貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒主要包括有：與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針,每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列互補(bǔ)配對(duì)的序列；連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分間的擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列。本發(fā)明所述試劑盒除了具有特異性好、信噪比高、能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)外，還能實(shí)現(xiàn)不同基因mRNA表達(dá)水平的穩(wěn)定檢測(cè)，即能夠在不同樣本間，3種內(nèi)參基因的表達(dá)檢測(cè)穩(wěn)定,從而使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【專利說明】貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及貝伐單抗療效 相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 貝伐單抗（Bevacizumab，Avastin，阿瓦斯汀）是重組的人源化單克隆抗體。2004 年2月26日獲得FDA的批準(zhǔn)，是美國(guó)第一個(gè)獲得批準(zhǔn)上市的抑制腫瘤血管生成的藥。目前 研究表明，IgGl抗體能通過體內(nèi)、體外檢測(cè)系統(tǒng)與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)結(jié)合并阻斷 貝伐單抗的生物活性。
[0003] (1)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（VEGFR)
[0004] 血管生成是人體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成已成 為近年來尋找新型抗腫瘤藥物的重要研究方向。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF)及其受體 (VEGFR)是血管生成抑制劑靶向治療的主要靶標(biāo)。血管生成抑制劑的藥物作用機(jī)理主要是 通過抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成來達(dá)到阻止腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。目前FDA 批準(zhǔn)的此類藥物包括舒尼替尼、索拉非尼和貝伐單抗等。
[0005] VEGFR 家族的成員主要包括：VEGFR1 (FLT-1)、VEGFR2 (KDR/Flk-Ι)、 VEGFR3 (Flt-4)，VEGFR1在血細(xì)胞生成過程中發(fā)揮重要作用，而VEGFR2在促有絲分裂、血管 生成和VEGF滲透性效果的提高中起著主要調(diào)節(jié)作用。
[0006] 臨床研究已證實(shí)，VEGFR2可作為結(jié)腸癌病人使用貝伐單抗聯(lián)合治療方案臨床療效 獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子，即5-FU或卡培他濱和奧沙利鉬或貝伐單抗（F0LF0X/BV或XEL0X/BV)臨 床療效，其治療療效與VEGFR2基因表達(dá)水平密切相關(guān)，即VEGFR2基因表達(dá)水平高的患者的 中位無進(jìn)展生存期較長(zhǎng)，而VEGFR2基因表達(dá)水平低的患者中位無進(jìn)展生存期較低。因此患 者在接受靶向藥物治療之前，進(jìn)行VEGFR基因表達(dá)水平檢測(cè)，從而確定是否接受靶向治療， 可以降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的醫(yī)治時(shí)間。
[0007] (2)持家基因β 2-微球蛋白（B2M)、鐵傳遞蛋白受體（TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白 (TBP)
[0008] 持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，但由于這種穩(wěn)定表達(dá)是相對(duì)的，在一定的病理 狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。選擇在我們所研究對(duì)象中 穩(wěn)定表達(dá)的基因作持家基因，對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量 的常用持家基因中進(jìn)行篩選，確定3個(gè)合適的持家基因，分別是：β 2-微球蛋白（B2M)、鐵傳 遞蛋白受體（TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白（ΤΒΡ)。
[0009] 基于以上基因的表達(dá)水平與貝伐單抗藥物療效的相關(guān)性，專家推薦患者在接受貝 伐單抗藥物之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè) 體差異制定個(gè)體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。
[0010] 目前，對(duì)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)主要有：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實(shí)時(shí)熒 光定量PCR法、RNA原位核酸雜交（RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細(xì)胞內(nèi)RNA 分布以了解特定基因的表達(dá)情況，且其過程較長(zhǎng)、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn) 錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測(cè) 的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，容易產(chǎn)生非特 異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性高；再次，這兩種方法一般只有一個(gè)持家基因作對(duì)照，其準(zhǔn)確性 容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均 存在著難以克服的技術(shù)缺陷。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明 申請(qǐng)人:在項(xiàng)目開發(fā)早 期申請(qǐng)了的中國(guó)發(fā)明專利（申請(qǐng)?zhí)枺?00910193802. 8)，但其針對(duì)同一樣本不同基因mRNA檢 測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱不均衡，從而影響到目標(biāo)基因VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的判讀，因此急需對(duì) 該產(chǎn)品進(jìn)行改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，該檢 測(cè)試劑盒除了可以高靈敏度和特異性地單獨(dú)或者任意組合并列檢測(cè)以下6種目標(biāo)基因的 表達(dá)水平：VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、B2M、TFRC、TBP，且其中3種內(nèi)參基因表達(dá)檢測(cè)更加穩(wěn) 定。
[0012] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0013] 一種貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，主要包括：
[0014] (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序 列和3'端的能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
[0015] ⑵連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基 序列從5'端到3'端依次為：與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P2、間隔臂序 列、能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性 序列P2包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID N0. 7 - SEQ ID N0. 11中的2條以上、針 對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID N0. 12 - SEQ ID N0. 16中的2條以上、針對(duì)VEGFR3基因的 選自SEQ ID N0. 17 - SEQ ID N0. 21中的2條以上、針對(duì)B2M基因的選自SEQ ID N0. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的 2條以上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上；
[0016] (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目 標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5, 3'末端還修飾有生物素；所述 擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID N0. 38 - SEQ ID NO. 47中的5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 48 - SEQ ID NO. 57中的5條以 上、針對(duì)VEGFR3基因的選自SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 67中的5條以上、針對(duì)B2M基因的 選自SEQ ID NO. 68- SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 - SEQ ID NO. 87中的5條以上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97 中的5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、 與PI、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
[0017] 或者，主要包括：
[0018] (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序 列和3'端的能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
[0019] (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基 序列從5'端到3'端依次為：與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P2、間隔臂序 列、能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性 序列P2包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID N0. 7 - SEQ ID N0. 11中的2條以上、針 對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID N0. 12 - SEQ ID N0. 16中的2條以上、針對(duì)VEGFR3基因的 選自SEQ ID N0. 17 - SEQ ID N0. 21中的2條以上、針對(duì)B2M基因的選自SEQ ID N0. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2 條以上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上；
[0020] (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目 標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5 ;所述擴(kuò)增延伸探針的特異性 序列P4包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID N0. 38 - SEQ ID N0. 47中的5條以上、針 對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID N0. 48 - SEQ ID N0. 57中的5條以上、針對(duì)VEGFR3基因的 選自SEQ ID N0. 58 - SEQ ID N0. 67中的5條以上、針對(duì)B2M基因的選自SEQ ID N0. 68 - SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 - SEQ ID NO. 87中的 5條以上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的5條以上，所述 P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總 mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和
[0021] (4)標(biāo)記探針,所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具 有生物素修飾。
[0022] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢 測(cè)液相芯片，還包括有填充序列，包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID N0. 98 - SEQ ID NO. 100中一條或多條、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 104中的一條 或多條、針對(duì)VEGFR3基因的選自SEQ ID NO. 105 - SEQ ID NO. 108中的一條或多條、針對(duì) B2M基因的選自SEQ ID NO. 109 - SEQ ID NO. 112中的一條或多條、針對(duì)TFRC基因的選自 SEQ ID N0. 113 -SEQ ID N0. 114 中的一條或多條、和/或針對(duì)TBP基因的 SEQ ID Ν(λ 115- SEQ ID NO. 116。
[0023] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間隔臂序列為5 - 10個(gè)T ;所述P5的組成為SEQ ID Ν0· 37。
[0024] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0025] (1)本發(fā)明在已有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，通過各種探針的設(shè)計(jì)和組合的進(jìn)一步優(yōu)化，除了 具有特異性好、信噪比高、能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)外，還能實(shí)現(xiàn)不同 基因mRNA表達(dá)水平的穩(wěn)定檢測(cè)，即能夠在不同樣本間，3種內(nèi)參基因的表達(dá)檢測(cè)穩(wěn)定，從而 使檢測(cè)結(jié)果更易判讀。
[0026] (2)所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使液 相芯片和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng)，有著操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確性高、特異性高的特 點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提 供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0028] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí) 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所 列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
[0029] 實(shí)施例1貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，主要包括有：
[0030] -、偶聯(lián)有支持探針（SP)的微球
[0031] 支持探針由三部分組成，5'端是與微球結(jié)合的胺基端，3'端是與支持延伸探針結(jié) 合（互補(bǔ)配對(duì)）的特異序列P1，長(zhǎng)度為16nt，中間是間隔序，所述間隔臂為本領(lǐng)域的技術(shù)人 員所理解的，即用于將支持探針與微球表面間隔開來，在支持延伸探針與擴(kuò)增延伸探針內(nèi) 部也存在間隔臂序列，通過在探針序列與氨基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列， 可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明支持探針的間隔臂 優(yōu)選為5 - 10個(gè)T，本實(shí)施例所述間隔臂序列是8個(gè)T。每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，并選 用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。本實(shí)施例中，每個(gè)目標(biāo)基因的支持探針如 表1所示。
[0032] 表1不同的目標(biāo)基因及其選用微球的編號(hào)、支持探針（SP)
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在于，主要包括： (1) 與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括有5'端的間隔臂序列 和3'端的能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2) 連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基序列 從5'端到3'端依次為：與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P2、間隔臂序列、 能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序 列P2包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 7 - SEQ ID NO. 11中的2條以上、針對(duì) VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 12 -SEQ ID NO. 16中的2條以上、針對(duì)VEGFR3基因的選自 SEQ ID NO. 17 - SEQ ID NO. 21 中的 2 條以上、針對(duì) B2M 基因的選自 SEQ ID NO. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以 上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上； (3) 擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目標(biāo)基 因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5, 3'末端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增 延伸探針的特異性序列P4包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 38 - SEQ ID NO. 47 中的5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 48 - SEQ ID NO. 57中的5條以上、針 對(duì)VEGFR3基因的選自SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 67中的5條以上、針對(duì)B2M基因的選自 SEQ ID NO. 68 - SEQ ID NO. 77 中的 5 條以上、針對(duì) TFRC 基因的選自 SEQ ID NO. 78 - SEQ ID NO. 87中的5條以上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的 5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與PI、 P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：還包括有填充序列，所述填充序列為：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 98 - SEQ ID NO. 100中一條或多條、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 104中的一條 或多條、針對(duì)VEGFR3基因的選自SEQ ID NO. 105 - SEQ ID NO. 108中的一條或多條、針對(duì) B2M基因的選自SEQ ID NO. 109 - SEQ ID NO. 112中的一條或多條、針對(duì)TFRC基因的選自 SEQ ID NO. 113 -SEQ ID NO. 114 中的一條或多條、和/或針對(duì)TBP基因的 SEQ ID NO. 115- SEQ ID NO. 116。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：所述特異性序列P1為：針對(duì)VEGFR1基因的SEQ ID NO. 1、針對(duì)VEGFR2基因的SEQ ID NO. 2、針對(duì)VEGFR3基因的SEQ ID NO. 3、針對(duì)B2M基因的SEQ ID NO. 4、針對(duì)TFRC基因的 SEQ ID NO. 5、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：所述間隔臂序列為5 - 10個(gè)T。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1一4任一項(xiàng)所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑 盒，其特征在于：所述P5的組成為SEQ ID NO. 37。
6. -種貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在于：主要包括： (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列 和3'端的能與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2) 連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基序列 從5'端到3'端依次為：與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P2、間隔臂序列、 能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序 列P2包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 7 - SEQ ID NO. 11中的2條以上、針對(duì) VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 12 - SEQ ID NO. 16中的2條以上、針對(duì)VEGFR3基因的選自 SEQ ID NO. 17 - SEQ ID NO. 21 中的 2 條以上、針對(duì) B2M 基因的選自 SEQ ID NO. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以 上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上； (3) 擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目標(biāo)基 因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5 ;所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列 P4包括有：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 38 - SEQ ID NO. 47中的5條以上、針對(duì) VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 48 - SEQ ID NO. 57中的5條以上、針對(duì)VEGFR3基因的選自 SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 67 中的 5 條以上、針對(duì) B2M 基因的選自 SEQ ID NO. 68 - SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 -SEQ ID NO. 87中的5條以 上、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的5條以上，所述P5為 不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA 之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和 (4) 標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生 物素修飾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：還包括有填充序列，所述填充序列為：針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ ID NO. 98 - SEQ ID NO. 100中一條或多條、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 104中的一條 或多條、針對(duì)VEGFR3基因的選自SEQ ID NO. 105 - SEQ ID NO. 108中的一條或多條、針對(duì) B2M基因的選自SEQ ID NO. 109 - SEQ ID NO. 112中的一條或多條、針對(duì)TFRC基因的選自 SEQ ID NO. 113 -SEQ ID NO. 114 中的一條或多條、和 /或針對(duì)TBP基因的 SEQ ID NO. 115- SEQ ID NO. 116。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：所述特異性序列P1為：針對(duì)VEGFR1基因的SEQ ID NO. 1、針對(duì)VEGFR2基因的SEQ ID NO. 2、針對(duì)VEGFR3基因的SEQ ID NO. 3、針對(duì)B2M基因的SEQ ID NO. 4、針對(duì)TFRC基因的 SEQ ID NO. 5、和/或針對(duì)TBP基因的選自SEQ ID NO. 6。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑盒，其特征在 于：所述間隔臂序列為5 - 10個(gè)T。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6- 9任一項(xiàng)所述的貝伐單抗療效相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)液相芯片試劑 盒，其特征在于：所述P5的組成為SEQ ID NO. 37。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195231SQ201410356990
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】吳詩揚(yáng), 羅彩英, 楊惠夷, 何嘉英 申請(qǐng)人:益善生物技術(shù)股份有限公司