鑒定白花草木樨和黃花草木樨特異分子標(biāo)記試劑盒及其檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明主要涉及一種根據(jù)片段長(zhǎng)度鑒定白花草木樨(M.albus)和黃花草木樨(M.officinalis)的特異分子標(biāo)記及其專(zhuān)用引物。具體包括白花草木樨和黃花草木樨基因組DNA的分子標(biāo)記引物試劑盒及其檢測(cè)方法。一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記，其主要特點(diǎn)包括有：白花草木樨和黃花草木樨的PCR檢測(cè)體系相同，其中包括2×Eco Taq PCR SuperMix，引物Melilotus-F(5′-3′)：GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物Melilotus-R(5′-3′)：CTTTACCGTTTGAGCTATCC，ddH2O。鑒定結(jié)果表明，該技術(shù)具有成本低、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好和簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)，尤其是受測(cè)群體較大時(shí)，此種方法具有更顯著的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鑒定白花草木樨和黃花草木樨特異分子標(biāo)記試劑盒及其檢 測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的分子標(biāo)記及其專(zhuān)用引物。具 體涉及白花草木樨和黃花草木樨基因組DNA的分子標(biāo)記引物試劑盒及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 草木樨屬為豆科的一年生或二年生草本植物全世界約19種，分布于北半球的溫 帶和亞熱帶，在中國(guó)主要分布在遼寧、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古等地。目前，草木樨屬植物在全世 界共有19種（Stevenson，1969)，主要分布于中亞、北非和歐洲，我國(guó)現(xiàn)有11種（張保烈等， 1992)。草木樨植物主要用作飼料，也是重要的藥用植物，有清熱解毒、健胃化濕等功效（祝 文妹，2008)。草木樨適應(yīng)性很強(qiáng)，耐旱、耐瘠薄、耐寒、耐鹽堿（馬麗，2005)，既能作牧草和 綠肥，又能保持水土，防風(fēng)擋沙（叢建明，2012)，同時(shí)還是蜜源植物（趙春生，2008)。草木 樨固氮效率優(yōu)于其它豆科牧草（Stickler and Johnson, 1959)，利于輪作，是固氮研究模式 植物（Hirsch, 2002)。
[0003] 草木樨生產(chǎn)中僅有3個(gè)品種，分別為斯列金1號(hào)和天水黃花草木樨、天水白花草木 樨。目前生產(chǎn)中流通的品種混雜程度較高，不利于區(qū)分，因而準(zhǔn)確迅速的區(qū)分白花草木樨和 黃花草木樨，對(duì)于白花草木樨和黃花草木樨的生產(chǎn)具有十分重要的意義。
[0004] 傳統(tǒng)的分類(lèi)方法主要依據(jù)白花草木樨和黃花草木樨的形態(tài)進(jìn)行區(qū)分（Stevenson, 1969)，而它們除花色明顯不同外在形態(tài)學(xué)上極為相似，沒(méi)有快速準(zhǔn)確的鑒別方法。而且在 長(zhǎng)期的生長(zhǎng)過(guò)程中，兩種草木樨有發(fā)生雜交和性狀交叉，使得兩種草木樨在形態(tài)學(xué)上更難 區(qū)分。這對(duì)兩種牧草的生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。
[0005] 本研究采用分子標(biāo)記的方法，設(shè)計(jì)一對(duì)專(zhuān)用引物，依據(jù)兩種草木樨?cái)U(kuò)增片段長(zhǎng)度 不同進(jìn)行鑒別。該方法具有成本低、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好和簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)，尤其是受測(cè)群 體較大時(shí)，此種方法具有更顯著的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的一是提供一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的專(zhuān) 用引物。
[0007] 本發(fā)明的目的二是提供一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試 劑盒。
[0008] 本發(fā)明的目的三是提供一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的方 法。
[0009] 以便快速、高效和準(zhǔn)確的鑒定白花草木樨和黃花草木樨。此方法省時(shí)高效，操作簡(jiǎn) 便，在實(shí)驗(yàn)室條件下較短時(shí)間內(nèi)能夠很好完成。研究中，隨機(jī)從美國(guó)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)抽取的12 份白花草木樨、10份黃花草木樨種質(zhì)都可適用，具有很強(qiáng)的推廣價(jià)值，有助于種子檢驗(yàn)人員 快速有效區(qū)分白花草木樨和黃花草木樨。為白花草木樨和黃花草木樨在開(kāi)花前的鑒定提供 高效和準(zhǔn)確的方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨 的特異分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物，其主要特點(diǎn)是包括有：
[0011] 白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物:Melilotus-F(5，-3，）：GGTTCMGTCCCTCTATC ;
[0012] MeliIotus-R(5， -3， ） ：CTTTACCGTTTGAGCTATCC。
[0013] 一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，其主要特點(diǎn)包括 有：
[0014] 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix，弓I 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物 Melilotus-R(5 ' -3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC 和 CldH2O ;
[0015] 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix，弓I 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物 Melilotus-R(5 ' -3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC 和 CldH2O。
[0016] 一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的方法，其主要包括如下步 驟：
[0017] A.分別種植白花草木樨和黃花草木樨，采集葉片，提取基因組DNA備用；
[0018] B.利用白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)白花草木樨基因組DNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOyldI 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ 1，ddH207. 5 μ 1 和白花草木樨 DNA 模板（50ng/ μ I) 0· 5 μ I ;擴(kuò) 增條件為：（1)941：預(yù)變性31^11;(2)941：變性3〇8;(3)6〇1：退火3〇8 44)721：延伸3〇8; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min。
[0019] C.利用白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)黃花草木樨種子基因組DNA進(jìn)行 PCR檢測(cè)；PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOyUI 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ 1，ddH207. 5 μ 1 和黃花草木樨 DNA 模板（50ng/ μ 1) (λ 5 μ I ;擴(kuò) 增條件為：（1)94°〇預(yù)變性31^11;(2)941：變性3〇8;(3)6〇1：退火3〇 8;(4)721：延伸3〇8; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min。
[0020] D.將白花草木樨和黃花草木樨PCR產(chǎn)物在同一張6%變性丙烯酰胺膠片中電泳， 電泳電壓為400V，跑膠I. 5h ;AgN03燃料染色，燈箱上照相；
[0021] E.其電泳擴(kuò)增條帶大小都在150bp-200bp之間，擴(kuò)增條帶172bp為白花草木樨； 擴(kuò)增條帶183bp為黃花草木樨。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是，可以快速有效地鑒定出白花草木樨和黃花草木樨。此方法 具有成本低、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性強(qiáng)和簡(jiǎn)單快捷等特點(diǎn)，能夠大批量進(jìn)行白花草木 樨和黃花草木樨的鑒定，為保障兩種牧草純度鑒定提供可行依據(jù)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1.白花草木樨和黃花草木樨在形態(tài)學(xué)上的相似性。
[0024] 圖中：(A和B)白花草木樨和黃花草木樨種子、（C和D)白花草木樨和黃花草木樨 葉片、（E)白花草木樨和黃花草木樨花絮、（F和G)白花草木樨和黃花草木樨植株
[0025] 圖2.兩種白花草木樨和黃花草木樨（見(jiàn)表1)間的PCR鑒定結(jié)果。
[0026] 圖中：白花草木樨（M. albus)的1-10編號(hào)表不白花草木樨10個(gè)單株，黃花草 木樨（M. officinalis)的1-10編號(hào)表示黃花草木樨10個(gè)單株，"M"表示DL500的DNA Marker，"H20"表示以CldH 2O為模板的負(fù)對(duì)照組。
[0027] 圖3.不同種質(zhì)的白花草木樨和黃花草木樨間的PCR鑒定結(jié)果。
[0028] 圖中：白花草木樨（M. albus)的1-12編號(hào)表不白花草木樨12個(gè)不同種質(zhì)（見(jiàn)表 2)，黃花草木樨（M. officinalis)的1-10編號(hào)表不黃花草木樨10個(gè)不同種質(zhì)（見(jiàn)表3)，"M" 表示DL500的DNA Marker, "H20"表示以CldH2O為模板的負(fù)對(duì)照組。
[0029] 圖4.白花草木樨和黃花草木樨混合的PCR鑒定結(jié)果。
[0030] 圖中：100:0、99:1、95:5、90:10、75:25、50:50、25:75、10:90、5:95、1:99 和 0:100表示白花草木樨和黃花草木樨基因組DNA模板混合的比例，"M"表示DL500的 DNAMarker，" H2O "表示以CldH2O為模板的負(fù)對(duì)照組。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明， 并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0032] 實(shí)施例1 : 一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的專(zhuān)用引物，包括 有：
[0033] 白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物:Melilotus-F(5，-3，）：GGTTCMGTCCCTCTATC ;
[0034] MeliIotus-R(5， -3， ） ：CTTTACCGTTTGAGCTATCC。
[0035] 實(shí)施例2 :-種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，包括有：
[0036] 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系，PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlOy 1，引物Melilotus-FC -3，）：GGTTCAAGTCCCTCTATClyl， Melilotus-R(5, -3，）：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ 1 和 ddH207. 5 μ I ;
[0037] 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系，PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1， 其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlOyl，引物引物Melilotus-F(5 ' -3 '): GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3，）：CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ 1 和 ddH207. 5 μ 1。
[0038] 實(shí)施例3 :-種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，包括有：
[0039] 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的兩倍。
[0040] 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的兩倍。
[0041] 實(shí)施例4 :一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，包括有：
[0042] 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的五倍。
[0043] 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的五倍。
[0044] 實(shí)施例5 :-種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，包括有：
[0045] 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的十倍。
[0046] 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系與實(shí)施例2相同，數(shù)量為實(shí)施例2的十倍。
[0047] 實(shí)施例6 :-種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的方法，包括如下 步驟：
[0048] A.分別種植白花草木樨和黃花草木樨，采集葉片，提取基因組DNA備用；
[0049] B.利用白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)白花草木樨基因組DNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOyldI 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ I，ddH207. 5 μ 1 和白花草木樨 DNA 模板（50ng/ μ I) 0· 5 μ 1。擴(kuò) 增條件為：（1)94°〇預(yù)變性31^11;(2)941：變性3〇 8;(3)6〇1：退火3〇8;(4)721：延伸3〇8; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min ;
[0050] C.利用白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)黃花草木樨基因組DNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOyldI 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC1 μ I，ddH207. 5 μ 1 和黃花草木樨 DNA 模板（50ng/ μ I) 0· 5 μ 1。擴(kuò) 增條件為：（1)94°〇預(yù)變性31^11;(2)941：變性3〇 8;(3)6〇1：退火3〇8;(4)721：延伸3〇8; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min ;
[0051] D.將白花草木樨和黃花草木樨PCR產(chǎn)物在同一張6%變性丙烯酰胺膠片中電泳， 電泳電壓為400V，跑膠I. 5h ;AgN03燃料染色，燈箱上照相；
[0052] E.其電泳擴(kuò)增條帶大小都在150bp_200bp之間，擴(kuò)增條帶172bp為白花草木樨； 擴(kuò)增條帶183bp為黃花草木樨。
[0053] 實(shí)施例7 :鑒定兩種白花草木樨和黃花草木樨間的分子標(biāo)記的方法，包括如下步 驟：
[0054] 從12份白花草木樨和10份黃花草木樨種質(zhì)中各抽取一種種質(zhì)作為參試材料（見(jiàn) 表1)。種植材料，收集葉片，提取這兩個(gè)種質(zhì)各10份單粒種子的基因組DNA，共3份。將其 濃度稀釋為50ng/μ 1，用作模板，采用MeliIotus-F和MeliIotus-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0055] PCR檢測(cè)體系的總體積為20 μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOy 1，引 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC1 μ 1，引物 Melilotus-R(5，-3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCCly 1，ddH207. 5 μ 1 和 DNA 模板（50ng/μ 1)0. 5μ 1。擴(kuò)增條件為： (1)94°C預(yù)變性 3min ;(2)94°C變性 30s ;(3)60°C退火 30s ;(4)72°C延伸 30s ;(5)2-4 步驟循 環(huán) 29 次；（6)72°C 延伸 7min。
[0056] 將20份白花草木樨和黃花草木樨的PCR產(chǎn)物在同一張 6 %變性丙烯酰胺膠片中電 泳，電泳電壓為400V，跑膠I. 5h。然后AgNO3燃料染色，燈箱上照相。
[0057] 其效果為：
[0058] 圖2顯示白花草木樨（PI662299)和黃花草木樨（PI552552)各10個(gè)單粒種子的基 因組DNA為模板，其電泳擴(kuò)增條帶大小都在150bp-200bp之間，并且黃花草木樨（PI552552) 的電泳擴(kuò)增片段大于白花草木樨（PI662299)。
[0059] 表1.白花草木樨和黃花草木樨參試種質(zhì)的信息描述
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的引物，其特征是包括有： 白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物：Melilotus-F(5' -3' ):GGTTCAAGTCCCTCTATC; Melilotus-RG' -3，）：CTTTACCGTTTGAGCTATCC。
2. -種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的試劑盒，其特征包括有： 第一組：白花草木樨PCR檢測(cè)體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix，引 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物 Melilotus-R(5 ' -3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC 和 ddH20 ; 第二組：黃花草木樨PCR檢測(cè)體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix，引 物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC，引物 Melilotus-R(5 ' -3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC和 ddH20。
3. -種鑒定白花草木樨和黃花草木樨的特異分子標(biāo)記的方法，其特征是包括如下步 驟： A. 分別種植白花草木樨和黃花草木樨，采集葉片，提取基因組DNA備用； B. 利用鑒定白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)白花草木樨基因組DNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)；PCR檢測(cè)體系的總體積為20μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlOy 1，引物 Melilotus-Fb' -3' ):GGTTCAAGTCCCTCTATC Ιμ?，引物 Melilotus-Rb' -3'): CTTTACCGTTTGAGCTATCC 1 μ 1，ddH20 7· 5 μ 1 和白花草木樨 DNA 模板，50ng/ μ 1，0· 5 μ 1 ; 擴(kuò)增條件為：（1)94°C預(yù)變性 3min ;(2)94°C變性 30s ;(3)60°C退火 30s ;(4)72°C延伸 30s ; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min ; C. 利用白花草木樨和黃花草木樨專(zhuān)用引物，對(duì)黃花草木樨基因組DNA進(jìn)行PCR檢 測(cè)；PCR檢測(cè)體系的總體積為20μ1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix 10μ1，引物 Melilotus-F(5 ' -3 ' ) :GGTTCAAGTCCCTCTATC Ιμ?，引物 Melilotus-R(5 ' -3 '): CTTTACCGTTTGAGCTATCC 1 μ 1，ddH20 7· 5 μ 1 和黃花草木樨 DNA 模板，50ng/ μ 1，0· 5 μ 1 ; 擴(kuò)增條件為：（1)94°C預(yù)變性 3min ;(2)94°C變性 30s ;(3)60°C退火 30s ;(4)72°C延伸 30s ; (5) 2-4步驟循環(huán)29次；（6) 72°C延伸7min ; D. 將白花草木樨和黃花草木樨PCR產(chǎn)物在同一張6%變性丙烯酰胺膠片中電泳，電泳 電壓為400V，跑膠1. 5h ;AgN03燃料染色，燈箱上照相； E. 其電泳擴(kuò)增條帶大小都在150bp-200bp之間，擴(kuò)增條帶172bp為白花草木樨；擴(kuò)增 條帶183bp為黃花草木樨。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104278084SQ201410461065
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】張吉宇, 狄紅艷, 駱凱, 段珍, 張代玉, 吳凡 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)