一種提高異養(yǎng)下微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法
【專利摘要】一種提高微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法，所述方法包括以下步驟：a.將微藻在自養(yǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠藻種；b.將步驟a所述藻種接種到磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)基中；c.進(jìn)行磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)。
【專利說明】一種提高異養(yǎng)下微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種提高異養(yǎng)下微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物柴油即脂肪酸甲酯，是一種生物質(zhì)能源，具有可再生的特點(diǎn)。它主要來源于產(chǎn) 油作物，如大豆、葵花籽等，但產(chǎn)量低、成本高、與其他農(nóng)作物爭奪土地等缺點(diǎn)限制了其進(jìn)一 步發(fā)展。一部分微藻富含油脂，由于其生長周期短且無需占用耕地，成為生物柴油的新來 源。
[0003] 現(xiàn)今，關(guān)于微藻產(chǎn)油的研究多數(shù)是米用光自養(yǎng)培養(yǎng)方式。但是由于光自養(yǎng)培養(yǎng)對 光的要求高，導(dǎo)致細(xì)胞密度低，而異養(yǎng)培養(yǎng)則可以克服這一缺點(diǎn)。異養(yǎng)培養(yǎng)無需光照，只需 要添加葡萄糖等有機(jī)物作為碳源。目前異養(yǎng)微藻培養(yǎng)的研究主要是生產(chǎn)生物柴油、生產(chǎn)健 康食品和處理廢水。
[0004] 其中異養(yǎng)在生產(chǎn)生物柴油這一方面有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)不受環(huán)境和氣候等條件的限 制；（2)生物量產(chǎn)率遠(yuǎn)高于自養(yǎng)，可獲得極高的細(xì)胞濃度；(3)脂肪酸含量高于自養(yǎng)培養(yǎng)；
[4] 相比較于自養(yǎng)培養(yǎng)，異養(yǎng)培養(yǎng)的藻細(xì)胞脂肪酸組成更適用于生產(chǎn)生物柴油。
[0005] 在進(jìn)一步提高微藻脂肪酸含量方面，氮缺乏是被采用最多的方法之一。但是氮缺 乏在提高脂肪酸含量的同時(shí)也會導(dǎo)致生物量產(chǎn)率的下降，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪酸產(chǎn)率提高甚微甚 至下降。因此需要探索其他可應(yīng)用在異養(yǎng)條件下提高微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微藻脂肪酸產(chǎn)率不高的技術(shù)難題，本發(fā)明的目的是提供一種 提高異養(yǎng)下脂肪酸產(chǎn)率的微藻方法。
[0007] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種提高微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0008] a.將微藻在自養(yǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠藻種；
[0009] b.將步驟a所述藻種接種到磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)基中；
[0010] c.進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻為綠藻門小球藻屬（Chlorella)。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻為普通小球藻（Chlorella vulgaris)。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻自養(yǎng)培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基為添加了葡萄糖的BG-11培養(yǎng)基，其中 磷的濃度為〇毫克每升至5毫克每升，優(yōu)選1毫克每升至4毫克每升，再優(yōu)選2毫克每升至 3. 5毫克每升，最優(yōu)選3毫克每升。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b的接種比例為1 : 6至1 : 10,優(yōu)選1 : 7至1 : 9， 最優(yōu)選1 : 8。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下各項(xiàng)中的一種或多種：葡萄糖、 NaN03、K2HP04 · 3H20、MgS04 · 7H20、Na2C03、CaCl2、一水合檸檬酸、檸檬酸鐵銨、Na 2EDTA、H3B03、 MnCl2 · 4H20、ZnS04 · 7H20、CuS04 · 5H20、CoCl2 · 6H20 和 Na2Mo04 · 2H20 等。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，葡萄糖的含量為：0g/L至10g/L，優(yōu)選2g/L至10g/L，再優(yōu)選 4g/L 至 10g/L，最優(yōu)選 10g/L。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，NaN03的含量為：0mg/L至1500mg/L。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Κ2ΗΡ04·3Η20的含量為：0mg/L至50mg/L，優(yōu)選20mg/L至50mg/ L，再優(yōu)選 30mg/L 至 40mg/L，最優(yōu)選 37mg/L。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，MgS04 ·7Η20的含量為：60mg/L至90mg/L，優(yōu)選65mg/L至85mg/ L，再優(yōu)選 60mg/L 至 80mg/L，最優(yōu)選 75mg/L。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Na2C03的含量為：10mg/L至30mg/L，優(yōu)選15mg/L至25mg/L, 再優(yōu)選18mg/L至22mg/L,最優(yōu)選20mg/L。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，CaCl2的含量為：20mg/L至40mg/L,優(yōu)選20mg/L至30mg/L,再 優(yōu)選 25mg/L 至 30mg/L，最優(yōu)選 27mg/L。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一水合檸檬酸的含量為：3mg/L至10mg/L，優(yōu)選5mg/L至 10mg/L，再優(yōu)選 5mg/L 至 8mg/L，最優(yōu)選 6mg/L。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，朽1檬酸鐵銨的含量為：3mg/L至10mg/L，優(yōu)選5mg/L至10mg/ L，再優(yōu)選5mg/L至8mg/L，最優(yōu)選6mg/L。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Na2EDTA的含量為：0mg/L至2. 0mg/L，優(yōu)選0. 5mg/L至2. Omg/ L，再優(yōu)選 0· 5mg/L 至 1. 5mg/L，最優(yōu)選 lmg/L。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Η3Β03的含量為：0μ g/L至5μ g/L，優(yōu)選2μ g/L至4μ g/L，再 優(yōu)選 2· 5 μ g/L 至 3· 0 μ g/L，最優(yōu)選 2· 86 μ g/L。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中^11(：12*4!120的含量為：14 8/1至3 4 8/1，優(yōu)選14 8/1至2 48/ L，再優(yōu)選 5 μ g/L 至 2 μ g/L，最優(yōu)選 L 81 μ g/L。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，ZnS04 · 7Η20的含量為：0· 1 μ g/L至0· 5 μ g/L，優(yōu)選0· 1 μ g/L 至 0· 4 μ g/L，再優(yōu)選 0· 20 μ g/L 至 0· 25 μ g/L，最優(yōu)選 0· 222 μ g/L。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，CuS04 · 5H20的含量為：0. 05 μ g/L至0. 15 μ g/L，優(yōu)選 0· 05 μ g/L 至 0· 10 μ g/L，再優(yōu)選 0· 07 μ g/L 至 0· 09 μ g/L，最優(yōu)選 0· 079 μ g/L。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，CoCl2 · 6Η20的含量為：0. 03 μ g/L至0. 10 μ g/L，優(yōu)選 0· 03 μ g/L 至 0· 08 μ g/L，再優(yōu)選 0· 04 μ g/L 至 0· 06 μ g/L，最優(yōu)選 0· 050 μ g/L。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Na2Mo04 ·2Η20的含量為：0. 2 μ g/L至0. 6 μ g/L，優(yōu)選0. 2 μ g/ L 至 0· 5 μ g/L，再優(yōu)選 0· 3 μ g/L 至 0· 5 μ g/L，最優(yōu)選 0· 39 μ g/L。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c的培養(yǎng)條件包括：22至26攝氏度的溫度，優(yōu)選23至25 攝氏度，最優(yōu)選24攝氏度。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c的培養(yǎng)條件包括：6. 0至8. 0的pH值，優(yōu)選6. 5至7. 5， 再優(yōu)選6. 8至7. 2,最優(yōu)選7. 0的pH值。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將異養(yǎng)培養(yǎng)中的微藻細(xì)胞冷凍干燥成藻粉， 用于提取胞內(nèi)活性物質(zhì)。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間為3至25天，優(yōu)選4至20天，再優(yōu) 選5至15天，再優(yōu)選6至10天，再優(yōu)選7至9天，再優(yōu)選8天。
[0036] 相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0037] (1)經(jīng)過八天磷限制下的異養(yǎng)培養(yǎng)，微藻脂肪酸甲酯含量（脂肪酸甲酯g/細(xì)胞干 重g)大大提高。有氮條件下，脂肪酸含量從14%提高到44%，。缺氮條件下脂肪酸含量從 14%提高到87%。
[0038] (2)生物量產(chǎn)率相比較于磷充足條件幾乎無下降。
[0039] (3)相比較于磷充足條件下，脂肪酸產(chǎn)率增加。有氮條件下提高了 48%，缺氮條件 下提商了 9%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1實(shí)施例1生物量的變化情況。
[0041] 圖2實(shí)施例1脂肪酸含量及產(chǎn)率變化情況。
[0042] 圖3實(shí)施例2生物量的變化情況。
[0043] 圖4實(shí)施例2脂肪酸含量及產(chǎn)率變化情況。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】是：
[0045] 將自養(yǎng)培養(yǎng)獲得的微藻作為藻種接種到異養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過控制異養(yǎng)培養(yǎng)基 中磷的濃度，達(dá)到既不使生物量產(chǎn)率下降同時(shí)提高脂肪酸含量的效果。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法的具體步驟如下：
[0047] (1)自養(yǎng)條件下擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠藻種
[0048] (2)將步驟（1)所述藻種接種到特定的異養(yǎng)培養(yǎng)基中；
[0049] (3)進(jìn)行磷限制下的異養(yǎng)培養(yǎng)。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻為綠藻門小球藻屬中的普通小球藻（Chlorella vulgaris)〇
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻自養(yǎng)培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基為添加了葡萄糖的BG-11培養(yǎng)基，其中 磷的濃度約為3毫克每升。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)在1L錐形瓶中加入0. 7L異養(yǎng)培養(yǎng)基，接 種比例為1 : 8。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異養(yǎng)培養(yǎng)可在搖床和磁力攪拌器上進(jìn)行。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述自養(yǎng)培養(yǎng)基的組成成分如下：NaN031500mg/L， Κ2ΗΡ04 · 3H2040mg/L，MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L，一水合檸檬酸 6mg/ L，檸檬酸鐵銨6mg/L，Na2EDTAlmg/L，lmL微量金屬溶液（※微量金屬溶液Ape); 86mg/L， MnCl2 · 4Η201· 81mg/L，ZnS04 · 7Η200· 222mg/L，CuS04 · 5Η200· 079mg/L，CoCl2 · 6Η200· 050mg/ L, Na2Mo04 · 2H200. 39mg/L)
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異養(yǎng)培養(yǎng)基的組成成分如下：葡萄糖4?10g/L， NaN030 ?1500mg/L，Κ2ΗΡ04 · 3H2025mg/L，MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L， 一水合檸檬酸6mg/L，檸檬酸鐵銨6mg/L，Na 2EDTAlmg/L，lmL微量金屬溶液（※微量金屬溶 液：Η3Β032· 86mg/L，MnCl2 · 4Η201· 81mg/L，ZnS04 · 7Η200· 222mg/L，CuS04 · 5Η200· 079mg/L， CoCl2 · 6H200. 050mg/L, Na2Mo04 · 2H200. 39mg/L)
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)條件包括：溫度24 ±2 °C，pH值6. 0-8. 0。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將異養(yǎng)培養(yǎng)中的微藻細(xì)胞冷凍干燥成藻粉， 用于提取胞內(nèi)活性物質(zhì)。
[0059] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明米用普通小球藻，培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基。
[0060] 將配制好的BG-11培養(yǎng)基加入1L光合反應(yīng)器中，每瓶分裝0.6L，然后高壓蒸汽滅 菌（121°C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中按照10%的比例接入微 藻開始自養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7d，C0 2與空氣的混合氣體在反應(yīng)器頂端通過0. 22 μ m的 濾器除菌后進(jìn)入反應(yīng)器。曝氣速率為0. 5v/v/min，其中C02濃度為4%。
[0061] 離心收集（6000轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘）擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的微藻并再懸浮于適量異 養(yǎng)培養(yǎng)基中待用。
[0062] 將配制好的異養(yǎng)培養(yǎng)基加入1L錐形瓶中，每瓶分裝0. 7L，然后高壓蒸汽滅菌 (121°C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中將過膜除菌的葡萄糖濃縮 液添加到培養(yǎng)基中混勻，接著按照1 : 8的比例接入上述再懸浮的藻種開始異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng) 時(shí)間為8d，攪拌速率為100轉(zhuǎn)每分鐘。在培養(yǎng)第四天的時(shí)候補(bǔ)加約3毫克每升的磷，達(dá)到磷 限制的狀態(tài)。
[0063] 本文中涉及到細(xì)胞干重、脂肪酸含量以及產(chǎn)率的測定和計(jì)算方法如下：
[0064] 藻細(xì)胞干重測定：先將0. 45 μ m的醋酸纖維膜烘至恒重，記錄質(zhì)量為1? (g)在細(xì)胞 培養(yǎng)過程中取藻液VmL，將其抽濾過膜，再次烘至恒重，記錄質(zhì)量為mi (g)。藻體干重C可根 據(jù)下式計(jì)算：C(g/L) = (mfnO^lOOO/V。
[0065] 脂肪酸含量與組成測定：稱取25mg冷凍干燥后的干藻粉于消解管中，加入2mL酯 化試劑（乙酰氯：甲醇=1 : 9,現(xiàn)用現(xiàn)配），80°C水浴反應(yīng)2. 5小時(shí)。冷卻至室溫后加入 lmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 58% NaCl溶液停止酯化反應(yīng)。緊接著再加入2mL正己烷（溶有苯甲酸 甲酯作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度為〇. 36mg/ml)，充分混勻后低轉(zhuǎn)速離心，溶液分層之后取上清液進(jìn) 行氣相分析。
[0066] 脂肪酸產(chǎn)率：由生物量和脂肪酸含量計(jì)算得出。
[0067] 實(shí)施例
[0068] 實(shí)施例1有氮條件下磷限制對異養(yǎng)小球藻脂肪酸含量及產(chǎn)率的研究
[0069] 自養(yǎng)培養(yǎng)基的組成成分如下：NaN031500mg/L，Κ2ΗΡ04 · 3H2040mg/L， MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L，一水合檸檬酸 6mg/L，檸檬酸鐵銨 6mg/L， Na2EDTAlmg/L，lmL 微量金屬溶液（※微量金屬溶液：Η3Β032· 86mg/L，MnCl2 · 4H20L 81mg/L， ZnS04 *7H200. 222mg/L, CuS04 *5H200. 079mg/L, CoC12 *6H200. 050mg/L, Na2Mo04 *2H200. 39mg/ L)
[0070] 缺氮條件下異養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10g/L，NaN031500mg/L，K 2HP04 · 3H200? 258mg/L，MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L，一水合檸檬酸 6mg/L，檸檬 酸鐵銨6mg/L，Na2EDTAlmg/L，lmL微量金屬溶液（※微量金屬溶液：Η 3Β032· 86mg/L， MnCl2 · 4Η201· 81mg/L，ZnS04 · 7Η200· 222mg/L，CuS04 · 5Η200· 079mg/L，CoCl2 · 6Η200· 050mg/ L，Na2Mo04 · 2H200. 39mg/L)，其中磷限制培養(yǎng)基中K2HP04 · 3H20含量為25mg/L，磷充足培養(yǎng) 基中Κ2ΗΡ04 · 3H20含量為258mg/L，磷缺乏培養(yǎng)基中Κ2ΗΡ04 · 3H20含量為Omg/L。
[0071] 將配制好的自養(yǎng)培養(yǎng)基加入1L光合反應(yīng)器中，每瓶分裝0. 6L，然后高壓蒸汽滅菌 (121 °C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中按照10%的比例接入微藻 開始自養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7d，C0 2與空氣的混合氣體在反應(yīng)器頂端通過0. 22 μ m的濾 器除菌后進(jìn)入反應(yīng)器。曝氣速率為〇. 5v/v/min，其中C02濃度為4%。
[0072] 離心收集（6000轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘）擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的微藻并再懸浮于適量有 氮條件下的異養(yǎng)培養(yǎng)基中待用。
[0073] 將配制好的異養(yǎng)培養(yǎng)基（一共三種）加入1L錐形瓶中，每瓶分裝0· 7L，然后高壓 蒸汽滅菌（121°C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中將過膜除菌的葡 萄糖濃縮液添加到培養(yǎng)基中混勻，接著按照1 : 8的比例接入上述再懸浮的藻種開始異養(yǎng) 培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為8d，攪拌速率為100轉(zhuǎn)每分鐘。磷限制條件須在培養(yǎng)第四天的時(shí)候補(bǔ)加約 3暈克每升的磷。
[0074] 經(jīng)過八天異養(yǎng)培養(yǎng)，磷限制狀態(tài)下的生物量產(chǎn)率為526mg/L/d，相比較于磷充足 狀態(tài)（543mg/L/d)幾乎無下降，且遠(yuǎn)高于磷缺乏狀態(tài)（僅72mg/L/d)。脂肪酸含量高達(dá) 43. 7%，高于磷充足狀態(tài)下的29. 1%。最終脂肪酸產(chǎn)率為244mg/L/d，比磷充足狀態(tài)提高了 48%，比磷缺乏狀態(tài)提高了 294%。
[0075] 實(shí)施例2缺氮條件下磷限制對異養(yǎng)小球藻脂肪酸含量及產(chǎn)率的研究
[0076] 自養(yǎng)培養(yǎng)基的組成成分如下：NaN031500mg/L，Κ2ΗΡ04 · 3H2040mg/L， MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L，一水合檸檬酸 6mg/L，檸檬酸鐵銨 6mg/L， Na2EDTAlmg/L，lmL 微量金屬溶液（※微量金屬溶液：Η3Β032· 86mg/L，MnCl2 · 4H20L 81mg/L， ZnS04 ·7Η200· 222mg/L，CuS04 ·5Η200· 079mg/L，CoCl2 ·6Η200· 050mg/L，Na2Mo04 ·2Η200· 39mg/ L)
[0077] 缺氮條件下異養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：葡萄糖10g/L，K2HP04 · 3H200?258mg/L， MgS04 · 7H2075mg/L，Na2C0320mg/L，CaCl227mg/L，一水合檸檬酸 6mg/L，檸檬酸鐵銨 6mg/L， Na2EDTAlmg/L，lmL 微量金屬溶液（※微量金屬溶液：Η3Β032· 86mg/L，MnCl2 · 4H20L 81mg/L， ZnS04 *7H200. 222mg/L, CuS04 *5H200. 079mg/L, CoC12 *6H200. 050mg/L, Na2Mo04 *2H200. 39mg/ L)，其中磷限制培養(yǎng)基中K2HP04 · 3H20含量為25mg/L，磷充足培養(yǎng)基中K2HP04 · 3H20含量為 258mg/L，磷缺乏培養(yǎng)基中Κ2ΗΡ04 · 3H20含量為Omg/L。
[0078] 將配制好的自養(yǎng)培養(yǎng)基加入1L光合反應(yīng)器中，每瓶分裝0. 6L，然后高壓蒸汽滅菌 (121 °C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中按照10%的比例接入微藻 開始自養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7d，C0 2與空氣的混合氣體在反應(yīng)器頂端通過0. 22 μ m的濾 器除菌后進(jìn)入反應(yīng)器。曝氣速率為〇. 5v/v/min，其中C02濃度為4%。
[0079] 離心收集（6000轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘）擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的微藻并再懸浮于適量缺 氮條件下的異養(yǎng)培養(yǎng)基中待用。
[0080] 將配制好的異養(yǎng)培養(yǎng)基加入1L錐形瓶中，每瓶分裝0. 7L，然后高壓蒸汽滅菌 (121°C，20分鐘），當(dāng)培養(yǎng)基降溫至室溫左右時(shí)，在超凈工作臺中將過膜除菌的葡萄糖濃縮 液添加到培養(yǎng)基中混勻，接著按照1 : 8的比例接入上述再懸浮的藻種開始異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng) 時(shí)間為8d，攪拌速率為100轉(zhuǎn)每分鐘。磷限制條件須在培養(yǎng)第四天的時(shí)候補(bǔ)加約3毫克每 升的磷。
[0081] 經(jīng)過八天異養(yǎng)培養(yǎng)，磷限制狀態(tài)下的生物量產(chǎn)率為113mg/L/d，高于磷充足狀 態(tài)（104mg/L/d)和磷缺乏狀態(tài)（81mg/L/d)。脂肪酸含量為86. 8%，同樣高于磷充足狀態(tài) (84. 4% )和磷缺乏狀態(tài)（84. 2% )。最終脂肪酸產(chǎn)率為134mg/L/d，比磷充足狀態(tài)提高了 9%，比磷缺乏狀態(tài)提高了 29%。
【權(quán)利要求】
1. 一種提高微藻脂肪酸產(chǎn)率的方法，所述方法包括以下步驟： a. 將微藻在自養(yǎng)培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)獲得足夠藻種； b. 將步驟a所述藻種接種到磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)基中； c. 進(jìn)行磷限制異養(yǎng)培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻為綠藻門小球藻屬（Chlorella)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻為普通小球藻（Chlorella vulgaris)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻自養(yǎng)培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基為添加了葡萄糖的BG-11培 養(yǎng)基，其中磷的濃度為〇暈克每升至5暈克每升。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b的接種比例為1 : 6至1 : 10。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微藻異養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下各項(xiàng)中的一種或多 種：葡萄糖、NaN03、Κ 2ΗΡ04 · 3H20、MgS04 · 7H20、Na2C03、CaCl2、一水合檸檬酸、檸檬酸鐵銨、 Na2EDTA、H3B03、MnCl2 · 4H20、ZnS04 · 7H20、CuS04 · 5H20、CoCl2 · 6H20 和 Na2Mo04 · 2H20。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中： 葡萄糖的含量為：〇g/L至10g/L ;和/或 NaN03的含量為：0mg/L至1500mg/L ;和/或 Κ2ΗΡ04 · 3H20 的含量為：0mg/L 至 37mg/L ;和 / 或 MgS04 · 7H20 的含量為：60mg/L 至 90mg/L ;和 / 或 Na2C03的含量為：10mg/L至30mg/L ;和/或 CaCl2的含量為：20mg/L至40mg/L ;和/或 一水合檸檬酸的含量為：3mg/L至10mg/L ;和/或 檸檬酸鐵銨的含量為：3mg/L至10mg/L ;和/或 Na2EDTA 的含量為：0mg/L 至 2. Omg/L ;和 / 或 Η3Β03的含量為：0 μ g/L至5 μ g/L ;和/或 MnCl2 · 4H20 的含量為：1 μ g/L 至 3 μ g/L ;和 / 或 ZnS04 · 7H20 的含量為：0. 1 μ g/L 至 0. 5 μ g/L ;和 / 或 CuS04 · 5H20 的含量為：0· 05 μ g/L 至 0· 15 μ g/L ;和 / 或 CoCl2 · 6H20 的含量為：0· 03 μ g/L 至 0· 10 μ g/L ;和 / 或 Na2Mo04 · 2H20 的含量為：0· 2 μ g/L 至 0· 6 μ g/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟c的培養(yǎng)條件包括：22至26攝氏度的溫 度，和/或6.0至8.0的pH值。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將異養(yǎng)培養(yǎng)中的微藻細(xì)胞冷凍干燥 成藻粉，用于提取胞內(nèi)活性物質(zhì)。
【文檔編號】C12P7/64GK104152503SQ201410427641
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】曾建雄, 申曉菲, 儲菲菲, 余世金, 胡昊 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)