一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】；該方法包括重組菌種子液培養(yǎng)；種子液接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中；發(fā)酵期間補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基；發(fā)酵結(jié)束得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基中均含有誘導(dǎo)劑乳糖；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/L)：胰蛋白胨15-20、酵母提取物10-20、氯化鈉10-20、乳糖1-5和水；補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為(g/L)：胰蛋白胨50-100、酵母提取物25-50、甘油300-500、乳糖2-6和水。本發(fā)明簡化了工藝，成本低，安全無毒，提高了菌體得率和蛋白表達(dá)量，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激 因子的培養(yǎng)基以及發(fā)酵方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人粒細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factors, hG-CSF)是一種特異的作用于粒系祖細(xì)胞，促進(jìn)其向成熟中性粒細(xì)胞增殖、分化并 維持其功能、存活所必須的糖蛋白造血生長因子。1986年，由Nagata等從人鱗狀細(xì)胞癌細(xì) 胞系CHU-II中分離了 hG-CSF基因，首次確定了其核苷酸序列并在C0S細(xì)胞中表達(dá)（Nagata S et al，Nature，1986,319 :415-418)。人類有兩種不同的 G-CSF cDNA，分別編碼含 207 和 204個(gè)氨基酸的前體蛋白，均有30個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟蛋白分子為177和174個(gè)氨基 酸，前者除了在成熟分子N端35位處插了 3個(gè)氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相 同。人G-CSF分子量為19. 6kD，PI為6. 1，0-糖基化，對(duì)酸堿（pH2?10)、熱以及變性劑等 相對(duì)較穩(wěn)定。hG-CSF有5個(gè)半胱氨酸殘基，其中4個(gè)半胱氨酸殘基在Cys36與Cys42, Cys74 與Cys64之間形成兩對(duì)二硫鍵；Cysl7為不配對(duì)半胱氨酸，二硫鍵的形成對(duì)于維持G-CSF生 物學(xué)功能非常重要。
[0003] G-CSF在臨床應(yīng)用上具有重要意義，骨髓移植時(shí)可促進(jìn)中性白細(xì)胞的恢復(fù)；改善 再生障礙性貧血伴隨的中性白細(xì)胞缺乏癥；明顯改善癌癥化療時(shí)引起的嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞 缺乏，加大腫瘤治療的力度，增強(qiáng)治療效果；廣泛應(yīng)用于其他伴有中性粒細(xì)胞減少的疾病及 抗感染等的治療。G-CSF天然產(chǎn)物來源非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上的需要，而基因工程 的重組G-CSF的生物學(xué)活性與天然的相似，且可大規(guī)模生產(chǎn)G-CSF。
[0004] 1985年，Welte K從人膀胱癌細(xì)胞株5637的培養(yǎng)上清液中成功純化并精制出 hG-CSF，之后Welte K與Souza L Μ又進(jìn)一步確定這種hG-CSF的N段氨基酸排列順序，將 來源于5637細(xì)胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技術(shù)將該基因插入大腸桿菌成功 制得hG-CSF，從而開發(fā)出重組人粒細(xì)胞集落刺激因子rhG-CSF，商品名為Fi 1 grat iη (惠爾 血）。該藥于1991年獲美國FDA批準(zhǔn)上市。1993年，瞿成奎等人在國內(nèi)首先克隆了人G-CSF cDNA，并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。此后，許多研發(fā)人員也致力于這方面的研究，由于G-CSF 在原核生物中具有表達(dá)量低、生物學(xué)活性不如天然產(chǎn)物的缺點(diǎn)，不斷優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高產(chǎn) 品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本顯得十分重要。
[0005] 目前對(duì)重組粒細(xì)胞集落刺激因子發(fā)酵生產(chǎn)工藝的研究主要集中在工程菌株、高密 度發(fā)酵培養(yǎng)以及包涵體復(fù)性、純化等方面。誘導(dǎo)表達(dá)是目前在大腸桿菌中克隆表達(dá)重組蛋 白最常用和有效的策略。誘導(dǎo)的方式主要有三種：IPTG (異丙基-β-D-巰基半乳糖苷）、熱 誘導(dǎo)和乳糖誘導(dǎo)。重組粒細(xì)胞集落刺激因子發(fā)酵工藝目前主要采用IPTG誘導(dǎo)或者熱誘導(dǎo) (如，42°C)。IPTG是一種非常高效的乳糖啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑，IPTG誘導(dǎo)條件簡單，效果持久穩(wěn) 定，但I(xiàn)PTG具有潛在的毒性，各國藥典均不提倡使用，而且價(jià)格昂貴，因而不適宜在發(fā)酵罐 中進(jìn)行基因工程產(chǎn)品的規(guī)模化生產(chǎn)。此外，熱誘導(dǎo)容易導(dǎo)致包涵體復(fù)性困難，復(fù)性率降低。 乳糖是一種二糖，沒有毒性，天然具有誘導(dǎo)乳糖操縱子的作用，且價(jià)廉易得，因而可能成為 替代IPTG的誘導(dǎo)劑，對(duì)于各種利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，具有十分重 要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。但由于乳糖在作誘導(dǎo)劑的同時(shí)，也可以被細(xì)胞作為碳源代謝利 用，其濃度是動(dòng)態(tài)變化的，而且轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)化涉及多個(gè)酶的參與，誘導(dǎo)機(jī)制比IPTG更為復(fù)雜， 誘導(dǎo)條件不易掌握，需要對(duì)菌體生長及誘導(dǎo)條件進(jìn)行更為精細(xì)的研究及優(yōu)化才能穩(wěn)定高效 誘導(dǎo)重組菌體發(fā)酵表達(dá)hG-CSF。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的高效表達(dá)培 養(yǎng)基，它包含乳糖作為誘導(dǎo)劑和碳源，通過對(duì)培養(yǎng)基中碳源、氮源、誘導(dǎo)劑及其它營養(yǎng)成分 種類及含量、各培養(yǎng)基的配比的研究突破，解決了現(xiàn)有技術(shù)中乳糖作為碳源和誘導(dǎo)劑的工 藝復(fù)雜、重組蛋白表達(dá)量低的難題；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種采用上述高效表達(dá) 培養(yǎng)基制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法將誘導(dǎo)劑包含在培養(yǎng)基 中，省去了 IPTG誘導(dǎo)和熱誘導(dǎo)常用步驟，精簡了工藝，此外，乳糖無毒性，且價(jià)格低廉，適于 重組醫(yī)用蛋白的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，有極其重要的價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基，包括種子 培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨15? 20g/L，酵母提取物10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培 養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨50?100g/L、酵母提取物25?50g/L，甘油300?500g/ L，乳糖2?6g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基按體積計(jì)算為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%? 30%。
[0008] 進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨18?20g/L，酵母提取物 10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其含 量為：胰蛋白胨70?100g/L、酵母提取物40?50g/L，甘油360?500g/L，乳糖2?6g/L， 余量為水。
[0009] 優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基的成分及其含量為胰蛋白胨15?25g/L，優(yōu)選20?25g/ L，酵母粉7?14g/L，優(yōu)選10?14g/L，氯化鈉6?15g/L，優(yōu)選10?15g/L，余量為水，pH 值調(diào)節(jié)為7. 0?7. 2 ;所述種子培養(yǎng)基按體積計(jì)算為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1 %?3%。 [0010] 本發(fā)明還提供了利用上述的培養(yǎng)基制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法， 其具體步驟如下：
[0011] ①.將已轉(zhuǎn)化利用pET-9a載體和人G-CSF基因構(gòu)建得到的重組載體質(zhì)粒的宿主 菌接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至〇D_為0. 8?1. 2,得到發(fā)酵種子液，所述人G-CSF基因序列如 SEQ ID No. 1 所示；
[0012] ②.將發(fā)酵種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1 %?3%的比例接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)3?6小時(shí)；
[0013] ③.按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20 %?30 %的比例向發(fā)酵體系中補(bǔ)加滅菌的補(bǔ)料培養(yǎng) 基繼續(xù)發(fā)酵，18?22小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵得到重組菌發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量 為：胰蛋白胨15?20g/L，酵母提取物10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余 量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨50?100g/L、酵母提取物25?50g/ L，甘油300?500g/L，乳糖2?6g/L，余量為水。
[0014] 進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨18?20g/L，酵母提取物 10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其含 量為：胰蛋白胨70?100g/L、酵母提取物40?50g/L，甘油360?500g/L，乳糖2?6g/L， 余量為水。
[0015] 優(yōu)選地，所述已轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒的宿主菌接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)得到發(fā)酵種子 液為從甘油管菌種挑取已轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒的宿主菌并接種到含有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶 中，接種量為0. 1%，在35?39°C、160?180rpm的條件下培養(yǎng)8?10小時(shí)，即為發(fā)酵種子 液。
[0016] 優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基的成分及其含量為胰蛋白胨15?25g/L，優(yōu)選20?25g/ L，酵母粉7?14g/L，優(yōu)選10?14g/L，氯化鈉6?15g/L，優(yōu)選10?15g/L，余量為水，pH 值調(diào)節(jié)為7.0?7. 2。
[0017] 溫度是工程菌發(fā)酵生長的重要因素，它會(huì)影響菌體的生長速率、生化反應(yīng)速率、酶 系的活性與基質(zhì)的吸收利用等。pH對(duì)于細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響。 用于控制pH值的常用酸和堿有HC1、H 3P04、H2S04、NaOH、ΚΟΗ、ΝΗ3 · H20等。搖床轉(zhuǎn)速也是控 制工程菌發(fā)酵生長的重要因素。在發(fā)酵生長的過程中，需要根據(jù)工程菌的生長和代謝情況， 對(duì)搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整，以使重組蛋白表達(dá)量達(dá)最佳。
[0018] 優(yōu)選地，在發(fā)酵過程中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為35?39°C，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加 酸和堿溶液控制發(fā)酵體系pH在6. 0?7. 5 ;發(fā)酵0至8小時(shí)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為300?400rpm， 8小時(shí)后，轉(zhuǎn)速調(diào)整為200?400rpm ;在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后調(diào)節(jié)好轉(zhuǎn)速、空氣 流量及罐壓以校正溶氧初始值為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0019] 進(jìn)一步地，所述控制發(fā)酵體系pH所使用的酸和堿溶液為鹽酸和氫氧化鈉溶液，優(yōu) 選25 %鹽酸和16 %氫氧化鈉溶液。
[0020] 基因工程菌的培養(yǎng)方式有：分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)和固定 化培養(yǎng)等。分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)是最常用的培養(yǎng)方法之一。分批培養(yǎng)是將所有營養(yǎng)物 質(zhì)一次性加入到發(fā)酵罐中，發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物一次性地得到。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā) 酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間后，分批或連續(xù)的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培 養(yǎng)方法。補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法又叫流加培養(yǎng)，它是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，補(bǔ)加碳源、氮源、無機(jī)鹽 等，以解決碳源、氮源的抑制，消除高濃度底物對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，還可彌補(bǔ)低濃度底 物不利于細(xì)胞生長的缺陷，從而有效的控制了菌體的生長過程，延長了菌體的對(duì)數(shù)生長期， 提高了細(xì)胞密度。常用的補(bǔ)料策略有：恒速、逐步增加和指數(shù)性加料等方法。
[0021] 優(yōu)選地，所述滅菌的補(bǔ)料培養(yǎng)基以流加的方式補(bǔ)加到所述發(fā)酵體系中，補(bǔ)料時(shí)間 為10小時(shí)，補(bǔ)料速率設(shè)定為補(bǔ)料體積除以補(bǔ)料時(shí)間所得數(shù)值。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例 中，補(bǔ)料總體積為2L，補(bǔ)料速率為2L/10h = 200mL/h。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，補(bǔ) 料總體積為5L，補(bǔ)料速率為5L/10h = 500mL/h。
[0022] 優(yōu)選地，所述的宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)。
[0023] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，以上所涉及的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基 在使用前都經(jīng)過115?121°C滅菌15?20min。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0025] (1)成功運(yùn)用乳糖在高密度發(fā)酵中替代IPTG誘導(dǎo)基于乳糖操縱子機(jī)理構(gòu)建的表 達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定高效表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子；
[0026] (2)在本發(fā)明方法中，作為誘導(dǎo)劑的乳糖包含在培養(yǎng)基中，在整個(gè)發(fā)酵過程中進(jìn)行 培養(yǎng)和誘導(dǎo)，不像熱誘導(dǎo)或者IPTG誘導(dǎo)需要額外步驟，精簡了工藝，且菌體生長快，可重復(fù) 性好，大幅縮短發(fā)酵周期。此外，無 IPTG存在，后處理也簡單。
[0027] (3)與IPTG相比，乳糖價(jià)格低廉得多，且乳糖沒有毒性，其在產(chǎn)品中的少量殘留對(duì) 人體影響極小。本發(fā)明方法有利于建立重組粒細(xì)胞集落刺激因子低成本、安全無毒的制備 工藝。
[0028] (4)本發(fā)明對(duì)重組粒細(xì)胞集落刺激因子工程菌發(fā)酵工藝進(jìn)行了深入研究和優(yōu)化， 通過本發(fā)明所述的技術(shù)方案，大腸桿菌BL21 (DE3)菌體得率高，菌體濕重達(dá)20?40g/L，目 的蛋白表達(dá)量高，hG-CSF占菌體總蛋白的水平可達(dá)40?70%，與IPTG誘導(dǎo)水平相當(dāng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例一制備的pET-9a-G_CSF的質(zhì)粒圖譜；
[0030] 圖2為工程菌在10L發(fā)酵罐中的生長曲線圖；
[0031] 圖3為工程菌在50L發(fā)酵罐中的生長曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明提供一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基及利用所述培養(yǎng)基制 備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，下面列舉實(shí)施例予以進(jìn)一步說明。
[0033] 實(shí)施例一
[0034] 1. pET-9a-G_CSF原核表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0035] 人G-CSF基因序列如SEQ ID No. 1所示。按照常規(guī)分子克隆方法合成序列如SEQ ID No. 1所示的人G-CSF基因并引入終止子TAA及目的基因兩端Ndel和BamHI酶切位點(diǎn)； 用Ndel和BamHI對(duì)原核表達(dá)質(zhì)粒載體pET-9a和人G-CSF基因片段分別雙酶切，將雙酶切后 的pET-9a和人G-CSF基因片段連接，得到pET-9a-G-CSF重組質(zhì)粒（圖1)后轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a菌株中。以上工作均由南京金斯瑞完成。
[0036] 將含有pET-9a-G_CSF重組質(zhì)粒的E. coli DH5 a菌株以1 %的接種量接種到含有 5(^8/1^卡那霉素的1^培養(yǎng)基中，在371：下?lián)u床（180印111)培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒無內(nèi)毒素 中提試劑盒（購自Biomega公司）提取純化質(zhì)粒，純化后的質(zhì)粒按照《分子克隆》中的轉(zhuǎn)化 方法導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)(購自Invitrogen公司），再使用含有50yg/mL卡那霉素的LB 瓊脂平板篩選陽性克隆。選擇10個(gè)陽性克隆單菌落，標(biāo)記后分別接種于SuperBroth培養(yǎng)基 (含有50 μ g/mL卡那霉素，4. 1 % SuperBroth，lg/L乳糖）中，在37°C下?lián)u床（180rpm)培 養(yǎng)20?24小時(shí)。取500 μ 1菌液于3500rpm離心棄上清后收集菌泥，用lmL PBS重懸菌泥， 取重懸后的菌懸液15 μ 1，加入15 μ 12 X上樣緩沖液（Loading Buffer)，置沸水浴5min， 于 10000rpm離心5min，取上清15μl進(jìn)行SDS-PAGE整菌電泳，電泳條件為：4.5%濃縮膠 100v電泳10min，15%分離膠120v電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部，停止電泳。結(jié)束后，用考馬斯 亮藍(lán)染色30min，再脫色3h，上BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)G-CSF表達(dá)量。選擇表達(dá)量最大 為40%的菌種進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，并將其命名為E. coliBL21(DE3)-pET-9a-G-CSF。
[0037] 2.保種
[0038] 將篩選鑒定后的 Ε. coliBL21 (DE3)-pET-9a-G-CSF 單菌落接種于 SuperBroth 培 養(yǎng)基（含有50μ g/mL卡那霉素，4. 1% SuperBroth)中，在37°C下?lián)u床（180rpm)培養(yǎng)6? 8小時(shí)，待0D6(?達(dá)到1，停止培養(yǎng)，加入滅菌甘油，使甘油濃度達(dá)到15%，分裝于滅菌凍存管 中，-80°C保藏備用。
[0039] 實(shí)施例二（以10L發(fā)酵罐為例）
[0040] 1.種子的培養(yǎng)：在500mL三角瓶中裝有種子培養(yǎng)基210mL，121°C濕熱滅菌15min， 冷卻到室溫。取實(shí)施例一制備的E. co 1 iBL21 (DE3) -pET-9a-G-CSF甘油管菌種，接種于種 子培養(yǎng)基中，接種量為0. 1%，在溫度35°C、轉(zhuǎn)速為160rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，測(cè)定 〇D_為0. 8,得到發(fā)酵種子培養(yǎng)液。其中種子培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨15g/L，酵 母粉7g/L，氯化鈉6g/L，用去離子水配制而成，滅菌后將其pH調(diào)節(jié)為7. 0。經(jīng)檢查，本次培 養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好。
[0041] 2.接種前準(zhǔn)備：首先將發(fā)酵罐清洗干凈，將發(fā)酵培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻， 倒入發(fā)酵罐中，121 °C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻至35°C備用。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 為：胰蛋白胨15g/L，酵母提取物14g/L，NaC115g/L，乳糖3g/L。
[0042] 將補(bǔ)料培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻，121°C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻后備 用。其中補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨50g/L，酵母提取物25g/L，甘油300g/L，乳糖4g/ L〇
[0043] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1 %的接種量將70mL檢驗(yàn)合格的發(fā) 酵種子培養(yǎng)液接種于10L發(fā)酵罐中，裝液量7L，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，開始發(fā) 酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓校 正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0044] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0045] 4. 1發(fā)酵至3h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率140mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積1. 4L ;
[0046] 4. 2發(fā)酵至8h，轉(zhuǎn)速由300rpm調(diào)整為200rpm ;
[0047] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為1. 4L ;
[0048] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH = 6. 1±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16.0% NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0049] 4. 5發(fā)酵于18h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0050] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D_達(dá)到16. 1，采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥169g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白40. 2%，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體25. 6g。
[0051] 實(shí)施例三（以10L發(fā)酵罐為例）
[0052] 1.種子的培養(yǎng)：在500mL三角瓶中裝有種子培養(yǎng)基210mL，121°C濕熱滅菌15min， 冷卻到室溫。取實(shí)施例一制備的E. co 1 iBL21 (DE3) -pET-9a-G-CSF甘油管菌種，接種于種 子培養(yǎng)基中，接種量為0. 1%，在溫度37°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)9小時(shí)，測(cè)定 0D_為1. 2,得到發(fā)酵種子培養(yǎng)液。其中種子培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨20g/L，酵 母粉l〇g/L，氯化鈉10g/L，用去離子水配制而成，滅菌后將其pH調(diào)節(jié)為7. 1。經(jīng)檢查，本次 培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好。
[0053] 2.接種前準(zhǔn)備：首先將發(fā)酵罐清洗干凈，將發(fā)酵培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻， 倒入發(fā)酵罐中，121 °C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻至37°C備用。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 為：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，NaC110g/L，乳糖lg/L。
[0054] 將補(bǔ)料培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻，121°C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻后備 用。其中補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨l〇〇g/L，酵母提取物50g/L，甘油360g/L，乳糖2g/ L〇
[0055] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%的接種量將210mL檢驗(yàn)合格的發(fā) 酵種子培養(yǎng)液接種于10L發(fā)酵罐中，裝液量7L，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為375rpm，開始發(fā) 酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓校 正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0056] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0057] 4. 1發(fā)酵至5h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率200mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積2L ;
[0058] 4. 2發(fā)酵至8h，轉(zhuǎn)速由375rpm調(diào)整為250rpm ;
[0059] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為2L ;
[0060] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH =7.0±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16.0% NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0061] 4. 5發(fā)酵于20h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0062] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D_達(dá)到22. 4,采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥270. 2g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白71 %，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體45. 6g。
[0063] 實(shí)施例四（以10L發(fā)酵罐為例）
[0064] 1.種子的培養(yǎng)：在500mL三角瓶中裝有種子培養(yǎng)基210mL，121°C濕熱滅菌15min， 冷卻到室溫。取實(shí)施例一制備的E. coliBL21 (DE3)-pET-9a-G-CSF甘油管菌種，接種于種子 培養(yǎng)基中，接種量為〇. 1%，在溫度39°C、轉(zhuǎn)速為170rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)10小時(shí)，測(cè)定 〇D_為1. 0,得到發(fā)酵種子培養(yǎng)液。其中種子培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨25g/L，酵 母粉14g/L，氯化鈉15g/L，用去離子水配制而成，滅菌后將其pH調(diào)節(jié)為7. 2。經(jīng)檢查，本次 培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好。
[0065] 2.接種前準(zhǔn)備：首先將發(fā)酵罐清洗干凈，將發(fā)酵培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻， 倒入發(fā)酵罐中，121 °C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻至39°C備用。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 為：胰蛋白胨18g/L，酵母提取物20g/L，NaC120g/L，乳糖5g/L。
[0066] 將補(bǔ)料培養(yǎng)基溶于純化水中，攪拌均勻，121°C蒸汽濕熱離線滅菌20min，冷卻后備 用。其中補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為：胰蛋白胨70g/L，酵母提取物40g/L，甘油500g/L，乳糖6g/ L〇
[0067] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1. 6%的接種量將110mL檢驗(yàn)合格的 發(fā)酵種子培養(yǎng)液接種于10L發(fā)酵罐中，裝液量7L，培養(yǎng)溫度39°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，開始 發(fā)酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓 校正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0068] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0069] 4. 1發(fā)酵至6h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率210mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積2. 1L ;
[0070] 4· 2發(fā)酵過程中，攪拌轉(zhuǎn)速保持為400rpm ;
[0071] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為2. 1L ;
[0072] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH = 7. 4 ±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16. 0 % NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0073] 4. 5發(fā)酵于22h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0074] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D_達(dá)到18. 6,采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥227. 5g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白64%，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體36. 4g。 工程菌生長曲線見圖2。
[0075] 實(shí)施例五（以50L發(fā)酵罐為例）
[0076] 1.種子的培養(yǎng)：本實(shí)施例種子的培養(yǎng)與實(shí)施例二相同。
[0077] 2.接種前準(zhǔn)備：本實(shí)施例接種前準(zhǔn)備與實(shí)施例二相同。
[0078] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1 %的接種量將250mL檢驗(yàn)合格的發(fā) 酵種子培養(yǎng)液接種于50L發(fā)酵罐中，裝液量25L，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，開始發(fā) 酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓校 正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0079] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0080] 4. 1發(fā)酵至3h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率625mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積6. 25L ;
[0081] 4. 2發(fā)酵至8h，轉(zhuǎn)速由300rpm調(diào)整為200rpm ;
[0082] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為6. 25L ;
[0083] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH = 6. 1±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16.0% NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0084] 4. 5發(fā)酵于18h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0085] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D_達(dá)到22. 3,采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥937. 6g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白42%，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體93. 8g。
[0086] 實(shí)施例六（以50L發(fā)酵罐為例）
[0087] 1.種子的培養(yǎng)：本實(shí)施例種子的培養(yǎng)與實(shí)施例三相同。
[0088] 2.接種前準(zhǔn)備：本實(shí)施例接種前準(zhǔn)備與實(shí)施例三相同。
[0089] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1. 6%的接種量將400mL檢驗(yàn)合格的 發(fā)酵種子培養(yǎng)液接種于50L發(fā)酵罐中，裝液量25L，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為375rpm，開始 發(fā)酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓 校正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0090] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0091] 4. 1發(fā)酵至5h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率500mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積5L ;
[0092] 4. 2發(fā)酵至8h，轉(zhuǎn)速由375rpm調(diào)整為250rpm ;
[0093] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為5L ;
[0094] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH =7.0±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16.0% NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0095] 4. 5發(fā)酵于20h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0096] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D_達(dá)到31. 5,采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥1203g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白71. 3%，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體152g。 工程菌生長曲線見圖3。
[0097] 實(shí)施例七（以50L發(fā)酵罐為例）
[0098] 1.種子的培養(yǎng)：本實(shí)施例種子的培養(yǎng)與實(shí)施例四相同。
[0099] 2.接種前準(zhǔn)備：本實(shí)施例接種前準(zhǔn)備與實(shí)施例四相同。
[0100] 3.接種：在火焰保護(hù)下，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%的接種量將750mL檢驗(yàn)合格的發(fā) 酵種子培養(yǎng)液接種于50L發(fā)酵罐中，裝液量25L，培養(yǎng)溫度39°C，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，開始發(fā) 酵培養(yǎng)。溶氧初始值在發(fā)酵種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量及罐壓校 正為100%，發(fā)酵過程中不再控制溶氧值。
[0101] 4.發(fā)酵：發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法：
[0102] 4. 1發(fā)酵至6h開始流加步驟2中配制的補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料速率750mL/h，補(bǔ)料培養(yǎng) 基體積7. 5L ;
[0103] 4. 2發(fā)酵過程中，攪拌轉(zhuǎn)速保持為400rpm ;
[0104] 4. 3本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為7. 5L ;
[0105] 4. 4本實(shí)施例發(fā)酵過程中pH = 7. 4 ±0. 1，通過反應(yīng)器自動(dòng)流加16. 0 % NaOH溶液， 25% HC1溶液調(diào)節(jié)；
[0106] 4. 5發(fā)酵于22h后結(jié)束，得到發(fā)酵菌液。
[0107] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵菌液0D6(?達(dá)到27,采用管式離心機(jī)收集菌體，獲得濕 菌泥1137. 2g，目的蛋白G-CSF占菌體總蛋白65. 5%，濕菌泥經(jīng)細(xì)胞破碎后獲得包涵體 130. 2g。
[0108] 本發(fā)明用于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。通過研究開 發(fā)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子工程菌乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)工藝，使得操作更為簡單，并且降 低了生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了安全無毒，提高了菌體得率和目標(biāo)蛋白表達(dá)量，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0109] 最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本技術(shù)方案的宗旨和范圍， 其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ) 料培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨15?20g/L，酵母提取 物10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其 含量為：胰蛋白胨50?100g/L、酵母提取物25?50g/L，甘油300?500g/L，乳糖2?6g/ L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基按體積計(jì)算為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%?30%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基，其特征在于所述 種子培養(yǎng)基的成分及其含量為胰蛋白胨15?25g/L，優(yōu)選20?25g/L，酵母粉7?14g/L， 優(yōu)選10?14g/L，氯化鈉6?15g/L，優(yōu)選10?15g/L，余量為水，pH值調(diào)節(jié)為7. 0?7. 2 ; 所述種子培養(yǎng)基按體積計(jì)算為所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%?3%。
3. -種利用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方 法，其具體步驟如下： ① .將已轉(zhuǎn)化利用pET-9a載體和人G-CSF基因構(gòu)建得到的重組載體質(zhì)粒的宿主菌接 種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至〇D_為0. 8?1. 2,得到發(fā)酵種子液，所述人G-CSF基因序列如SEQ ID No. 1 所示； ② .將發(fā)酵種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的1%?3%的比例接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)3?6小時(shí)； ③ .按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20%?30%的比例向發(fā)酵體系中補(bǔ)加滅菌的補(bǔ)料培養(yǎng)基繼 續(xù)發(fā)酵，18?22小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵得到重組菌發(fā)酵液， 其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨15?20g/L，酵母提取物 10?20g/L，氯化鈉10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其含 量為：胰蛋白胨50?100g/L、酵母提取物25?50g/L，甘油300?500g/L，乳糖2?6g/L， 余量為水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于所 述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨18?20g/L，酵母提取物10?20g/L，氯化鈉 10?20g/L，乳糖1?5g/L，余量為水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的成分及其含量為：胰蛋白胨70? 100g/L、酵母提取物40?50g/L，甘油360?500g/L，乳糖2?6g/L，余量為水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征 在于所述已轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒的宿主菌接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)得到發(fā)酵種子液為從甘油 管菌種挑取已轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒的宿主菌并接種到含有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，接種量為 0. 1%，在35?39°C、160?180rpm的條件下培養(yǎng)8?10小時(shí)，即為發(fā)酵種子液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于所 述種子培養(yǎng)基的成分及其含量為胰蛋白胨15?25g/L，優(yōu)選20?25g/L，酵母粉7?14g/L， 優(yōu)選10?14g/L，氯化鈉6?15g/L，優(yōu)選10?15g/L，余量為水，pH值調(diào)節(jié)為7. 0?7. 2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于 在發(fā)酵過程中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為35?39°C，通過加酸和堿溶液控制發(fā)酵體系pH在 6. 0?7. 5 ;發(fā)酵0至8小時(shí)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為300?400rpm，8小時(shí)后，轉(zhuǎn)速調(diào)整為200? 400rpm〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于所 述控制發(fā)酵體系pH所使用的酸和堿溶液為鹽酸和氫氧化鈉溶液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于所 述滅菌的補(bǔ)料培養(yǎng)基以流加的方式補(bǔ)加到所述發(fā)酵體系中，補(bǔ)料時(shí)間為10小時(shí)，補(bǔ)料速率 設(shè)定為補(bǔ)料體積除以補(bǔ)料時(shí)間所得數(shù)值。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的發(fā)酵方法，其特征在于 所述的宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli)BL21(DE3)。
【文檔編號(hào)】C12Q3/00GK104152515SQ201410401268
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】趙俊, 戴建國, 文勇, 徐傳學(xué) 申請(qǐng)人:江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司