一種青霉素?；傅闹苽浞椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青霉素酰化酶的制備方法，該方法為微生物發(fā)酵法，采用大腸桿菌逐級制備一級種子和二級種子，然后使用二級種子在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵制備得到青霉素?；?，制備得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上，顯著提高了生產(chǎn)效率。
【專利說明】一種青霉素?；傅闹苽浞椒?br>
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種微生物發(fā)酵制備青霉素?；傅姆椒ā?br>
【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素?；福╬enicillin acylase，簡稱PA)又稱為青霉素?；D(zhuǎn)移酶，是 β_內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)生產(chǎn)中較為關(guān)鍵的酶，用量很大。
[0003] 青霉素酰化酶既是胞內(nèi)酶又是胞外酶，可以通過產(chǎn)酶微生物的營養(yǎng)控制代謝及基 因型改變，進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。青霉素?；钢饕獜拇竽c埃希菌胞內(nèi)酶和巨大芽孢桿菌胞 外酶獲得，報(bào)道最多的是關(guān)于埃希氏菌屬大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素 G?；?。近年來的研 究傾向于3個(gè)方面：利用物理或化學(xué)誘變方法、基因工程方法對產(chǎn)青霉素酰化酶的菌株進(jìn) 行改造，突變菌種的分離以及酶在不同的產(chǎn)酶宿主細(xì)胞中的克隆和表達(dá)。如利用紫外光誘 變巨大芽孢桿菌可以獲得酶產(chǎn)量增加4倍的突變菌株，利用重組DNA技術(shù)將編碼青霉素酰 化酶的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，構(gòu)建了高產(chǎn)分泌型工程菌，但酶的應(yīng)用性能還有待提升。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，該方法制備得到的青霉素酰 化酶的活性在40000U/L以上。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述目的，發(fā)明人提供了以下技術(shù)方案。
[0006] -種青霉素酰化酶的制備方法，包括以下步驟：
[0007] a.取大腸桿菌，在35-40°C條件下制備一級種子和二級種子，所用種子培養(yǎng)基含 有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl ;
[0008] b.將步驟a制備的二級種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35_40°C培養(yǎng)15_30h，得到發(fā) 酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；
[0009] c.將步驟b制備的發(fā)酵液進(jìn)行離心，棄去上清液，收集下層的菌體濃縮液，即得到 青霉素?；傅拇制啡芤?；
[0010] d.將步驟c所得青霉素?；傅拇制啡芤哼M(jìn)行均質(zhì)，絮凝，超濾濃縮，沉淀除去雜 蛋白，最后進(jìn)行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0011] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟a中，在37-38°C條件下制備一級種子和 二級種子。
[0012] 上述青霉素?；傅闹苽浞椒ǎ霾襟Ea中，種子培養(yǎng)基含蛋白胨5-10重量份， 酵母浸骨2-5重量份，NaCl 5-10重量份，去尚子水1000重量份。
[0013] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，二級種子的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基 體積的3-9%。
[0014] 上述青霉素?；傅闹苽浞椒?，所述步驟b中，二級種子的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基 體積的6%。
[0015] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，培養(yǎng)的溫度為37_38°C。
[0016] 上述青霉素酰化酶的制備方法，所述步驟b中，培養(yǎng)的時(shí)間為26h。
[0017] 上述青霉素?；傅闹苽浞椒?，所述步驟b中，發(fā)酵培養(yǎng)基為每150mL微量元素水 溶液中加入甘油10_20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaC15-10g。
[0018] 上述青霉素?；傅闹苽浞椒ǎ霾襟Eb中，所述微量元素水溶液的配比為：每 升去離子水中含有FeCl 3.6 H20 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2.6H20 0.24g，NaMo04.2H200.24g， CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，Η3Β031· 0g，MgS040. 74g。
[0019] 本發(fā)明所述方法，步驟a中制備一級種子和二級種子選擇在35_40°C條件下進(jìn)行， 符合大腸桿菌的生長特性，在此范圍內(nèi)，菌體的密度會(huì)隨著溫度的升高而升高，在37-38°C 是增長的速度最快，隨后增長趨緩。
[0020] 步驟b中選擇的接種比例為3-9%，在此比例范圍內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)量與接種量的比較高， 尤其是當(dāng)二級種子的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%時(shí)，產(chǎn)出接種比最高。
[0021] 步驟b中，二級種子在35-40°C條件下培養(yǎng)種子發(fā)酵速度較快，在37-38°C條件下 發(fā)酵速度最快，發(fā)酵時(shí)間在15_30h內(nèi)，時(shí)間太短發(fā)酵不充分，時(shí)間太長會(huì)產(chǎn)生菌體自溶，發(fā) 酵時(shí)間在26h時(shí)發(fā)酵效果最好。
[0022] 步驟a中，種子培養(yǎng)基的組成中酵母粉為微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提 供碳源，而NaCl提供無機(jī)鹽。這種培養(yǎng)基適于培養(yǎng)細(xì)菌。
[0023] 同樣的，步驟b中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分中酵母粉為微生物提供碳源和能源，蛋白胨 和甘油主要提供碳源，而NaCl提供無機(jī)鹽。選取這種培養(yǎng)基有利于菌體生長、代謝產(chǎn)酶。
[0024] 步驟b中微量元素水溶液的加入是為了補(bǔ)充細(xì)菌生長所需的無機(jī)鹽。
[0025] 本發(fā)明所述青霉素酰化酶的制備方法，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，能夠制備 得到活性在40000U/L以上的青霉素?；福岣吡税l(fā)酵產(chǎn)量，明顯提高了生產(chǎn)效率。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 種子培養(yǎng)基的制備：蛋白胨5g，酵母粉2g，NaC15g，去離子水1000g，混合均勻，用 Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至6. 5,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0029] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0030] 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置：甘油l〇g，酵母粉20g，蛋白胨10g，NaCl 5g，150mL微量元素水 溶液，混合均勻，用lmol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6. 5，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0031] 將購買的大腸桿菌菌種進(jìn)行活化，在35°C培養(yǎng)6h而后按0. 3%的接種量接種至種 子培養(yǎng)基上進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按發(fā) 酵培養(yǎng)基體積的3%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C培養(yǎng)15h，得到發(fā)酵液，即微生物發(fā) 酵生產(chǎn)青霉素?；附Y(jié)束；將發(fā)酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉素 酰化酶粗品溶液，活性為45000u/l。
[0032] 將青霉素?；赴凑粘Ｒ?guī)操作進(jìn)行均質(zhì)，之后加入聚四胺進(jìn)行絮凝，取上清液進(jìn) 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進(jìn)行透析濃縮，即得到青霉素酰化酶純品。
[0033] 根據(jù)需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] 種子培養(yǎng)基的制備：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，去離子水1000g，混合均 勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0036] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0037] 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置：甘油20g，酵母粉30g，蛋白胨20g，NaCl 10g，150mL微量元素 水溶液，混合均勻，用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0038] 將購買的大腸桿菌菌種進(jìn)行活化，在40°C培養(yǎng)12h而后按0. 3%的接種量接種至 種子培養(yǎng)基上進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按 發(fā)酵培養(yǎng)基體積的9%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在40°C培養(yǎng)30h，得到發(fā)酵液，即微生物 發(fā)酵生產(chǎn)青霉素酰化酶結(jié)束；將發(fā)酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉 素?；复制啡芤?，活性為53000U/1。
[0039] 將青霉素酰化酶按照常規(guī)操作進(jìn)行均質(zhì)，之后加入聚四胺進(jìn)行絮凝，取上清液進(jìn) 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進(jìn)行透析濃縮，即得到青霉素?；讣兤?。
[0040] 根據(jù)需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0041] 實(shí)施例3
[0042] 種子培養(yǎng)基的制備：蛋白胨8g，酵母浸膏3g，NaC17g，去離子水1000g，混合均勻， 用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0043] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
[0044] 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置：甘油15g，酵母粉25g，蛋白胨15g，NaCl 8g，150mL微量元素水 溶液，混合均勻，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0045] 將購買的大腸桿菌菌種進(jìn)行活化，在37°C培養(yǎng)8h而后按0. 3%的接種量接種至種 子培養(yǎng)基上進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；將制備的二級種子，按發(fā) 酵培養(yǎng)基體積的6%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)26h，得到發(fā)酵液，即微生物發(fā) 酵生產(chǎn)青霉素?；附Y(jié)束；將發(fā)酵液離心，收集下層濃縮液（即含菌體部分），即為青霉素 ?；复制啡芤海钚詾?1000u/l。
[0046] 將青霉素酰化酶按照常規(guī)操作進(jìn)行均質(zhì)，之后加入聚四胺進(jìn)行絮凝，取上清液進(jìn) 行超濾濃縮，加入硫酸銨沉淀雜蛋白，最后進(jìn)行透析濃縮，即得到青霉素?；讣兤?。
[0047] 根據(jù)需要，可以將其制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0048] 實(shí)施例4
[0049] 種子培養(yǎng)基的制備：蛋白胨6g，酵母浸膏4g，NaC16g，去離子水1000g，混合均勻， 用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至6. 5,121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
[0050] 微量元素水溶液的配置：去離子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均勻，備用。
【權(quán)利要求】
1. 一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，包括以下步驟： a. 取大腸桿菌，在35-40°C條件下制備一級種子和二級種子，所用種子培養(yǎng)基含有蛋 白胨，酵母浸膏，NaCl ; b. 將步驟a制備的二級種子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35-40°C培養(yǎng)15-30h，得到發(fā)酵 液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液； c. 將步驟b制備的發(fā)酵液進(jìn)行離心，棄去上清液，收集下層的菌體濃縮液，即得到青霉 素?；傅拇制啡芤?； d. 將步驟c所得青霉素?；傅拇制啡芤哼M(jìn)行均質(zhì)，絮凝，超濾濃縮，沉淀除去雜蛋 白，最后進(jìn)行透析濃縮，即得到青霉素?；讣兤?。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述步驟a中， 在37-38°C條件下制備一級種子和二級種子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述步驟a中， 種子培養(yǎng)基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaC15-10重量份，去離子水1000 重量份。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述步驟b中， 二級種子的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3-9%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述步驟b中， 二級種子的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述步驟b中， 培養(yǎng)的溫度為37-38°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述步驟b中， 培養(yǎng)的時(shí)間為26h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，所述步驟b中， 發(fā)酵培養(yǎng)基為每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、 NaCl 5-10g〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青霉素?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述步驟b中， 所述微量元素水溶液的配比為：每升去離子水中含有FeCl 3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g〇
【文檔編號】C12N9/10GK104087565SQ201410365989
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】李紅飛, 劉健, 陳英新, 徐永龍, 梅玉龍, 郝金恒, 李銀, 袁國強(qiáng) 申請人:石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司