甲基化dna富集試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應(yīng)用。甲基化DNA富集試劑是一種由甲基化結(jié)合蛋白和凝膠或磁珠合成的甲基化DNA親和介質(zhì)。利用本發(fā)明的甲基化DNA親和介質(zhì)可建立簡(jiǎn)單、高效的尿液甲基化DNA富集試劑和DNA轉(zhuǎn)化的一步法。大體積尿液中的甲基化DNA可以通過甲基化結(jié)合蛋白的親和介質(zhì)富集，提高了檢測(cè)的靈敏度和速度。富集的甲基化DNA無需進(jìn)一步的DNA分離純化，可以直接用于甲基化分析。
【專利說明】甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種利用甲基化結(jié)合蛋白直接富集，轉(zhuǎn)化并鑒定尿液中甲基化DNA的試劑及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化(DNA methylat1n)是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。哺乳動(dòng)物基因組中，DNA甲基化多發(fā)生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一種表觀(epigenetic)修飾，它在不改變DNA序列的情況下，對(duì)個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、基因表達(dá)模式以及基因組的穩(wěn)定性起到重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在發(fā)育和細(xì)胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的。近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系。目前基礎(chǔ)研究表明DNA甲基化異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用主要包括:(I)DNA甲基化異常促使C~T突變發(fā)生，研究表明DNA甲基化使胞嘧啶轉(zhuǎn)變成5 mC,而5mC的突變率比其他堿基(包括沒有甲基化的胞嘧啶)突變率高。同時(shí)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)在催化突變反應(yīng)方面有重要作用，參與導(dǎo)致C-U-T的轉(zhuǎn)換，包括p53在內(nèi)的許多腫瘤抑制基因的5 mC在惡性腫瘤中都是突變的熱點(diǎn)，DNA甲基化異常在這些突變中發(fā)揮一定的作用。(2)DNA甲基化異常影響基因的表達(dá)。腫瘤組織中基因組甲基化狀態(tài)不同于正常組織，表現(xiàn)為整個(gè)基因組的低甲基化與部分區(qū)域特別是基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化共存，這種甲基化狀態(tài)與許多腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)有關(guān)。腫瘤中基因組甲基化程度普遍降低，其中許多特異癌基因也出現(xiàn)低甲基化，同時(shí)伴隨它們的表達(dá)有不同程度的增加。有報(bào)道認(rèn)為在細(xì)胞群體中，DNA低甲基化可能是導(dǎo)致腫瘤形成的原始細(xì)胞克隆增殖的關(guān)鍵因素之一。但低甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究闡明。腫瘤細(xì)胞中許多抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化目前被廣泛研究，這種甲基化異常與該基因的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，并能通過有絲分裂穩(wěn)定的遺傳。所以認(rèn)為，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常高甲基化是抑癌基因失活的一種機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，一個(gè)P16等位基因發(fā)生突變而未甲基化，另一個(gè)未突變但高度甲基化，最終該基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄抑制。此外越來越多的基因被報(bào)道在腫瘤中因高甲基化而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，這些基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控、生長(zhǎng)和分化(ER基因)、血管生成(THBS1基因)、粘連和轉(zhuǎn)移(--ΜΡ3基因)、DNA修復(fù)(MGMT基因)等多方面，表明高甲基化在腫瘤形成中發(fā)揮著作用。
[0003]DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:一，甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變；二，抑癌基因和DNA修復(fù)基因由于超甲基化而沉默；三，癌基因甲基化水平降低而活化；四，基因組總體甲基化水平降低使轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列活化導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降。這些因素是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化最終導(dǎo)致患者死亡的重要原因。DNA總體甲基化水平(即甲基化譜)和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標(biāo)。
[0004]目前常用的甲基化DNA檢測(cè)方法是從組織樣本中提取DNA進(jìn)行甲基化DNA檢測(cè)。此種方法的缺點(diǎn)是不適合腫瘤的早期診斷。而早期腫瘤的治愈率遠(yuǎn)高于晚期腫瘤。相應(yīng)的死亡率也大大降低。因此能夠提高腫瘤早期診斷率的方法和技術(shù)一直是醫(yī)學(xué)界探索的重要目標(biāo)。
[0005]尿液做為常規(guī)檢驗(yàn)樣本，收集簡(jiǎn)單，易于處理，可以大量獲得。如果能從尿液中富集甲基化DNA，那么當(dāng)腫瘤出現(xiàn)DNA甲基化時(shí)，在早期階段即有可能被發(fā)現(xiàn)。醫(yī)生可以迅速采取必要的醫(yī)療措施，及早消除病患。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種方法簡(jiǎn)單、高效，可將富集和轉(zhuǎn)化一步完成的甲基化DNA富集試劑。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種利用甲基化DNA富集試劑富集尿液中甲基化DNA的方法。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種甲基化DNA富集試劑，是一種由甲基化結(jié)合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結(jié)合蛋白凝膠或甲基化結(jié)合蛋白磁珠。
[0009]上述的甲基化DNA富集試劑，所述的鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。
[0010]上述的甲基化DNA富集試劑，甲基化DNA富集試劑中含有穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑包含 PPG 或 Tween20。
[0011]上述的甲基化DNA富集試劑，所述的甲基化結(jié)合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]上述的甲基化DNA富集試劑的制備方法如下:
[0013]I)按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結(jié)合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質(zhì)粒PET中，構(gòu)建甲基化結(jié)合蛋白表達(dá)質(zhì)粒ρΕΤ-ΜΒΡ，將質(zhì)粒ρΕΤ-ΜΒΡ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.4時(shí)，在37°C條件下用IPTG誘導(dǎo)，使IPTG的終濃度為0.5mM,誘導(dǎo)15~17小時(shí)，7000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集菌體細(xì)胞；
[0014]2)將菌體細(xì)胞經(jīng)溶菌酶裂解30分鐘后，超聲波破碎，離心，得到含有甲基化結(jié)合蛋白的裂解液，加入金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠或瓊脂糖鎳磁珠，混合并在4°C孵育2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液洗兩次，每次用1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結(jié)合蛋白的凝膠，制得甲基化DNA富集試劑。
[0015]本發(fā)明的甲基化DNA富集試劑用于富集尿液中甲基化DNA，方法如下:
[0016]I)取尿樣，3000轉(zhuǎn)/分鐘，取上清液；
[0017]2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集試劑10微升，于4_25°C下振蕩保溫Ih ；
[0018]3) 1000 轉(zhuǎn) / 分鐘離心，除去上清液，以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將甲基化結(jié)合蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到離心管中，離心除去上清液，即得富集了尿樣中甲基化DNA的甲基化結(jié)合蛋白凝膠。
[0019]本發(fā)明的甲基化DNA富集試劑還可用于制備富集甲基化DNA的試劑盒。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是一種利用凝膠或磁珠與甲基化結(jié)合蛋白結(jié)合而建立的簡(jiǎn)單、高效的尿液甲基化DNA富集、轉(zhuǎn)化一步法。本發(fā)明將甲基化結(jié)合蛋白的基因克隆到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒的基因表達(dá)位點(diǎn)。表達(dá)出來的甲基化結(jié)合蛋白帶有六個(gè)組氨酸的C-末端。該蛋白可以用親和層析方法直接純化，并以非共價(jià)鍵形式連接在凝膠或磁珠上，制成的甲基化富集試劑可以用于甲基化的DNA富集。腫瘤組織釋放出的甲基化DNA可以通過血液進(jìn)入尿液。尿液的成份相對(duì)血液要簡(jiǎn)單并容易收集，更容易用于腫瘤檢測(cè)。大體積尿液中的甲基化DNA可以通過甲基化結(jié)合蛋白凝膠或磁珠富集，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和速度。富集的甲基化DNA無需進(jìn)行通常的DNA分離純化，直接用于甲基化分析。
[0021]尿樣中含有兩類DNA:—類來自血液，另外一類來自輸尿管和膀胱。有診斷意義的DNA是來自血液的較小的DNA片段。本發(fā)明首先經(jīng)離心將尿液里的大分子DNA和細(xì)胞碎片分離。然后將含有血液DNA的尿液與帶有甲基化結(jié)合蛋白的凝膠或磁珠混合。經(jīng)孵育后，離心過濾收集帶有甲基化DNA的甲基化結(jié)合蛋白凝膠。凝膠-甲基化結(jié)合蛋白-DNA復(fù)合沉淀可以直接用于甲基化DNA的轉(zhuǎn)化和測(cè)定。尿液中甲基化基因特定位點(diǎn)的甲基化可通過亞硫酸氧化和快速、靈敏的實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于通過簡(jiǎn)單的一步法可以將大量尿液中待測(cè)的甲基化DNA特異性富集，無需進(jìn)一步的分離純化直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化和檢測(cè)，進(jìn)而提高了檢測(cè)速度和靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1.甲基化結(jié)合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0023]圖2.甲基化結(jié)合蛋白的電泳圖；
[0024]圖中，I).純化甲基化結(jié)合蛋白；2).凝膠-甲基化結(jié)合蛋白；
[0025]3).磁珠-甲基化結(jié)合蛋白。
[0026]圖3.甲基化DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和PCR分析；
[0027]圖中，I).DNA標(biāo)準(zhǔn)物；2).陰性對(duì)照；3).陽性結(jié)果。
[0028]具體實(shí)施方法
[0029]實(shí)施例1甲基化DNA富集試劑
[0030]I)甲基化結(jié)合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(ρΕΤ-ΜΒΡ)的構(gòu)建
[0031]按SEQ ID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結(jié)合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質(zhì)粒PET中，構(gòu)建甲基化結(jié)合蛋白表達(dá)質(zhì)粒ρΕΤ-ΜΒΡ，將質(zhì)粒ρΕΤ-ΜΒΡ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.4時(shí)，在37°C條件下用IPTG誘導(dǎo)，使IPTG的終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)16小時(shí)，7000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集菌體細(xì)胞，保存在_80°C低溫冰箱。
[0032]2)凝膠甲基化DNA富集試劑
[0033]菌體細(xì)胞經(jīng)溶菌酶裂解(lmg/ml，30分鐘，不時(shí)搖動(dòng))，然后，超聲波破碎(1x10分鐘，冰浴控制溫度)，離心，得到含有甲基化結(jié)合蛋白的裂解液，加入2毫升的金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠，混合并在4°C孵育2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液1ml洗兩次，每次用1000轉(zhuǎn)/分鐘分離，最后以Iml的50mMTris-HCl pH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結(jié)合蛋白的凝膠，從而得到甲基化結(jié)合蛋白凝膠，即甲基化DNA富集試劑。其電泳檢測(cè)分子量2.6kDa(如圖2)。
[0034]3)磁珠甲基化DNA富集試劑
[0035]菌體細(xì)胞經(jīng)溶菌酶裂解(lmg/ml，30分鐘，不時(shí)搖動(dòng))，然后，超聲波破碎(1x10分鐘，冰浴控制溫度)，離心，得到含有甲基化結(jié)合蛋白的裂解液，加入2毫升的瓊脂糖鎳磁珠，混合并在4°C孵育2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清液，并用50mM Tris-HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液1ml洗兩次，每次用1000轉(zhuǎn)/分鐘分離，最后以Iml的50mMTris_HClpH7.5 ；150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結(jié)合蛋白的磁珠，從而得到甲基化結(jié)合蛋白磁珠，即甲基化DNA富集試劑。
[0036]得到的甲基化DNA富集試劑的穩(wěn)定性也可以通過加入甲基化結(jié)合蛋白穩(wěn)定劑增加其穩(wěn)定性。穩(wěn)定劑包含PPG、Tween20或者特異蛋白等。
[0037]實(shí)施例2尿樣中甲基化DNA的富集
[0038]方法如下:
[0039]1.尿樣采集
[0040]可以采用標(biāo)準(zhǔn)尿樣容器，采集量約50毫升。尿樣轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，然后離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘，除去尿樣中雜質(zhì)。將離心得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的50ml的離心管中，進(jìn)入下面結(jié)合步驟。
[0041]2.甲基化DAN結(jié)合
[0042]向50ml上清液中加入實(shí)施例1中2)制備的凝膠甲基化DNA富集試劑10微升，并在室溫?fù)u動(dòng)(60次左右/分鐘)，保溫一小時(shí)。此過程也可以在4°C下進(jìn)行。此時(shí)尿樣中的甲基化DNA已和富集試劑中的甲基化結(jié)合蛋白結(jié)合。
[0043]3.甲基化DAN富集
[0044] 1000 轉(zhuǎn) / 分鐘離心，除去上清液，并以 Iml 的 50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將富集了甲基化DNA的凝膠轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清，即得富集了甲基化DNA的甲基化結(jié)合蛋白凝膠。所得到的凝膠可以直接用于甲基化分析。包括轉(zhuǎn)化、雜交、CPR以及DNA序列測(cè)定等甲基化分析。
[0045]4.甲基化DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和PCR分析
[0046]富集了甲基化DNA的凝膠試劑不需分離和純化，直接經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和PCR甲基化分析。首先，向富集的甲基化DNA樣品中加入100微升的轉(zhuǎn)化試劑，然后對(duì)轉(zhuǎn)化的樣品進(jìn)行脫磺酸基處理(Zymo甲基化DNA轉(zhuǎn)化試劑盒)。轉(zhuǎn)化后的DNA經(jīng)甲基化特異性引物(正向引物為 TATAAACCCTAAACACTAAACCACG，反向引物為 TATATTCGGGGTGTGTGTGTTTGAC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，其電泳圖如圖3所示。PCR條件:20微升反應(yīng)物，95oC 10分鐘；40X(95oC，30秒;60oC，30秒;72oC，30秒)；72oC，3分鐘。實(shí)驗(yàn)中采用的是正常人甲基化DNA靶物。PCR得到的DNA條帶長(zhǎng)度為130對(duì)堿基(圖3)。
[0047]本發(fā)明采用尿樣為檢測(cè)樣品，方便、無創(chuàng)。采用甲基化DNA富集凝膠或磁珠富集甲基化DNA，方法簡(jiǎn)便，并可以提高檢測(cè)靈敏度。甲基化DNA直接在磁珠上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，不需DNA純化。因此本發(fā)明所闡述的方法具有快速、無創(chuàng)、方便、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種甲基化DNA富集試劑，其特征在于:甲基化DNA富集試劑是由甲基化結(jié)合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結(jié)合蛋白凝膠或甲基化結(jié)合蛋白磁珠。
2.如權(quán)利要求1所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:所述的帶有鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。
3.如權(quán)利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:甲基化DNA富集試劑中含有穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑包含PPG或TWeen20。
4.如權(quán)利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于:所述的甲基化結(jié)合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
5.權(quán)利要求4所述的甲基化DNA富集試劑的制備方法，其特征在于方法如下: 1)按SEQID N0.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結(jié)合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質(zhì)粒中，構(gòu)建甲基化結(jié)合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌； 2)將菌體細(xì)胞經(jīng)溶菌酶裂解30分鐘后，超聲波破碎，離心，得到含有甲基化結(jié)合蛋白的裂解液，加入金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠或瓊脂糖鎳磁珠 ，混合并在4°C孵育2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清液，并用1ml 50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl緩沖液洗兩次，每次用1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，最后以Iml的50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結(jié)合蛋白的凝膠，制得甲基化DNA富集試劑。
6.權(quán)利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在富集尿液中甲基化DNA的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于方法如下: 1)取尿樣，3000轉(zhuǎn)/分鐘，取上清液； 2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集試劑10微升，于4_25°C下振蕩保溫Ih； 3)1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，除去上清液，以Iml的50mM Tris-HCl ρΗ7.5，150mM NaCl緩沖液將甲基化結(jié)合蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到離心管中，離心除去上清液，即得富集了尿樣中甲基化DNA的甲基化結(jié)合蛋白凝膠。
8.權(quán)利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在甲基化DNA富集試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104131004SQ201410361087
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】李偉東 申請(qǐng)人:沈陽百創(chuàng)特生物科技有限公司