一種氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，旨在提供一種快捷、簡便，圖像結(jié)果優(yōu)質(zhì)凝膠電泳分型方法；其技術(shù)方案：將采集分離到的氣單胞菌在TSA平板上、37℃條件下培養(yǎng)14-18小時(shí)，用無菌接種環(huán)刮取單菌落于CSB緩沖液中，制成5-6Mcf的細(xì)菌懸濁液；配制凝膠溶液；取細(xì)菌懸濁液于離心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混勻后再加入凝膠溶液，得到混合溶液；將得到的混合溶液注入成膠模具，在室溫下凝固30分鐘，得到膠塊；制備消化液，將步驟得到的膠塊放入步驟的消化液中，消化裂解；洗膠塊；膠塊內(nèi)DNA酶切；加樣；電泳；獲取圖像分析。
【專利說明】一種氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種脈沖場凝膠電泳分型方法，尤其是一種氣單胞菌脈沖場凝膠電泳 分型方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氣單胞菌是屬于氣單胞菌科的革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，可從水源、土 壤以及人的糞便中分離。其可引起蛙的紅腿病，鱉的紅脖子病，鮭鱒魚類的癤瘡病以及在水 產(chǎn)養(yǎng)殖史上造成重大經(jīng)濟(jì)損失的淡水魚類細(xì)菌性敗血癥，并且氣單胞菌還可引起牛猝死及 人的肺部嚴(yán)重感染，是一種典型的人-獸-魚共患致病菌。對(duì)于共患致病菌需要通過分型 的方法對(duì)致病菌的來源進(jìn)行追蹤和分析。
[0003] 對(duì)細(xì)菌分型的方法主要包括基于表型特征的表型分型方法和基于基因特征的基 因分型方法。由于細(xì)菌易受環(huán)境影響，表型性狀表達(dá)呈不確定性，基于基因水平的分子分型 方法，較之更為穩(wěn)定和可信。目前常用的基因分型方法包括：隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、腸道細(xì)菌重復(fù)基因間共有序列 PCR(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence PCR，ERIC_PCR)、脈沖場凝膠電泳（PFGE)、 質(zhì)粒分型等.基于PCR技術(shù)的RAPD，RFLP，ERIC-PCR雖然具有快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，但檢測的均 為染色體中的某些片段，并且重復(fù)性較差。質(zhì)粒分型針對(duì)的對(duì)象為質(zhì)粒，而質(zhì)粒相對(duì)于染色 體更容易獲得或缺失，穩(wěn)定性差。脈沖場凝膠電泳是基于整個(gè)細(xì)菌基因組的分型技術(shù)，具有 穩(wěn)定性好，分辨率高的特點(diǎn)，被譽(yù)為分子分型的"金標(biāo)準(zhǔn)"。然而它也具有實(shí)驗(yàn)流程長，操作 繁瑣。。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述不足，本發(fā)明的前一個(gè)目的在于提供一種快捷、簡便，圖像結(jié)果優(yōu)質(zhì)的單 胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法。
[0005] 為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：該氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，依 次包括下述步驟：
[0006] 1)膠塊的制備
[0007] I. 1)將采集分離到的氣單胞菌在TSA平板上培養(yǎng)14-18小時(shí)，用無菌接種環(huán)刮取 單菌落于CSB緩沖液中，制成5-6Mcf的細(xì)菌懸濁液；
[0008] 1. 2)配制凝膠溶液；
[0009] 1. 3)取步驟I. 1)所述的細(xì)菌懸濁液于離心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混勻后再 加入步驟1. 2)中的凝膠溶液，吹打均勻，得到混合溶液；
[0010] 1. 4)將步驟1. 3)得到的混合溶液注入成膠模具，在室溫下凝固30分鐘，得到膠 塊；
[0011] 2)膠塊消化裂解
[0012] 2· 1)制備消化液，
[0013] 2. 2)將步驟I. 4)得到的膠塊放入步驟2. 1)的消化液中，蓋上濾篩蓋，消化裂解；
[0014] 3)洗膠塊
[0015] 4)膠塊內(nèi)DNA酶切：
[0016] 4. 1)將20 μ L的XbaI限制性內(nèi)切酶IOX緩沖液加入180 μ L的超純水中配成酶 切緩沖液；
[0017] 4. 2)將洗滌后膠塊切成大小為2mmX 4mm，放入裝有步驟1)酶切緩沖液的離心管 中并置于冰上30分鐘；
[0018] 4. 3)吸出步驟4. 2)中的酶切緩沖液，在離心管中加入已混勻的含有75UXbaI、 20μ L BSA、20y L XbaI限制性內(nèi)切酶IOX緩沖液和155μ L超純水的酶切液，在37°C水浴 鍋中孵化3小時(shí)；
[0019] 5)加樣
[0020] 6)電泳
[0021] 在電泳槽中加入TBE緩沖液，待電泳緩沖液恒定為12_15°C后，將步驟5)制好的膠 塊放于電泳槽中進(jìn)行電泳。
[0022] 7)獲取圖像分析。
[0023] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟1. 2)配制凝膠溶液的方法是用 TE緩沖液配制低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，使其濃度為2 %，并將凝膠溶液放置于54°C水浴中平衡 備用。
[0024] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟1. 3)的具體方法為：取95 μ L上 述細(xì)菌懸濁液于I. 5mL離心管中，加入5μ L20mg/ml的蛋白酶Κ，5μ 120% SDS，混勻后再加 入步驟1. 2)中的凝膠溶液95 μ L，吹打均勻。
[0025] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟2. 1)所述的制備消化酶的方法 是在裝有5ml TES緩沖液的50ml離心管中加入25 μ L20mg/ml的蛋白酶Κ，混合均勻，得到 消化液，置于冰上備用。
[0026] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟2. 2)所述的消化方法為在54°C、 175r/min的水浴搖床中消化3小時(shí)。；
[0027] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟3)所述的洗膠塊依次包括下述 步驟：
[0028] 3. 1)將超純水及TE緩沖液放置于水浴鍋中預(yù)熱至50°C備用；
[0029] 3. 2)將步驟2. 2)中消化完成的膠塊離心管取出，倒出管中消化液，倒入10_15ml 已預(yù)熱到50°C的超純水，使膠塊在液面以下，放回50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘，結(jié)束后 再見管內(nèi)超純水倒出，再倒入10-15ml50°C的超純水，50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘；
[0030] 3. 3)將步驟3. 2)水浴完成后離心管中的超純水倒出，加入10-15mL已預(yù)熱到 50°C的TE緩沖液，50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘；再重復(fù)此TE洗滌步驟3次；完成后，從 水浴鍋中取出離心管，冷卻至室溫。
[0031] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟5)所述的加樣依次包括下述步 驟：
[0032] 5. 1)將上述酶切完成的離心管從水浴鍋中取出，吸取酶切液，加入Iml TBE緩沖 液，確保膠塊處于液面下，置于冰上30min ;
[0033] 5. 2)用TBE緩沖液配制1 %的脈沖場瓊脂糖溶液，置于50-60°C恒溫箱中平衡15 分鐘；
[0034] 5. 3)將步驟5. 1)中的小膠塊取出置于電泳梳子齒底部，確保梳子上所有膠塊處 于一條直線，并用吸水紙吸取膠塊周圍液體；
[0035] 5.4)把加完樣的電泳梳子放入膠槽，使電泳梳子齒與膠槽底部距離為l_2mm，并 使整個(gè)制膠裝置處于水平位置；將平衡完成的脈沖場瓊脂糖溶液注入膠槽，避免氣泡產(chǎn)生， 室溫下凝固30分鐘；
[0036] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟6)所述的所述的電泳所設(shè)電泳 電壓為6V/cm，起始脈沖時(shí)間10s，終止脈沖時(shí)間35s，電場夾角120°，電泳時(shí)間22小時(shí)；
[0037] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，步驟7)所述的圖像獲取的方法依次 包括下述步驟：
[0038] 7. 1)電泳完成后，將膠塊從電泳槽中取出，放入裝有0. 5 μ g/ml EB溶液的避光盒 子中，使溶液沒過膠塊而，并將盒子放置搖床中振蕩30分鐘，
[0039] 7. 2)步驟完成后，將盒子中的EB溶液換成同體積的純水，于搖床上振蕩脫色60分 鐘，期間換純水一次；
[0040] 7. 3)脫色完成后取出膠塊，吸去膠塊上多余水份，在凝膠成像系統(tǒng)下成像拍攝。
[0041] 上述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，所述的CSB緩沖液的組份為：100mM TrisUOOmM EDTA，pH 為 8.0。
[0042] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案從減少有毒試劑的使用，減少細(xì)菌懸濁 離心、溶菌酶作用的步驟，縮短蛋白酶K消化和限制性內(nèi)切酶消化的時(shí)間以及修改電泳參 數(shù)四方面使現(xiàn)有氣單胞菌PFGE方法得以優(yōu)化。
[0043] 表1已報(bào)道的氣單胞菌PFGE方法與本發(fā)明的技術(shù)方法對(duì)比
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，依次包括下述步驟： 1) 膠塊的制備 1. 1)將采集分離到的氣單胞菌在TSA平板上培養(yǎng)14-18小時(shí)，用無菌接種環(huán)刮取單菌 落于CSB緩沖液中，制成5-6Mcf的細(xì)菌懸濁液； 1. 2)配制凝膠溶液； 1. 3)取步驟1. 1)所述的細(xì)菌懸濁液于離心管中，加入的蛋白酶K，SDS，混勻后再加入 步驟1. 2)中的凝膠溶液，吹打均勻，得到混合溶液； 1. 4)將步驟1. 3)得到的混合溶液注入成膠模具，在室溫下凝固30分鐘，得到膠塊； 2) 膠塊消化裂解 2. 1)制備消化液， 2.2)將步驟1.4)得到的膠塊放入步驟2.1)的消化液中，蓋上濾篩蓋，消化裂解； 3) 洗膠塊 4) 膠塊內(nèi)DNA酶切： 4. 1)將20 μ L的Xbal限制性內(nèi)切酶10 X緩沖液加入180 μ L的超純水中配成酶切緩 沖液； 4. 2)將洗滌后膠塊切成大小為2mmX4mm，放入裝有步驟1)酶切緩沖液的離心管中并 置于冰上30分鐘； 4. 3)吸出步驟4. 2)中的酶切緩沖液，在離心管中加入已混勻的含有75U XbaI、20yL BSA、20 μ L Xbal限制性內(nèi)切酶10X緩沖液和155 μ L超純水的酶切液，在37°C水浴鍋中孵 化3小時(shí)； 5) 加樣 6) 電泳 在電泳槽中加入TBE緩沖液，待電泳緩沖液恒定為12-15°C后，將步驟5)制好的膠塊放 于電泳槽中進(jìn)行電泳。 7) 獲取圖像分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟1. 2) 配制凝膠溶液的方法是用TE緩沖液配制低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，使其濃度為2%，并將凝膠溶 液放置于54°C水浴中平衡備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟1. 3) 的具體方法為：取95 μ L上述細(xì)菌懸濁液于1. 5mL離心管中，加入5 μ L20mg/ml的蛋白酶K， 5 μ 120% SDS，混勻后再加入步驟1. 2)中的凝膠溶液95 μ L，吹打均勻。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟2. 1) 所述的制備消化酶的方法是在裝有5ml TES緩沖液的50ml離心管中加入25 μ L20mg/ml的 蛋白酶K，混合均勻，得到消化液，置于冰上備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟2. 2) 所述的消化方法為在54°C、175r/min的水浴搖床中消化3小時(shí)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟3)所 述的洗膠塊依次包括下述步驟： 3. 1)將超純水及TE緩沖液放置于水浴鍋中預(yù)熱至50°C備用； 3.2) 將步驟2. 2)中消化完成的膠塊離心管取出，倒出管中消化液，倒入10-15ml已預(yù) 熱到50°C的超純水，使膠塊在液面以下，放回50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘，結(jié)束后再見 管內(nèi)超純水倒出，再倒入10-15ml50°C的超純水，50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘； 3. 3)將步驟3. 2)水浴完成后離心管中的超純水倒出，加入10-15mL已預(yù)熱到50°C的 TE緩沖液，50°C水浴搖床中搖洗10-15分鐘；再重復(fù)此TE洗滌步驟3次；完成后，從水浴鍋 中取出離心管，冷卻至室溫。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟5)所 述的加樣依次包括下述步驟： 5.1) 將上述酶切完成的離心管從水浴鍋中取出，吸取酶切液，加入lml TBE緩沖液，確 保膠塊處于液面下，置于冰上30min ; 5. 2)用TBE緩沖液配制1 %的脈沖場瓊脂糖溶液，置于50-60°C恒溫箱中平衡15分鐘； 5.3) 將步驟5.1)中的小膠塊取出置于電泳梳子齒底部，確保梳子上所有膠塊處于一 條直線，并用吸水紙吸取膠塊周圍液體； 5.4) 把加完樣的電泳梳子放入膠槽，使電泳梳子齒與膠槽底部距離為l-2mm，并使整 個(gè)制膠裝置處于水平位置；將平衡完成的脈沖場瓊脂糖溶液注入膠槽，避免氣泡產(chǎn)生，室溫 下凝固30分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟6)所 述的所述的電泳所設(shè)電泳電壓為6V/cm，起始脈沖時(shí)間10s，終止脈沖時(shí)間35s，電場夾角 120°，電泳時(shí)間22小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，步驟7)所 述的圖像獲取的方法依次包括下述步驟： 7.1) 電泳完成后，將膠塊從電泳槽中取出，放入裝有O^yg/ml EB溶液的避光盒子 中，使溶液沒過膠塊而，并將盒子放置搖床中振蕩30分鐘， 7. 2)步驟完成后，將盒子中的EB溶液換成同體積的純水，于搖床上振蕩脫色60分鐘， 期間換純水一次； 7. 3)脫色完成后取出膠塊，吸去膠塊上多余水份，在凝膠成像系統(tǒng)下成像拍攝。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，所述的 CSB 緩沖液的組份為：100mM Tris、100mM EDTA，pH 為 8. 0。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263817SQ201410436478
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】鄧玉婷, 黃玉萍, 姜蘭, 譚愛萍, 王偉利, 羅理, 梁愛玲 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所