一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量及活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量及活性的方法。該方法包括：通過生物復(fù)合酶法制得馬銀花葉酶解物，通過虎奶菌接種于添加有龍腦樟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)制得龍腦樟降解物，在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)第1天-5天加入馬銀花葉酶解物和谷氨酰胺進行第Ⅰ階段發(fā)酵培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2天-6天后加入龍腦樟降解物和α-蒎烯進行第Ⅱ階段發(fā)酵培養(yǎng)，然后繼續(xù)培養(yǎng)1天-5天得到桑黃液體發(fā)酵液。本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶特定代謝產(chǎn)物合成代謝途徑的特點，通過在不同發(fā)酵階段添加不同配比的復(fù)合外源刺激物，發(fā)揮各外源刺激物間協(xié)同作用，大幅度同時提高桑黃胞內(nèi)多糖和胞外漆酶產(chǎn)量和生物活性，產(chǎn)品附加值高，是一種極具工業(yè)化前景的方法。
【專利說明】一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量及活性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量 及活性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔(dān)子菌亞門，層孔菌綱，銹革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和防止癌癥手術(shù)后復(fù)發(fā)等的臨床應(yīng)用中具有顯著效果，是 目前國際公認的生物治癌藥劑中有效率最高的一種藥用真菌。
[0003] 由于受生理狀態(tài)的特殊性和復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，造成桑黃在自然界中形 成子實體稀少，特別是形成可用子實體需要多年。而且人工栽培極其困難，培養(yǎng)條件苛刻， 且生長周期長達3-4年，難以滿足日益膨脹的市場需要。液體發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃有效成分由 于生產(chǎn)周期短、勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點被認為是一種有效的方法。
[0004] 作為目前國際公認的抗癌效果最好的大型藥用真菌，桑黃抑制腫瘤的研究主要集 中在藥理活性成分桑黃多糖上。
[0005] 漆酶（Laccase，EC. 1. 10. 3. 2)是一種最簡單的含銅的多酚氧化酶，它能夠催化酚 類化合物脫去羥基上的電子或者質(zhì)子，從而形成自由基，導(dǎo)致木質(zhì)素及酚類化合物裂解，同 時氧被還原為水。漆酶是白腐菌分解木質(zhì)素的主要酶源之一。
[0006] 微生物發(fā)酵是一個十分復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程。有些次生代謝產(chǎn)物的合成代謝 非常復(fù)雜，發(fā)酵過程的細微差別都會引起產(chǎn)物代謝的不同響應(yīng)。在真菌不同生長階段用外 源刺激物處理，其細胞生長和次級代謝產(chǎn)物的積累程度不同。因此，通過采用外源刺激物對 代謝產(chǎn)物的生物合成進行調(diào)控是獲得高活性目標產(chǎn)物的主要途徑。
[0007] 通過不同發(fā)酵階段添加不同的復(fù)合外源刺激物同時促進桑黃多糖和漆酶產(chǎn)量，并 提商其生物活性尚未見報道。
[0008] 中國專利ZL200910229843. 8公開了一種利用真菌誘導(dǎo)子提高桑黃黃酮產(chǎn)量的桑 黃菌絲體液體發(fā)酵方法，其將真菌誘導(dǎo)子菌種接種活化培養(yǎng)后，取菌塊接種培養(yǎng)過濾得到 真菌誘導(dǎo)子菌絲體；然后烘干研磨破碎加入乙醇浸泡，過濾并收集濾渣，濾渣依次加入氯仿 和正丁醇的混合液、丙酮、水沖洗，風(fēng)干后干物質(zhì)加入三氟乙酸，沸水浴0.5-2小時，然后過 濾，取濾液中和、靜置、〇. 45 μ m微孔濾膜過濾除菌，制成真菌誘導(dǎo)子，-10°C至_20°C冷凍保 存；將桑黃菌種接種活化培養(yǎng)，后取菌塊接種發(fā)酵培養(yǎng)；在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)第1-5天，力口 入真菌誘導(dǎo)子繼續(xù)培養(yǎng)得到桑黃菌絲體，該方法工藝簡單、成本低、效果顯著，可大幅度提 高桑黃細胞黃酮含量，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。這種方法是以桑黃黃酮含量為 指標，通過加入真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)得到桑黃菌絲體，以提高桑黃細胞黃酮含量。
[0009] 中國專利申請CN201010226645. 9公開了一種運用植物油用于藥用真菌桑黃菌液 體培養(yǎng)并提高桑黃菌絲量的方法。培養(yǎng)基初始pH控制在5. 5-7. 5,滅菌溫度115°C -121 °C， 滅菌時間30min。在發(fā)酵初始添加質(zhì)量濃度為0. 5% -5%的不同種類的植物油，包括大豆 油、橄欖油、菜籽油等，采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，接種量為5% -15%，培養(yǎng)溫度為 24°C -28°C。這種方法僅以桑黃菌絲量為唯一指標，通過在培養(yǎng)基中添加適量的植物油，油 脂類物質(zhì)在桑黃液體發(fā)酵中一方面可以作為消泡劑，另一方面可以作為碳源，可以提高桑 黃菌絲體生物量。
[0010] 中國專利申請CN201010151147. 2公開了一種提高靈芝漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法。該 技術(shù)是利用靈芝細胞的液體培養(yǎng)，通過在細胞生長的適宜階段，加入真菌誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)一定 時間后，可顯著提高靈芝漆酶產(chǎn)量，真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)5-8天后，可使靈芝漆酶酶活最高達到 1068. 4U/L，是對照組的2. 2倍。這種技術(shù)僅以生物量、黃酮等單一產(chǎn)物為目標，并未涉及根 據(jù)藥用真菌多糖和漆酶特定代謝產(chǎn)物合成代謝途徑的特點，通過在不同發(fā)酵階段添加特定 的復(fù)合外源刺激物來同時促進桑黃胞內(nèi)多糖和胞外漆酶產(chǎn)量和生物活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖 和漆酶產(chǎn)量及活性的方法，該方法通過在不同發(fā)酵階段添加不同的復(fù)合外源刺激物有助于 提高桑黃胞內(nèi)多糖和漆酶產(chǎn)量，并促進代謝產(chǎn)物活性提高。
[0012] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0013] 一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量及活性的方法，包括步驟：
[0014] (1)桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的桑黃菌種接種于添加桑枝提取物的液體種 子培養(yǎng)基進行桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)；
[0015] (2)外源刺激物對桑黃細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)：在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)第1天-5天，力口 入占液體種子培養(yǎng)基體積〇. 02% -0. 6%的馬銀花葉酶解物和占液體種子培養(yǎng)基體積 0.02% -0. 1%的谷氨酰胺進行第I階段發(fā)酵培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2天-6天后，加入占液體種 子培養(yǎng)基體積0. 01 % -0. 5 %的龍腦樟降解物和占液體種子培養(yǎng)基體積0. 01 % -0. 08 %的 α -菔烯進行第II階段發(fā)酵培養(yǎng)，然后繼續(xù)培養(yǎng)1天_5天，得到桑黃液體發(fā)酵液。
[0016] 本發(fā)明根據(jù)藥用真菌桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶特定代謝產(chǎn)物合成代謝途徑的特 點，通過在不同發(fā)酵階段添加不同配比的復(fù)合外源刺激物，發(fā)揮各外源刺激物間協(xié)同作用， 大幅度同時提高桑黃胞內(nèi)多糖和胞外漆酶產(chǎn)量和生物活性。
[0017] 所述的桑黃菌種可采用任意一種桑黃菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0018] 為了達到更好的發(fā)明效果，進行以下優(yōu)選：
[0019] 步驟（1)中，所述的桑枝提取物的添加量為液體種子培養(yǎng)基體積的5% -10%。
[0020] 本發(fā)明，添加的桑枝提取物等會溶解于液體種子培養(yǎng)基中，因此添加桑枝提取物 前后的液體種子培養(yǎng)基總體積不變。
[0021] 所述的桑枝提取物可以選用市售產(chǎn)品，優(yōu)選采用以下制備方法制備的桑枝提取 物，包括：
[0022] 稱取一定量的桑枝條，粉碎（優(yōu)選過40目-100目），先加占桑枝條重量8倍量-10 倍量質(zhì)量百分濃度為70% -80%的乙醇水溶液在80°C _85°C浸提1. 5h-2h，過濾后得到上清 液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物I ;上述醇提后的桑枝殘渣加占桑枝條重量8倍 量-10倍量水在95°C -100°C下浸提2h-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥 后得提取物II ;合并所述提取物I和提取物II得桑枝提取物。
[0023] 所述的桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20°C -30°C。
[0024] 步驟（1)中，桑黃菌種的活化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種活化方法，包括：將斜面保 藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22°C -30°C，培養(yǎng)時間4 天-10天。
[0025] 所述的PDA平板培養(yǎng)基和液體種子培養(yǎng)基均采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基， 可采用市售產(chǎn)品。進一步優(yōu)選，所述的PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂 15g-20g，用水定容至1000mL。進一步優(yōu)選，所述的液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g-20g、酵母粉 4g、蛋白胨 3g、KH2P04lg 和 MgS040. 5g，用水定容至 1000mL。
[0026] 步驟⑵中，所述的馬銀花葉酶解物的制備方法，包括：將馬銀花葉加水磨成 漿液，滅酶；調(diào)節(jié)漿液PH4. 0-5. 5,加入由纖維素酶和半纖維素酶構(gòu)成的第一復(fù)合酶，在 40°C -50°C進行酶解反應(yīng)0. 5小時-1. 5小時，滅酶后調(diào)節(jié)漿液pH5. 0-7. 0,加入由木瓜蛋白 酶和中性蛋白酶構(gòu)成的第二復(fù)合酶，于50°C -60°C進行酶解反應(yīng)1小時-1. 5小時，滅酶后 離心，上清液經(jīng)過濾、濃縮和干燥，得到馬銀花葉酶解物。
[0027] 所述的第一復(fù)合酶與馬銀花葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :30_50。
[0028] 所述的第二復(fù)合酶與馬銀花葉的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :25_60。
[0029] 所述的纖維素酶與半纖維素酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:2至4:1。
[0030] 所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:3至2:1。
[0031] 所述的中性蛋白酶的酶活力優(yōu)選為20. 0萬U/g-30. 0萬U/g、木瓜蛋白酶的酶活力 優(yōu)選為100. 0萬U/g-200. 0萬U/g、半纖維素酶的酶活力優(yōu)選為3. 0萬U/g-5. 0萬U/g、纖 維素酶的酶活力優(yōu)選為2. 0萬U/g-3. 0萬U/g。
[0032] 將馬銀花葉加水磨成漿液的步驟中，馬銀花葉與水的重量比優(yōu)選為1:3-6. 0。所述 的馬銀花葉可選用采摘后經(jīng)清洗、真空冷凍干燥后的馬銀花葉。
[0033] 所述的滅酶的條件依據(jù)酶失活的條件，一般為：90°C -95°C下滅酶5分鐘-8分鐘。
[0034] 所述的馬銀花葉酶解物的制備方法中，優(yōu)選：上清液用截留分子量為lkDa-3kDa 的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，得到馬銀花葉酶解物。
[0035] 步驟（2)中，所述的龍腦樟降解物的制備方法，包括：將虎奶菌接種在添加有龍腦 樟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-15天（培養(yǎng)溫度可保持在自然的環(huán)境溫度，如21°C -28°C的環(huán)境 溫度），將培養(yǎng)物過濾，濾液經(jīng)滅菌、濃縮和真空冷凍干燥得到龍腦樟降解物。
[0036] 所述的添加有龍腦樟的培養(yǎng)基組成為：龍腦樟15g/L_35g/L、葡萄糖15g/L、酵母 粉 3g/L、蛋白胨 4g/L、KH2P04l. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水。
[0037] 所述的虎奶菌（Pleurotus tuber-regium)，又名核耳燕、菌核側(cè)耳、獲茶側(cè)耳、南 洋獲苓，是一種子實體和菌核均可食用的珍稀食用兼藥用真菌。虎奶菌的菌絲浸染木材 或樹樁后，引起木材腐朽，并在地下、木材中或樹根之間形成圍徑l〇cm-3〇 Cm的菌核。所 述的虎奶菌菌種可采用任意一種虎奶菌菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如虎奶菌（Pleurotus tuber_regium)CGMCC No. 5. 731購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0038] 所述的虎奶菌的菌種的接種量優(yōu)選為3% -15%。
[0039] 所述的接種量指接入的菌種體積或接入的培養(yǎng)好的種子液體積與培養(yǎng)基體積之 比的百分數(shù)。
[0040] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域的常規(guī)條件，例如 可在 120°C -125°C下滅菌 20min-30min。
[0041] 本發(fā)明，從所述的桑黃液體發(fā)酵液中得到桑黃胞內(nèi)多糖和漆酶，具體包括：將桑黃 液體發(fā)酵液用多層紗布過濾，從過濾所得菌絲體中提取桑黃胞內(nèi)多糖；濾液常溫下離心，取 離心上清液即為粗酶液。
[0042] 桑枝，又稱桑枝條，為?？浦参锷orus alba L.的干燥嫩枝。春末夏初采收，去 葉，曬干，或趁鮮切片，曬干。
[0043] 馬銀花（學(xué)名：Rhododendron ovatum)，為杜醇花科杜醇屬下的一個植物種。始記 載于《中國高等植物圖鑒》。本發(fā)明選用馬銀花的葉。
[0044] 龍腦樟（C innamomum camphora(L. ) Pres. 1)為樟科 Laturaceae 樟屬 C innamomum植物的一個化學(xué)型，在樟樹資源中自然分布的比例只有萬分之一左右。龍腦樟是 目前已發(fā)現(xiàn)的含有天然冰片的植物中鮮葉精油含量和精油中右旋龍腦含量最高的天然冰 片新資源。
[0045] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0046] (1)本發(fā)明利用藥用真菌桑黃菌對桑樹特有的寄主性，將桑枝提取物添加到液體 種子液中，提高桑黃液體發(fā)酵的性能。
[0047] (2)根據(jù)桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶特定代謝產(chǎn)物合成代謝途徑的特點，通過在不 同發(fā)酵階段添加不同配比的復(fù)合外源刺激物，充分發(fā)揮馬銀花葉酶解物、谷氨酰胺、龍腦樟 降解物及α -菔烯各外源刺激物間協(xié)同作用，大幅度同時提高桑黃胞內(nèi)多糖和胞外漆酶產(chǎn) 量和生物活性。本發(fā)明方法能夠使胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達到425. 5mg/L，是對照的1. 51倍，漆酶活 性達到26. 69U/mL，是對照的1. 55倍，產(chǎn)品附加值高，是一種極具工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。

【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合部分具體實施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
進行進一步闡明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅 限于下面的實施例。
[0049] 中性蛋白酶（酶活力為20. 0萬U/g)、木瓜蛋白酶（酶活力為100. 0萬U/g)、半纖 維素酶（酶活力為5. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生物工程有 限公司提供。
[0050] PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0051] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心。
[0052] 虎奶菌（Pleurotus tuber-regium) CGMCC No. 5. 731購自中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心。
[0053] 1L液體種子培養(yǎng)基中接入2cm2大小的菌塊（即活化后的桑黃菌種）。
[0054] 實施例1
[0055] 1.發(fā)酵培養(yǎng)
[0056] (1)外源刺激物的制備：
[0057] ①馬銀花葉酶解物的制備方法：將采摘的馬銀花葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量 100g加300mL水，磨成漿液，95°C滅菌5min，使各種酶失活；調(diào)節(jié)漿液PH4.0,加入由lg纖 維素酶和lg半纖維素酶構(gòu)成的復(fù)合酶，在45°c進行酶解反應(yīng)1. 0小時，在95°C下滅酶6分 鐘；然后調(diào)節(jié)漿液PH6.0,加入由1.75g木瓜蛋白酶和1.75g中性蛋白酶構(gòu)成的復(fù)合酶，于 55°C進行酶解反應(yīng)1. 5h，在95°C下滅酶5分鐘，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留 分子量為lkDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得馬銀花葉酶解物；
[0058] ②龍腦樟降解物的制備：將虎奶菌按15%的接種量接種在添加有龍腦樟的培養(yǎng) 基中25°C培養(yǎng)10天后收獲培養(yǎng)物，再將培養(yǎng)物過濾得濾液，進行高壓滅菌，濃縮后真空冷 凍得到龍腦樟降解物。
[0059] 添加有龍腦樟的培養(yǎng)基組成為：龍腦樟28g/L、葡萄糖15g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨 4g/L、KH 2P04l. 5g/L、MgS040. 75g/L 和余量的水。
[0060] (2)桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)：
[0061] 稱取一定量的桑枝條，粉碎過40目，先加占桑枝條重量10倍量質(zhì)量百分濃度為 70 %的乙醇水溶液在80°C浸提1. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提 取物I ;上述醇提后的桑枝殘渣加占桑枝條重量8倍量水在95°C下浸提2h，過濾后得到上 清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物II ;合并所述提取物I和提取物II得桑枝提取 物。
[0062] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C， 培養(yǎng)時間7天，然后取菌塊接種于添加有桑枝提取物的液體種子培養(yǎng)基，1L添加有桑枝提 取物的液體種子培養(yǎng)基組成為桑枝提取物5% (體積百分比）、葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、 蛋白胨3g/L、KH2P04lg/L、MgS0 40. 5g/L和余量的水，pH自然；25°C進行桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)。
[0063] (3)外源刺激物對桑黃細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)：
[0064] 在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)第3天，加入占液體種子培養(yǎng)基體積0. 02%的馬銀花葉酶解 物和占液體種子培養(yǎng)基體積〇. 05 %的谷氨酰胺進行第I階段發(fā)酵培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2天后， 加入占液體種子培養(yǎng)基體積〇. 01 %的龍腦樟降解物和占液體種子培養(yǎng)基體積〇. 03 %的 α -菔烯進行第II階段發(fā)酵培養(yǎng)，然后繼續(xù)培養(yǎng)5天，得到桑黃液體發(fā)酵液。
[0065] (4)將桑黃液體發(fā)酵液用8層紗布過濾，過濾后菌絲體用于提取桑黃胞內(nèi)多糖；濾 液常溫下8000r/min、離心lOmin，取離心上清液即為粗酶液。
[0066] 2 測定
[0067] (1)菌絲生物量的測定
[0068] 發(fā)酵后菌絲體經(jīng)8層紗布過濾，菌絲體用蒸餾水沖洗3次，然后置60°C烘箱中烘干 至恒重,稱重。
[0069] (2)胞內(nèi)多糖含量的測定
[0070] 稱取適量菌絲體干粉，置于燒杯中，按料液比1:10(質(zhì)量比）加入蒸餾水，90°C浸 提3h，提取兩次，減壓過濾收集濾液，50°C下減壓濃縮，濃縮液加入4倍體積無水乙醇，隔夜 醇沉，3000r/min、20min離心后，沉淀即為粗多糖。將沉淀用蒸饋水定容至50mL，用苯酚-硫 酸法測定發(fā)酵液中多糖含量，重復(fù)測定3次求平均值，即胞內(nèi)多糖含量。
[0071] (3)胞內(nèi)多糖對DPPH自由基清除能力的測定
[0072] 取2mL5mg/mL待測樣品于試管中，加入2mL0. 2mmol/L的DPPH乙醇溶液（用質(zhì)量 百分濃度95%乙醇水溶液配制），充分搖勻，室溫靜置35min，在517nm波長處測定吸光值。 以V。為對照，每組做3個重復(fù)，求其平均值。計算公式如下：
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種同時提高桑黃液體發(fā)酵多糖和漆酶產(chǎn)量及活性的方法，其特征在于，包括步 驟： (1) 桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的桑黃菌種接種于添加有桑枝提取物的液體種子 培養(yǎng)基進行桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)； (2) 外源刺激物對桑黃細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)：在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)第1天-5天，加入 占液體種子培養(yǎng)基體積〇. 02 % -0. 6 %的馬銀花葉酶解物和占液體種子培養(yǎng)基體積 0.02% -0. 1 %的谷氨酰胺進行第I階段發(fā)酵培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2天-6天后，加入占液體種 子培養(yǎng)基體積0. 01 % -0. 5%的龍腦樟降解物和占液體種子培養(yǎng)基體積0. 01 % -0. 08%的 α -菔烯進行第II階段發(fā)酵培養(yǎng)，然后繼續(xù)培養(yǎng)1天_5天，得到桑黃液體發(fā)酵液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的桑枝提取物的添加量 為液體種子培養(yǎng)基體積的5% -10%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的桑枝提取物的制備方法，包括： 稱取一定量的桑枝條，粉碎，先加占桑枝條重量8倍量-10倍量質(zhì)量百分濃度為70 % -80 % 的乙醇水溶液在80°C -85°C浸提1. 5h-2h，過濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后 得提取物I ;上述醇提后的桑枝殘渣加占桑枝條重量8倍量-10倍量水在95°C-100°C下浸 提2h-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮真空冷凍干燥后得提取物II ;合并所述提取物 I和提取物II得桑枝提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為 20°C -30°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的馬銀花葉酶解物的制 備方法，包括：將馬銀花葉加水磨成漿液，滅酶；調(diào)節(jié)漿液PH4. 0-5. 5,加入由纖維素酶和半 纖維素酶構(gòu)成的第一復(fù)合酶，在40°C -50°C進行酶解反應(yīng)0. 5小時-1. 5小時，滅酶后調(diào)節(jié) 漿液PH5. 0-7. 0,加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶構(gòu)成的第二復(fù)合酶，于50°C -60°C進行酶 解反應(yīng)1小時-1. 5小時，滅酶后離心，上清液經(jīng)過濾、濃縮和干燥，得到馬銀花葉酶解物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的第一復(fù)合酶與馬銀花葉的質(zhì)量比 為1 :30-50 ;所述的第二復(fù)合酶與馬銀花葉的質(zhì)量比為1 :25-60。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纖維素酶與半纖維素酶的質(zhì)量比 為 1:2 至 4:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量 比為1:3至2:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的龍腦樟降解物的制備 方法，包括：將虎奶菌接種在添加有龍腦樟的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-15天，將培養(yǎng)物過濾，濾液 經(jīng)滅菌、濃縮和干燥得到龍腦樟降解物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的添加有龍腦樟的培養(yǎng)基組成為： 龍腦樟 15g/L-35g/L、葡萄糖 15g/L、酵母粉 3g/L、蛋白胨 4g/L、KH2P04L 5g/L、MgS040. 75g/ L和余量的水。
【文檔編號】C12N9/02GK104195197SQ201410398817
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 付立忠, 李海波, 鄒景泉 申請人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院