。因此，動物飼料中短小芽孢桿菌315的活菌數(shù)為IX 109CFU/kg?5X 109CFU/kg，優(yōu)選 5 X IO9CFUAg0
[0013] 本發(fā)明通過體外法鑒定了短小芽孢桿菌315的益生效果，結(jié)果表明，短小芽孢桿 菌315能夠耐酸、酸膽鹽，能抵抗胃腸道的內(nèi)環(huán)境，具備益生菌的潛力。
[0014] 本發(fā)明還采用體外法鑒定短小芽孢桿菌315耐酸、耐膽鹽和模擬胃腸道環(huán)境中生 長的益生潛力，包括以下步驟：
[0015] 1)配制不同pH值的培養(yǎng)基，檢測短小芽孢桿菌315的生長情況；
[0016] 2)配制不同膽鹽濃度的培養(yǎng)基，檢測短小芽孢桿菌315的生長情況；
[0017] 3)模擬人工胃腸液，檢測短小芽孢桿菌315的生長情況。
[0018] 本發(fā)明進一步驗證了短小芽孢桿菌315在斷奶仔豬飼料添加中的應用效果。
[0019] 本發(fā)明的短小芽孢桿菌315 (Bacillus pumilus)，最適pH 7. 2?7. 4,最適溫度 37°C，能夠耐受體內(nèi)環(huán)境，具有良好的益生效果。它是一株能夠抑制腸道內(nèi)病原菌的益生 菌，它能夠耐酸、耐鹽、耐人工胃腸液的環(huán)境，表明其具備益生菌的潛質(zhì)。通過在豬、奶牛、蛋 雞飼料添加中應用效果的研究，表明短小芽孢桿菌315可作為一種新型的益生菌添加劑， 廣泛應用于飼料中。
[0020] 本發(fā)明篩選得到的短小芽孢桿菌315具有提高飼料利用率，促進飼料中營養(yǎng)物質(zhì) 的消化吸收；增強動物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；無污染，無殘留，生物環(huán)保等 特點。比枯草芽孢桿菌具有更好的益生特性和用作飼料添加劑的潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1短小芽孢桿菌315在不同pH值下的生長情況
[0022] 圖2短小芽孢桿菌315對豬舍氨氣濃度的影響

【具體實施方式】
[0023] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0024] 以下實施例中涉及的試驗材料和試劑：
[0025] L菌株：病原菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠傷寒 沙門氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大腸桿菌K88 (Escherichia coli IVDC C83901)由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供。
[0026] 2.生化試劑：DNA提取試劑盒購自天根公司，膽鹽、胃蛋白酶、胰蛋白酶購自Sigma 公司，其它均為國產(chǎn)試劑。
[0027] 3.培養(yǎng)基：
[0028] ⑴肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水lOOOmL，pH值7. 2? 7. 4,121°C 滅菌 20min。
[0029] ⑵肉湯固體培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，去離子水lOOOmL，瓊脂 20g，pH 值 7. 2 ?7. 4,121°C 滅菌 20min。
[0030] 以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版）J.薩姆布魯克一書中描述的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
[0031] 實施例1短小芽孢桿菌的315的（CGMCC NO. 8878)分離和鑒定
[0032] 采集養(yǎng)豬場附近的土壤，按1:10倍比稀釋于生理鹽水中。取IOOyL稀釋液涂布 于營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。挑起菌落表面形成皺醭的單菌落在營養(yǎng)肉湯固體 培養(yǎng)基上劃線分離，重復劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法分離到34株菌種，分 別命名為301-334。
[0033] 應用瓊脂擴散的牛津杯法篩選具有抑菌活力的短小芽孢桿菌。向肉湯培養(yǎng)基中加 入瓊脂后，溶解均勻，高壓滅菌，冷卻到50°C左右，每20mL培養(yǎng)基加入20 μ L新鮮培養(yǎng)的指 示菌（108CFU/mL)，混勻倒入培養(yǎng)皿冷卻。用滅菌的鑷子將無菌的牛津杯輕輕的放入培養(yǎng)皿 中，在牛津杯中分別加入301-334各80 μ L單株菌液，向另一個牛津杯中加入80 μ L無菌營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作對照，37°C培養(yǎng)24h。篩選出能形成抑菌圈的菌液，其菌株編號為315。
[0034] 以上使用的指示菌分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大腸桿菌 K88 (Escherichia coli IVDC C83901)〇
[0035] 取IOmL 315培養(yǎng)液，低速離心獲得菌體。用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN， DP302)提取細菌總DNA。
[0036] 以IOng純化的細菌總DNA作為模板，擴增16S rRNA基因。所用引物為原 核生物 16S rRNA 基因的通用引物：27F :5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3' 和 1492R : 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。引物由北京博邁德生物有限公司合成。
[0037] PCR 擴增體系為 50yL，包括 0.5yL Taq 酶（0.5U/mL)、5.0yL10XPCR 反應緩沖 液、4· 0μ L dNTP Mixture、l. 0μ L 模板DNA、1. 0μ L 正向引物 27F(25ymol/L)、1· 0μ L 反向 引物 1492R(25 μ mol/L)和 37. 5 μ L ddH20。
[0038] 擴增條件：95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30 個循環(huán)；72°C 7min，4°C終 止反應。PCR產(chǎn)物序列測定由北京博邁德生物有限公司完成。
[0039] 短小芽孢桿菌315經(jīng)16S rRNA基因測序，測得序列經(jīng)Blast比對，結(jié)果該菌株 與 GenBank 中 Bacillus pumilus strain 3L-10F 16S ribosomal RNA gene(GenBank accession number :EU379272)序列相似性為98%。初步確定315為短小芽孢桿菌，該菌株 已于2014年3月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC， 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，分類命 名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，保藏號為CGMCC No. 8878。其微生物學特性為：革 蘭氏陽性菌，無鞭毛和莢膜；菌體表面干燥，有褶皺，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白 質(zhì)、多種糖及淀粉。
[0040] 實施例2短小芽孢桿菌315耐酸耐膽鹽特性測定
[0041] 測定短小芽孢桿菌315在低pH中的生長狀態(tài)，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng) 基為不同pH值梯度，分別為2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0和6. 4。短小芽孢桿菌315培養(yǎng)液按1 % (v/v)分別接種于不同pH值營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，測(?^^值。試驗結(jié)果如圖 1所示，短小芽孢桿菌315在pH = 4. 0的培養(yǎng)基中存活率為68%，說明短小芽孢桿菌315 在低酸的環(huán)境能夠保持一定的活菌數(shù)。
[0042] 在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為0% (對照）、0. 15%、0. 3%和 0. 6%。短小芽孢桿菌315接種于上述不同濃度的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，通過平 板計數(shù)法計算活菌數(shù)。結(jié)果見表1，短小芽孢桿菌0.3%膽鹽濃度下存活率達到80%。由于 動物體內(nèi)膽鹽濃度在〇. 3%左右，所以短小芽孢桿菌315能夠耐受體內(nèi)的膽鹽環(huán)境。
[0043] 表1短小芽孢桿菌315在不同濃度膽鹽中培養(yǎng)24h的活菌數(shù)
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)315,其保藏編號為CGMCC NO. 8878。
2. 含有權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌315的菌劑。
3. 權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌315在廣譜抗菌中的應用。
4. 權(quán)利要求2所述菌劑在廣譜抗菌中的應用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，短小芽孢桿菌315的抑菌譜包括革蘭氏陽 性菌和革蘭氏陰性菌； 所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌；所述革蘭氏陰性菌為致病性大腸桿菌、鼠傷寒 沙門氏菌。
6. 權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌315在制備飼料添加劑中的應用。
7. 含有權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌315的飼料添加劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的飼料添加劑，其特征在于，飼料添加劑中短小芽孢桿菌315的 活菌數(shù)為 1. 〇 X 1〇9 ?1. 〇 X l〇1QCFU/g。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的飼料添加劑，其特征在于，飼料添加劑中短小芽孢桿菌315的 活菌數(shù)為 5.0X109CFU/g。
10. 含有權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌315的動物飼料。
【文檔編號】C12R1/07GK104263683SQ201410469105
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】刁其玉, 張乃鋒, 祁敏麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所