一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括基體，所述基體內(nèi)構(gòu)建有兩端伸出基體外壁的纖維培養(yǎng)體，該纖維培養(yǎng)體由凝膠材質(zhì)構(gòu)成；所述纖維培養(yǎng)體內(nèi)設(shè)有兩個(gè)或兩個(gè)以上用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道，各通道之間相互獨(dú)立，每個(gè)通道具有分別位于纖維培養(yǎng)體兩端的入口和出口；所述凝膠材質(zhì)為海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了上述模型的制備方法。本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以建立兩種及兩種以上的細(xì)胞的非接觸式共培養(yǎng)體系，可以最大限度地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)，便于觀察和后續(xù)檢測(cè)分析。同時(shí)，本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，利用基于島型噴頭的打印裝置，操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高。
【專利說明】一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞共培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型及制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]體外細(xì)胞共培養(yǎng)是將兩種或兩種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中的技術(shù)。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)能模擬體內(nèi)細(xì)胞正?；顒?dòng)的微環(huán)境，有利于觀察細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。
[0003]目前細(xì)胞共培養(yǎng)的方法主要有直接接觸式共培養(yǎng)和非直接接觸式共培養(yǎng)。直接接觸式共培養(yǎng)是將不同類型的細(xì)胞在同一個(gè)培養(yǎng)體系中混合在一起進(jìn)行共同培養(yǎng)，使兩種細(xì)胞直接接觸，并通過旁分泌、自分泌作用產(chǎn)生細(xì)胞生產(chǎn)因子等進(jìn)行相互作用。其缺點(diǎn)是不同類型的細(xì)胞發(fā)生直接接觸，不能徹底分開，不利于后續(xù)分析觀察。非直接接觸式共培養(yǎng)是將兩種或兩種以上的細(xì)胞分別接種在不同的載體上，然后將這些載體置于同一個(gè)培養(yǎng)環(huán)境中，共培養(yǎng)體系中一者對(duì)另者的影響是通過旁分泌的細(xì)胞因子相互作用，但兩者不接觸。由于兩種細(xì)胞容易分離，便于觀察和不影響后續(xù)的檢測(cè)。
[0004]目前常用的非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法是使用Transwell小室共培養(yǎng)法:基于有通透性的杯狀裝置，杯子底層放一張有通透性的膜，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，細(xì)胞A種在上室內(nèi)，下層種植細(xì)胞B，細(xì)胞B的培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。這種方法中的垂直結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)無法排除重力干擾也不利于進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，而且價(jià)格昂貴。
[0005]由于現(xiàn)有的細(xì)胞共培養(yǎng)方法存在一定的缺陷，限制了細(xì)胞共培養(yǎng)研究的進(jìn)展，因此開發(fā)成本低廉、便捷實(shí)用的非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)方法是未來的重要發(fā)展方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，通過該細(xì)胞共培養(yǎng)模型，能夠保證不同細(xì)胞不直接接觸，且可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用行為的觀察與分析，降低了重力等外界因素的影響。
[0007]本發(fā)明同時(shí)還提供了一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，該方法能夠制造出實(shí)用且可控的非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)模型，生產(chǎn)效率高，經(jīng)濟(jì)便捷。
[0008]一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括基體，所述基體內(nèi)構(gòu)建有兩端伸出基體外壁的纖維培養(yǎng)體，該纖維培養(yǎng)體由凝膠材質(zhì)構(gòu)成；所述纖維培養(yǎng)體內(nèi)設(shè)有兩個(gè)或兩個(gè)以上用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道，各通道之間相互獨(dú)立，每個(gè)通道具有分別位于纖維培養(yǎng)體兩端的入口和出口 ；所述凝膠材質(zhì)為海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物。
[0009]本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型采用由生物兼容性凝膠材料制造成的纖維培養(yǎng)體作為細(xì)胞的載體，將細(xì)胞種植在相鄰的通道內(nèi)，利用凝膠的通透性，將不同類型的細(xì)胞分隔開進(jìn)行培養(yǎng)。由于水凝膠具有通透性，分子可以透過凝膠間壁進(jìn)行交換，不需要單獨(dú)開設(shè)交換孔道。通道內(nèi)含有目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)液，利用細(xì)胞的貼壁性，共培養(yǎng)的細(xì)胞貼附在通道的內(nèi)壁上。本發(fā)明凝膠材質(zhì)為海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物，具有通透性的纖維培養(yǎng)體實(shí)心部分即為海藻酸鈣，形成的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度較高。
[0010]所述基體由凝膠材質(zhì)構(gòu)成、或者由聚二甲基硅氧烷構(gòu)成。所述凝膠材料可采用海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物。該模型由生物兼容性的凝膠材料制造包覆中空纖維結(jié)構(gòu)的基體，利用基體具有一定的強(qiáng)度，將共培養(yǎng)模型構(gòu)建在一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境中。
[0011]所述纖維培養(yǎng)體呈迂回狀布置。纖維培養(yǎng)體采用呈迂回狀布置，進(jìn)一步減小了整個(gè)模型的體積，同時(shí)滿足了各種場(chǎng)合的需求。
[0012]一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，該方法利用基于島型噴頭的打印工藝來制造含有多通道的培養(yǎng)模型，然后在相鄰?fù)ǖ乐蟹謩e種植不同種類的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)非接觸式細(xì)胞共培養(yǎng)，該方法具體按如下步驟進(jìn)行:
[0013](I)配置海藻酸鈉溶液I和氯化鈣溶液I，配置海藻酸鈉溶液I和氯化鈣溶液I過程中，可采用磁力攪拌機(jī)攪拌均勻；
[0014](2)將海藻酸鈉溶液I和氯化鈣溶液I分別通入島型打印噴頭的不同通道對(duì)應(yīng)的注射器內(nèi)；
[0015]所述島型打印噴頭包括:兩個(gè)或兩個(gè)以上的內(nèi)孔，內(nèi)孔的數(shù)量和結(jié)構(gòu)與通道的數(shù)量和結(jié)構(gòu)相匹配；包圍在內(nèi)孔外圍的外孔；與內(nèi)孔分別連通的內(nèi)通道；與外孔連通的外通道；所述內(nèi)通道和外通道分別與各自的注射器連接，其中與內(nèi)通道連通的注射器中充注氯化鈣溶液I，與外通道連通的注射器中充注海藻酸鈉溶液I;
[0016](3)配置基體材料；
[0017]若基底材料選擇海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液交聯(lián)產(chǎn)物，則配置過程如下:
[0018]配置另一組一定濃度的海藻酸鈉溶液II，利用磁力攪拌機(jī)攪拌均勻；
[0019]若基體材料選擇聚二甲基硅氧烷(PDMS)，則配置過程如下:將聚二甲基硅氧烷與現(xiàn)有技術(shù)中與其配套的固化劑按照一定的比例混合均勻，聚二甲基硅氧烷與固化劑的質(zhì)量比為8-15:1，作為優(yōu)選，質(zhì)量比為10:1。
[0020](4)將步驟(3)配置的基體材料倒入運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的容器中，同時(shí)保證基體材料在容器中分布均勻且具有平坦的表面，形成第一層基體材料層；該步驟中，可利用臥式振動(dòng)器使海藻酸鈉在容器中分布均勻且具有平坦的表面；
[0021](5)利用步驟(2)中的打印噴頭在第一層基體材料層上按照預(yù)定軌跡打印纖維培養(yǎng)體實(shí)體，其中纖維培養(yǎng)體實(shí)體外周打印海藻酸鈉溶液I，纖維培養(yǎng)體實(shí)體內(nèi)部打印用于形成兩個(gè)或兩個(gè)以上用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道的氯化鈣溶液I;該步驟打印過程中，可利用移動(dòng)運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度，使形成的多條通道以一定的軌跡沉積在步驟(4)中第一層基體材料層的表面；
[0022](6)將步驟(3)配置的基體材料繼續(xù)倒入容器中，覆蓋形成的纖維培養(yǎng)體實(shí)體上；該步驟中，可利用臥式振動(dòng)器使第二層基體材料層在容器中分布均勻且具有平坦的表面；
[0023](7)對(duì)步驟(6)得到的具有纖維培養(yǎng)體結(jié)構(gòu)的芯片初品進(jìn)行固化處理，得到多細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
[0024]固化處理根據(jù)基體材料不同可分別選擇:
[0025]當(dāng)基底材料選擇海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液交聯(lián)產(chǎn)物時(shí)，可配置可與海藻酸鈉溶液II發(fā)生交聯(lián)作用的氯化鈣溶液II;通過噴涂氯化鈣溶液II即可實(shí)現(xiàn)基體材料固化過程；該固化過程中，一般采用先將氯化鈣溶液II噴涂在(6)得到的具有纖維培養(yǎng)體結(jié)構(gòu)的芯片初品上，使表面的海藻酸鈉交聯(lián)成凝膠，實(shí)現(xiàn)預(yù)固化；然后將整個(gè)預(yù)固化的芯片初品浸入配置好的氯化鈣溶液II中，使整個(gè)結(jié)構(gòu)完全交聯(lián)成具有一定強(qiáng)度的凝膠結(jié)構(gòu)，最終得到含有多個(gè)通道的凝膠芯片；
[0026]當(dāng)基底材料選擇聚二甲基硅氧烷(PDMS)時(shí)，固化方法如下:將含有纖維培養(yǎng)體結(jié)構(gòu)的芯片放入烘箱內(nèi)，溫度設(shè)置為65-85°C，固化時(shí)間為60-80分鐘。
[0027]步驟(I)中的海藻酸鈉溶液I的濃度取決于所需要制備的多個(gè)通道的強(qiáng)度和與孔隙率。海藻酸鈉溶液I的濃度太低，形成的多個(gè)通道的強(qiáng)度太小，凝膠孔隙率太大；海藻酸鈉溶液I的濃度太高，形成的復(fù)合中空凝膠強(qiáng)度太大，凝膠孔隙率太小，且海藻酸鈉粘度太大，不利用噴頭噴射。作為優(yōu)選，利用去離子水作為溶劑，配置海藻酸鈉溶液I的質(zhì)量百分比濃度為1% _3%，這樣形成的多條通道的強(qiáng)度適中且孔隙率滿足通透性要求。
[0028]步驟(I)中的氯化鈣溶液I的濃度取決于所需要制備的多條通道的外徑與壁厚。氯化鈣溶液I的濃度太低，形成的多個(gè)通道的外徑和壁厚太小；氯化鈣溶液I的濃度太高，形成的多個(gè)通道的外徑和壁厚太大。作為優(yōu)選，利用去離子水作為溶劑，配置氯化鈣溶液I的質(zhì)量百分比濃度為2% _5%，這樣形成的多個(gè)通道的外徑和壁厚適中，有利于細(xì)胞與細(xì)胞間的交流。
[0029]步驟(2)中所使用的注射器一般與注射泵相連，注射泵為自主制造的三通道注射泵，可以分別控制每個(gè)通道的流速。利用三個(gè)減速電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化為三個(gè)絲杠的直線運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)注射器的勻速運(yùn)動(dòng)，通過相應(yīng)的控制程序分別控制電機(jī)的轉(zhuǎn)速來實(shí)現(xiàn)速度可調(diào)。與噴頭外孔相連的含有海藻酸鈉溶液的注射器、與島型噴頭內(nèi)孔的多個(gè)注射器均放置在此三通道注射泵上。
[0030]步驟(3)中另一組海藻酸鈉溶液II和氯化鈣溶液II是為了形成包覆多個(gè)通道的凝膠基體的，所以濃度相對(duì)大些，以滿足強(qiáng)度要求。作為優(yōu)選，利用去離子水作為溶劑，配置海藻酸鈉溶液II的質(zhì)量百分比濃度為3% _5%，配置氯化鈣溶液II的質(zhì)量百分比濃度為5% -8%。
[0031]基體材料采用海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物時(shí)，步驟(4)和步驟￠)中兩層海藻酸鈉的高度要能合理的包覆多個(gè)通道且要易于后續(xù)的交聯(lián)。作為優(yōu)選，兩層海藻酸鈉的高度分別為3-5mm。
[0032]步驟(5)中得到多個(gè)通道的原理為:由噴頭外孔流出的海藻酸鈉溶液與噴頭內(nèi)孔流出的氯化鈣溶液接觸，表面先發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成一層海藻酸鈣凝膠，這層海藻酸鈣凝膠使海藻酸鈉和氯化鈣溶液分離在兩側(cè)，由于形成的凝膠層的孔隙很小，只能允許鈣離子通過，不允許海藻酸離子通過，所以內(nèi)層的鈣離子穿過凝膠層與外面的海藻酸鈉繼續(xù)反應(yīng)，直到鈣離子完全反應(yīng)，最終形成外部實(shí)心部分為海藻酸鈣凝膠，內(nèi)部中空部分為水溶液的中空纖維結(jié)構(gòu)。
[0033]步驟(5)中由注射泵控制的與噴頭外孔、內(nèi)孔相連的液體的流動(dòng)速度要滿足所形成的中空纖維結(jié)構(gòu)交聯(lián)均勻，強(qiáng)度較好。最為優(yōu)選，與噴頭外孔相連的海藻酸鈉溶液I的流速為0.5-2ml/min，與多個(gè)噴頭內(nèi)孔相連的氯化鈣溶液流速保持相同，為l_5ml/min。
[0034]步驟(5)中運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的速度要與溶液的流速匹配，以形成均勻的直線。作為優(yōu)選，運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的速度為1000-1600mm/min。
[0035]步驟(5)中形成的纖維培養(yǎng)體沉積在步驟(5)中海藻酸鈉表面的運(yùn)動(dòng)軌跡可以為任意形狀。最為優(yōu)選，運(yùn)動(dòng)軌跡為S形。
[0036]以兩通道培養(yǎng)模型為例，本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型實(shí)際使用時(shí):
[0037](i)分別將含有細(xì)胞A和細(xì)胞B的培養(yǎng)液注射到纖維培養(yǎng)體的兩個(gè)相鄰的通道內(nèi)，靜置一段時(shí)間后便得到細(xì)胞A與細(xì)胞B共培養(yǎng)模型；
[0038](ii)將細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)灌入纖維培養(yǎng)體的通道內(nèi)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)。
[0039]步驟(i)中，纖維培養(yǎng)體的兩個(gè)相鄰的通道內(nèi)種植細(xì)胞A和細(xì)胞B，可以直接用注射器注射含有細(xì)胞A和細(xì)胞B的培養(yǎng)液，也可以用注射泵注射。作為優(yōu)選，選擇注射泵的方式種植細(xì)胞，只需使用本發(fā)明中的三通道注射泵中的兩個(gè)通道即可，流速為2-5ml/min，這樣細(xì)胞在通道內(nèi)分布均勻，易于控制。
[0040]步驟(i)中，靜置一段時(shí)間的目的是為了使細(xì)胞完全貼壁。作為優(yōu)選，靜置時(shí)間為10-16小時(shí)。
[0041]步驟(ii)中將細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)灌入纖維培養(yǎng)體的通道內(nèi)，可以采用非循環(huán)和循環(huán)兩種通液方式。作為優(yōu)選，選用循環(huán)通液方式，利用雙通道蠕動(dòng)泵連續(xù)循環(huán)地向纖維培養(yǎng)體的兩個(gè)通道內(nèi)灌入細(xì)胞培養(yǎng)液，這樣，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的分泌物不會(huì)流失，形成一個(gè)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。
[0042]采用本發(fā)明的方法，如果要得到兩種以上的細(xì)胞共培養(yǎng)模型，只需增加噴頭內(nèi)孔的數(shù)量及相應(yīng)的供液及控制裝置即可。
[0043]本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0044](I)本發(fā)明可以建立兩種及兩種以上的細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)體系。
[0045](2)本發(fā)明的共培養(yǎng)體系呈多室平行結(jié)構(gòu)，能在倒置顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞的情況，可同時(shí)收集多室的細(xì)胞進(jìn)行定量學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。
[0046](3)本發(fā)明可以將細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)灌入纖維培養(yǎng)體的通道內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)。
[0047](4)本發(fā)明細(xì)胞共培養(yǎng)模型制作工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高。
[0048](5)本發(fā)明利用生物兼容性凝膠材料作為細(xì)胞與細(xì)胞間的隔膜，材料獲取容易，避免使用昂貴材料和工藝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為本發(fā)明的一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0050]圖2為圖1所示細(xì)胞共培養(yǎng)模型的剖面俯視圖。
[0051]圖3為圖2所示細(xì)胞共培養(yǎng)模型的A-A剖視示意圖。
[0052]圖4為本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型使用狀態(tài)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0053]圖5為本發(fā)明的細(xì)胞共培養(yǎng)模型用于三種細(xì)胞共培養(yǎng)的剖視結(jié)構(gòu)圖。
[0054]圖6為本發(fā)明所需要的打印裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
[0055]圖7為本發(fā)明所需要的島型噴頭的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0056]圖8為圖7所示島型噴頭B-B剖視示意圖。
[0057]上述附圖中:I為纖維培養(yǎng)體，2為包覆纖維培養(yǎng)體的凝膠基體，3為成骨細(xì)胞，4為破骨細(xì)胞，5為盛放含成骨細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)液罐，6為盛放破骨細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)液罐，7為雙通道螺動(dòng)栗，8為細(xì)胞C，9為島型嗔頭，10為二通道注射栗，11為運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，12為島型嗔頭的外孔，13為島型噴頭的內(nèi)孔，14為島型噴頭的內(nèi)孔，15為內(nèi)通道，16為外通道，17為細(xì)胞A，18為細(xì)胞B。

【具體實(shí)施方式】
[0058]實(shí)施例1
[0059]如圖1-圖3本發(fā)明的基于凝膠芯片的細(xì)胞共培養(yǎng)模型具體的技術(shù)方案如下:
[0060]一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括凝膠基體2，凝膠基體2內(nèi)構(gòu)建有兩端伸出凝膠基體2外壁的纖維培養(yǎng)體1，纖維培養(yǎng)體I為中空纖維結(jié)構(gòu)，該纖維培養(yǎng)體I由凝膠材質(zhì)構(gòu)成；纖維培養(yǎng)體I內(nèi)設(shè)有兩個(gè)用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道la，各通道Ia之間相互獨(dú)立，每個(gè)通道Ia具有分別位于纖維培養(yǎng)體I兩端的入口 Ib和出口 Ic ;凝膠材質(zhì)為海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物；通道Ia呈迂回狀布置在凝膠基體2內(nèi)。
[0061]該模型由生物兼容性凝膠材料制造成的中空纖維結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞的載體，將細(xì)胞種植在相鄰的中空凝膠纖維通道Ia內(nèi)，利用凝膠的通透性，將不同類型的細(xì)胞分隔開進(jìn)行培養(yǎng)；該模型由生物兼容性材料制造包覆中空纖維結(jié)構(gòu)的凝膠基體，利用凝膠基體具有一定的強(qiáng)度，將共培養(yǎng)模型構(gòu)建在一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境中。
[0062]纖維培養(yǎng)體I的實(shí)心部分為交聯(lián)后的具有一定強(qiáng)度的水凝膠，這種水凝膠具有通透性，分子可以透過凝膠間壁進(jìn)行交換。其空心部分為含有目標(biāo)細(xì)胞的培養(yǎng)液，利用細(xì)胞的貼壁性，共培養(yǎng)的細(xì)胞貼附在中空凝膠纖維的內(nèi)壁上。
[0063]結(jié)合附圖，通過具體實(shí)施例描述上述基于凝膠芯片的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。本實(shí)施例為制造兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，兩種細(xì)胞采用成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，觀察在此共培養(yǎng)模型中兩種細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，探討成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的相互作用。詳細(xì)過程如下:
[0064](I)制備質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液:按比例將生化級(jí)海藻酸鈉粉末和去離子水混合，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，混合均勻，并進(jìn)行滅菌處理；
[0065](2)制備濃度為2%的氯化鈣溶液:按比例將氯化鈣粉末與去離子水混合，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，混合均勻，并進(jìn)行滅菌處理；
[0066](3)將步驟(I)中配置好的2%的海藻酸鈉溶液倒入與島型噴頭外孔12相連的注射器中，并將注射器放置在三通道注射泵10上；
[0067](4)將步驟(2)中配置好的2%的氯化鈣溶液分別倒入與島型噴頭內(nèi)孔13、內(nèi)孔14相連的注射器中，并將注射器放置在三通道注射泵10上；
[0068]島型噴頭的結(jié)構(gòu)如圖7和圖8，包括兩個(gè)內(nèi)孔，分別是內(nèi)孔13、內(nèi)孔14 ;包圍在內(nèi)孔13和內(nèi)孔14外圍的外孔12 ;與內(nèi)孔13、內(nèi)孔14連通的內(nèi)通道15 ;與外孔連12通的外通道16 ;內(nèi)通道15和外通道16分別與各自的注射器連接，其中與內(nèi)通道連通的注射器中充注步驟(2)中配置好的2%的氯化鈣溶液，與外通道連通的注射器中充注步驟(I)中配置好的2%的海藻酸鈉溶液。
[0069](5)制備質(zhì)量濃度為4%的海藻酸鈉溶液:按比例將生化級(jí)海藻酸鈉粉末和去離子水混合，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，混合均勻，并進(jìn)行滅菌處理；
[0070](6)制備濃度為4%的氯化鈣溶液:按比例將氯化鈣粉末與去離子水混合，用磁力攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，混合均勻，并進(jìn)行滅菌處理；
[0071](7)為了形成包覆中空纖維結(jié)構(gòu)的凝膠基體2，將步驟(5)中配置好的4%的海藻酸鈉溶液倒入培養(yǎng)皿中，利用臥式振動(dòng)器使海藻酸鈉在培養(yǎng)皿中分布均勻且具有平坦的表面，形成第一層高度為4mm的海藻酸鈉溶液。
[0072](8)如圖6所示，利用基于島型噴頭9的打印裝置制造中空纖維結(jié)構(gòu)的纖維培養(yǎng)體I及將纖維培養(yǎng)體I包覆在凝膠中:首先利用三通道注射泵10控制島型噴頭9的外孔12、內(nèi)孔13和內(nèi)孔14的液體的流動(dòng)速度，均設(shè)置為lml/min，得到中空纖維結(jié)構(gòu)，其次利用運(yùn)動(dòng)平臺(tái)11，調(diào)節(jié)平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)速度為1200mm/min,使形成的纖維培養(yǎng)體I以S形軌跡沉積在步驟(7)中海藻酸鈉的表面；
[0073](9)將步驟(5)中配置好的4%海藻酸鈉溶液繼續(xù)倒入培養(yǎng)皿中，覆蓋在形成的纖維培養(yǎng)體結(jié)構(gòu)上，形成第二層高度為4_的海藻酸鈉溶液，并用臥式振動(dòng)器使第二層海藻酸鈉在培養(yǎng)皿中分布均勻且具有平坦的表面；
[0074](10)將步驟(6)中配置好的4%氯化鈣溶液噴射到步驟(9)中的培養(yǎng)皿中，使表面的海藻酸鈉交聯(lián)成凝膠；
[0075](11)將整個(gè)結(jié)構(gòu)浸入到步驟(6)配置好的4%的氯化鈣溶液中，使整個(gè)結(jié)構(gòu)完全交聯(lián)成具有一定強(qiáng)度的凝膠結(jié)構(gòu)，最終得到含有中空纖維結(jié)構(gòu)的凝膠芯片。
[0076](12)利用步驟(3)中的三通道注射泵(只需要兩個(gè)通道)分別將含有成骨細(xì)胞3和破骨細(xì)胞4的培養(yǎng)液注射到凝膠芯片的兩個(gè)相鄰的通道內(nèi)，注射速度為4ml/min，靜置12小時(shí)后細(xì)胞完全貼壁，最終得到基于凝膠芯片的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，如圖3所示。
[0077](13)如圖4所示，用雙通道蠕動(dòng)泵7連續(xù)循環(huán)地向凝膠芯片的兩個(gè)通道內(nèi)灌入成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，得到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)，其中含成骨細(xì)胞培養(yǎng)液盛放在儲(chǔ)液罐5中，含破骨細(xì)胞培養(yǎng)液盛放儲(chǔ)液罐6內(nèi)。
[0078]運(yùn)用本發(fā)明的基于凝膠芯片的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型，在倒置顯微鏡下觀察，可明顯觀測(cè)到兩種細(xì)胞在形態(tài)上的差異，并且在這種培養(yǎng)條件下兩種細(xì)胞均能增殖生長(zhǎng)，這為研究成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的相互作用提供了基礎(chǔ)。
[0079]實(shí)施例2
[0080]如圖5所示，也可采用本發(fā)明的方法制備具有三個(gè)通道的共培養(yǎng)模型，其中一個(gè)通道負(fù)載有細(xì)胞A17、一個(gè)通道負(fù)載有細(xì)胞B18、一個(gè)通道負(fù)載有細(xì)胞C8，即可構(gòu)成三種細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，加工三種細(xì)胞共培養(yǎng)的模型時(shí)，采用的島型噴頭結(jié)構(gòu)與圖7中所示噴頭結(jié)構(gòu)類似，不同之處在于內(nèi)孔和內(nèi)通道的數(shù)量均為3個(gè)，其余結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，包括基體(2)，其特征在于，所述基體(2)內(nèi)構(gòu)建有兩端伸出基體(2)外壁的纖維培養(yǎng)體(I)，該纖維培養(yǎng)體(I)由凝膠材質(zhì)構(gòu)成；所述纖維培養(yǎng)體(I)內(nèi)設(shè)有兩個(gè)或兩個(gè)以上用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道(Ia)，各通道之間相互獨(dú)立，每個(gè)通道(Ia)具有分別位于纖維培養(yǎng)體(I)兩端的入口(Ib)和出口(Ic);所述凝膠材質(zhì)為海藻酸鈉和氯化鈣的交聯(lián)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于，所述基體(2)由凝膠材質(zhì)構(gòu)成、或者由聚二甲基硅氧烷構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型，其特征在于，所述纖維培養(yǎng)體(I)呈迂回狀布置。
4.一種細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，包括: (1)配置海藻酸鈉溶液I和氯化鈣溶液I; (2)將海藻酸鈉溶液I和氯化鈣溶液I分別通入與島型打印噴頭的不同通道相應(yīng)的注射器內(nèi)； (3)配置基體材料； (4)將步驟(3)配置的基體材料倒入運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的容器中，同時(shí)保證基體材料在容器中分布均勻且具有平坦的表面，形成第一層基體材料層； (5)利用步驟(2)中的島型打印噴頭在第一層基體材料層上按照預(yù)定軌跡打印纖維培養(yǎng)體實(shí)體，其中纖維培養(yǎng)體實(shí)體外周打印海藻酸鈉溶液I，纖維培養(yǎng)體實(shí)體內(nèi)部打印用于形成兩個(gè)或兩個(gè)以上用于細(xì)胞共培養(yǎng)的通道的氯化鈣溶液I ; (6)將步驟(3)配置的基體材料繼續(xù)倒入容器中，覆蓋形成的纖維培養(yǎng)體實(shí)體上； (7)對(duì)步驟(6)得到的具有纖維培養(yǎng)體結(jié)構(gòu)的芯片進(jìn)行固化處理，得到多細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液I的質(zhì)量百分比濃度為1% -3% ;所述氯化鈣溶液I的質(zhì)量百分比濃度為2% -5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述基體材料為凝膠、聚二甲基硅氧烷，當(dāng)基體材料為凝膠時(shí)，所述凝膠為海藻酸鈉溶液II和氯化鈣溶液II的交聯(lián)產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液II的質(zhì)量百分比濃度為3^-5% ;所述氯化鈣溶液II的質(zhì)量百分比濃度為
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述島型打印噴頭包括: 兩個(gè)或兩個(gè)以上的內(nèi)孔，內(nèi)孔的數(shù)量和結(jié)構(gòu)與通道的數(shù)量和結(jié)構(gòu)相匹配； 包圍在內(nèi)孔外圍的外孔； 與內(nèi)孔分別連通的內(nèi)通道； 與外孔連通的外通道； 所述內(nèi)通道和外通道分別與各自的注射器連接，其中與內(nèi)通道連通的注射器中充注氯化鈣溶液I，與外通道連通的注射器中充注海藻酸鈉溶液I。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述外孔處海藻酸鈉溶液I的流速為0.5-2ml/min ;所述內(nèi)孔處氯化鈣溶液I的流速為l_5ml/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞共培養(yǎng)模型的制備方法，其特征在于，所述運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的移動(dòng)速度為 1000-1600mm/min。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK104232484SQ201410461035
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】賀永, 高慶, 傅建中, 劉安 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)