利用l-乳酸合成s-1,2-丙二醇的重組大腸桿菌及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重組大腸桿菌及其構建方法。該方法，包括如下步驟：1)將大腸桿菌BW25113-△poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因分別替換為3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因、輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因和丙酰輔酶A轉移酶的編碼基因，得到的重組菌記為BWPDO1；2)敲除所述BWPDO1的ldhA基因和dld基因，得到重組菌BWPDO2；3)向所述BWPDO2中導入丙酮酸脫羧酶的編碼基因和NAD依賴型乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因，得到重組菌BWPDO3，即為所述重組大腸桿菌。實驗證明，本發(fā)明所得的重組大腸桿菌可以利用L-乳酸轉化生成S-1,2-丙二醇，以200mM乳酸鈉為底物，37℃培養(yǎng)24小時可產生3.4mM的S-1,2-丙二醇。本發(fā)明為提高生物合成S-1,2-丙二醇的產量和轉化率的工作打下了基礎。
【專利說明】【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于微生物領域，涉及一種利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿 菌及其構建方法。 利用L-乳酸合成S-1,2-丙二醇的重組大腸桿菌及其構建 方法 【背景技術】
[0002] 丙二醇的結構區(qū)別將其區(qū)分為1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。1，2-丙二醇主要用來 生產不飽和聚酯樹脂、防凍劑、增塑劑替代乙二醇用于防凍飛行器及在食品中作冷卻劑和 熱載體等，它還可用于非離子洗滌劑或保濕劑。丙二醇還是良好的溶劑，可用于食品調味品 和香料，或醫(yī)藥工業(yè)的軟膏油膏等。
[0003] 光學活性1，2-丙二醇具有活性基團，可作為手性起始物用于藥物、除草劑、信息 素和液晶的合成，具有很高的研究價值。大腸桿菌中自身存在有生成1，2_丙二醇的代謝 通路。在代謝L-鼠李糖和L-巖藻糖途徑中，磷酸化后的糖由醛縮酶催化生成L-乳醛和 二羥丙酮磷酸（DHAP)，后在厭氧的條件和NADH存在下L-乳醛被催化為L-1，2-丙二醇，即 S-1. 2-丙二醇。但由于原料價格過高，此通路并沒有很好經濟效益，所以沒有很好的研究價 值。在嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)中也有從甲基乙二 醒（methylglyoxal)分別生成乳醒（Lactaldehyde)或丙酮醒（Acetol)最終生成1，2_丙 二醇的路徑，但其中有些路徑只是猜想的，目前并沒有證據(jù)表明存在實際的酶去催化。
[0004] 關于生物催化合成R-1，2-丙二醇的研究，目前，國外已有關于生物催化合成 R-1，2-丙二醇的報道，Tadashi等采用氣升式發(fā)酵罐對酵母還原丙酮醇生成R-1，2-丙二 醇和酵母氧化拆分外消旋1，2-丙二醇進行了研究，但仍未得到工業(yè)化應用，而國內少有報 道。
【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌及其制 備方法與應用。
[0006] 本發(fā)明所提供的方法可為利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌A的制 備方法，具體可包括如下（1)-(3)的步驟：
[0007] (1)將大腸桿菌BW25113-Δ poxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因 分別替換為3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因（mmsB基因）、輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶 的編碼基因（pdcD基因）和丙酰輔酶A轉移酶的編碼基因（pet基因），得到的重組菌記為 BWPD01 ；
[0008] 所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB為將大腸桿菌BW25113野生型中的poxB基因敲 除后所得的菌株；
[0009] (2)敲除步驟（1)獲得的BWPD01的ldhA基因和did基因，得到的重組菌記為 BWPD02 ；
[0010] (3)向步驟（2)獲得的BWPD02中導入丙酮酸脫羧酶的編碼基因（ZpPDC基因）和 NAD依賴型的乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因（mhpf基因），得到的重組菌記為BWPD03 ;所述 BWPD03即為所述重組大腸桿菌A。
[0011] 其中，所述11 dD基因為丙酮酸和L-乳酸轉化編碼基因、所述ldhA基因和所述did 基因為兩個不同的丙酮酸和D-乳酸之間轉化蛋白的編碼基因。所述adheE基因和所述 ackA-pta基因為兩個不同的影響底物乙酰輔酶A含量的下游基因。
[0012] 本發(fā)明所提供的方法也可為利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌B的 制備方法，包括以上的步驟（1)和步驟（2);所述步驟（2)中獲得的所述BWPD02即為所述 重組大腸桿菌B。
[0013] 在上述方法的步驟（1)中，所述3-羥基丙酸脫氫酶為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)的3-羥基丙酸脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列12所示。所述輔酶A依 賴型琥拍酸半醒脫氫酶為小腸結腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴 型琥珀酸半醛脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列13所示。所述丙酰輔酶A轉移酶 為丙酸梭菌（Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉移酶的點突變蛋白，其氨基酸序 列具體如序列表中序列14所示。
[0014] 在上述法的步驟⑶中，所述丙酮酸脫羧酶為棕櫚發(fā)酵細菌（Zymobacter palmae)的丙酮酸脫羧酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列15所示。所述NAD依賴型的 乙醛輔酶A脫氫酶為來自大腸桿菌的需NAD的乙醛輔酶A脫氫酶，其氨基酸序列具體如序 列表中序列16所示。
[0015] 進一步，步驟（1)中，所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因（mmsB基因）的核苷酸 序列具體為序列表中序列1的第116-994位；所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼 基因（pdcD基因）的核苷酸序列具體為序列表中序列2的第326-1714位；所述丙酰輔酶A 轉移酶的編碼基因（pet基因）的核苷酸序列具體為序列表中序列3的第326-1900位。步 驟（3)中，所述丙酮酸脫羧酶的編碼基因（ZpPDC基因）的核苷酸序列具體為序列表中序列 4的第1001-2671位；所述NAD依賴型的乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因（mhpf基因）的核 苷酸序列具體為序列表中序列4的第3-953位。
[0016] 另外，步驟（1)中，所述poxB基因的核昔酸序列具體為序列表中序列18所不；所 述lldD基因的核苷酸序列具體為序列表中序列5 ;所述adheE基因的核苷酸序列具體為序 列表中序列6;所述ackA-pta基因的核苷酸序列具體為序列表中序列7。步驟（2)中，所述 ldhA基因的核苷酸序列具體為序列表中序列8 ;所述did基因的核苷酸序列具體為序列表 中序列9。
[0017] 在所述方法的步驟（1)中，所述大腸桿菌BW25113_ApoxB，具體是按照包括如下 步驟的方法獲得的：向含有PKD46質粒的所述大腸桿菌BW25113野生型的感受態(tài)中轉入序 列表中序列17所示的DNA片段17,所述DNA片段17與所述大腸桿菌BW25113野生型的基 因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)敲除所述大腸桿菌BW25113野生型的所述poxB基因，獲得所述 大腸桿菌BW25113-ApoxB ;事實上，在向所述大腸桿菌BW25113野生型中轉入所述DNA片 段17后，還包括消除pKD46質粒及轉入pCP20質粒的步驟并消除pCP20質粒的步驟（用 于去除整合到所述大腸桿菌BW25113野生型基因組中的所述DNA片段17上的Kan抗性基 因）。
[0018] 在所述方法的步驟（1)中，將所述大腸桿菌BW25113-ApoxB中的所述lldD基 因替換為所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因，具體是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有pKD46 質粒的所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB的感受態(tài)中轉入序列表中序列1所示的DNA片段 1，所述DNA片段1與所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所 述lldD基因替換為所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因。在本發(fā)明中，在向所述大腸桿菌 BW25113- Λ poxB中轉入所述DNA片段1后，還包括消除pKD46質粒的步驟及轉入pCP20質 粒的步驟并消除PCP20質粒的步驟（用于去除整合到所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB基因 組中的所述DNA片段1上的Kan抗性基因）。
[0019] 將所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中的所述adheE基因替換為輔酶A依賴型琥 珀酸半醛脫氫酶的編碼基因，具體是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有PKD46質粒的所述大腸 桿菌BW25113- Λ poxB的感受態(tài)中轉入序列表中序列2所示的DNA片段2,所述DNA片段 2與所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所述adheE基因替 換為所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因。在本發(fā)明中，在向所述大腸桿菌 BW25113- Λ poxB中轉入所述DNA片段2后，還包括消除pKD46質粒的步驟及轉入pCP20質 粒的步驟并消除PCP20質粒的步驟（用于去除整合到所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB基因 組中的所述DNA片段2上的Kan抗性基因）。
[0020] 將所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中的所述ackA-pta基因替換為丙酰輔酶 A轉移酶的編碼基因，具體是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有pKD46質粒的所述大腸桿菌 BW25113- Λ poxB的感受態(tài)中轉入序列表中序列3所示的DNA片段3,所述DNA片段3與所 述大腸桿菌BW25113-Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所述ackA-pta基因替換為 所述丙酰輔酶A轉移酶的編碼基因。在本發(fā)明中，在向所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中轉 入所述DNA片段3后，還包括消除pKD46質粒的步驟及轉入pCP20質粒的步驟并消除pCP20 質粒的步驟（用于去除整合到所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB基因組中的所述DNA片段3 上的Kan抗性基因）。
[0021] 在所述方法的步驟（2)中，敲除所述BWPD01的所述ldhA基因，具體是通過如下方 法實現(xiàn)的：向含有PKD46質粒的所述BWPD01的感受態(tài)中轉入序列表中序列10所示的DNA 片段10,所述DNA片段10與所述BWPD01的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)敲除所述BWPD01 的所述ldhA基因。在本發(fā)明中，在向所述BWPD01中轉入所述DNA片段10后，還包括消除 PKD46質粒的步驟及轉入pCP20質粒的步驟并消除pCP20質粒的步驟（用于去除整合到所 述BWPD01基因組中的所述DNA片段10上的Kan抗性基因）。
[0022] 敲除所述BWPD01的所述did基因，具體是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有pKD46質 粒的所述BWPD01的感受態(tài)中轉入序列表中序列11所示的DNA片段11，所述DNA片段11與 所述BWPD01的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)敲除所述BWPD01的所述did基因。在本發(fā)明 中，在向所述BWPD01中轉入所述DNA片段11后，還包括消除pKD46質粒的步驟及轉入pCP20 質粒的步驟并消除PCP20質粒的步驟（用于去除整合到所述BWPD01基因組中的所述DNA 片段11上的Kan抗性基因）。
[0023] 在所述方法的步驟（3)中，所述丙酮酸脫羧酶的編碼基因和所述NAD依賴型的乙 醛輔酶A脫氫酶的編碼基因是通過重組表達載體的形式導入所述BWPD02中的。
[0024] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體具體為將序列表中序列4所示DNA 片段插入到PBAD43載體的多克隆位點后得到的重組質粒。所述多克隆位點具體可為 Ncol (序列4上為BspHI，兩者為同尾酶）和SphI。
[0025] 利用所述方法制備得到的所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸桿菌B也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0026] 所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸桿菌B在利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙 二醇中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇的方法，可為如下（A)或 ⑶：
[0029] (A)包括如下步驟：向所述重組大腸桿菌B的培養(yǎng)體系中加入終濃度為200mM的 L-乳酸或其鹽作為底物，于37°C進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中獲得S-1，2-丙二醇；
[0030] (B)向所述重組大腸桿菌A的培養(yǎng)體系中加入終濃度為200mM的L-乳酸或其鹽作 為底物，于37°C培養(yǎng)至0D600至0. 6-0. 8之間，加入終濃度為2g/L的L-阿拉伯糖作為誘導 齊[J，于37°C進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中獲得S-1，2-丙二醇。
[0031 ] 在所述方法中，所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸桿菌B的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基 的碳源為葡萄糖，其含量為l〇g/L。
[0032] 在所述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)方式可為振蕩培養(yǎng)，轉速可為180rpm ;時間 為24小時。
[0033] 在所述方法中，所述培養(yǎng)體系中所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸桿菌B的初 始 0D600 為 0. 1。
[0034] 實驗證明，本發(fā)明通過Red重組手段對影響L-乳酸到S-1，2-丙二醇反應通路的 一些基因進行了基因敲除的工作，同時將三個關鍵酶的基因插入到大腸桿菌的基因組中 去，利用T5啟動子對其表達進行調控，并通過重組表達載體轉入丙酮酸脫羧酶的編碼基因 (ZpPDC基因）和NAD依賴型的乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因（mhpf基因）對菌株進行還原 力的平衡（也就是NADH的回補方法），最終獲得了可以生物衍生L-乳酸轉化生成S-l，2-丙 二醇的代謝工程改造菌株。該重組大腸桿菌以200mM乳酸鈉為底物，37°C培養(yǎng)24小時可產 生3. 4mM的S-1，2-丙二醇。本發(fā)明為提高生物合成S-1，2-丙二醇的產量和轉化率的工作 打下了基礎。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為重組大腸桿菌BWPD01的PCR鑒定。其中，A為敲除lldD基因的同時替換上 mmsB基因；B為敲除adhE基因的同時替換上pdcD基因；C為敲除ackA-pta基因的同時替 換上pet基因。A-C中，泳道Ml各條帶由大到小依次為10·0、8·0、6·0、5·0、4·0、3·0、2·0、 1. 5、1· 0、0· 5kb ;泳道 M2 各條帶由大到小依次為 4· 5、3· 0、2· 0、1· 2、0· 8、0· 5kb。
[0036] 圖2為重組大腸桿菌BWPD01利用L-乳酸合成S-l，2-丙二醇的結果。
[0037] 圖3為重組大腸桿菌BWPD02的PCR鑒定。其中，A為敲除did基因；B為敲除ldhA 基因。A和B中，泳道Μ各條帶由大到小依次為4· 5、3· 0、2· 0、1· 2、0· 8、0· 5kb。
[0038] 圖4為重組大腸桿菌BWPD02利用L-乳酸合成S-l, 2-丙二醇的結果。
[0039] 圖5為重組大腸桿菌BWPD03的PCR驗證結果。泳道Μ各條帶由大到小依次為4. 5、 3· 0、2· 0、1· 2、0· 8、0· 5kb。
[0040] 圖6為重組大腸桿菌BWPD03利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的結果。 【具體實施方式】
[0041] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] pBAD43載體：Youbio公司產品，其產品目錄號為VT1293。
[0044] pKD46 質粒（GenBank ID:AY〇48746· 1)、pCP2〇 質粒（GenBank ID:HB3934〇2· 1): ATCC (美國菌種保藏中心）。參考文獻：0ne_step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products，DatsenkoKA，Wanner BL，Proc Natl Acad Sci USA.2000Jun6;97(12):6640-5。
[0045] 大腸桿菌BW25113野生型：Coli Genetics Stock Center，其產品目錄號為 CGSC#7636〇
[0046] 大腸桿菌BW25113-ApoxB :由大腸桿菌BW25113野生型敲除poxB基因（序列18) 所得，具體操作如下：
[0047] 1、人工合成序列17所示的DNA片段：第1-59位為大腸桿菌BW25113野生型自身 的poxB基因的上游序列（即上游同源臂）；第80-113位為FRT位點序列；第488-1282位 為Kan抗性基因；第1473-1506位為FRT位點序列；第1527-1585位為大腸桿菌BW25113野 生型自身的P〇xB基因的下游序列（即下游同源臂）該DNA片段用于敲除大腸桿菌BW25113 野生型自身的P〇xB基因。
[0048] 2、按照如下步驟進行
[0049] (1)參照實施例1步驟一 1中的⑴中記載的方法，向大腸桿菌BW25113野生型中 轉入PKD46質粒并制備感受態(tài)，從而獲得含有pKD46質粒的重組大腸桿菌BW25113野生型 的感受態(tài)細胞。
[0050] (2)參照實施例1步驟一 1中的⑵中記載的方法，將以上步驟1人工合成的DNA 片段轉入含有PKD46質粒的重組大腸桿菌BW25113野生型的感受態(tài)細胞。
[0051] (3)抗性篩選和PCR鑒定
[0052] 將步驟（2)電轉DNA片段后的重組菌涂布于Kan抗性平板長出的單克隆，進行PCR 檢測。以挑出的單克隆為模板，以引物poxB-F和poxB-R進行PCR擴增，選擇經驗證正確 (得到大小約為1720bp目的條帶）的克隆進行繼續(xù)劃線培養(yǎng)。
[0053] poxB-F :5' -ATTAACGGTAGGGTCGTCTCCG-3' ；
[0054] poxB-R : 5 ' -TCATCGGGCTATTTAACCGTTAGTG-3 '。
[0055] (4)利用pCP20質粒消除抗性
[0056] 參照實施例1步驟一 1中的（4)中記載的方法進行。對于挑取的單克隆，以引物 poxB-F和poxB-R進行PCR擴增，選擇經驗證正確（得到大小約327bp目的條帶）的克隆進 行繼續(xù)劃線培養(yǎng)。
[0057] (5)將步驟（4)鑒定陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，在42°C培養(yǎng)，傳代兩次， 劃單克隆，以去掉PCP20質粒，最后同時在氨芐抗性和無抗平板上劃線，氨芐平板不能生長 的菌株為敲除成功的無抗缺失體，即為大腸桿菌BW25113- Λ poxB。
[0058] 本發(fā)明的發(fā)明人進一步利用引物poxB-F和poxB-R對大腸桿菌BW25113- Λ poxB 進行測序工作，確定所插入基因序列的正確性。
[0059] 結果顯示，采用引物poxB-F和poxB-R對大腸桿菌BW25113- Λ poxB進行測序，測 序結果顯示大腸桿菌BW25113- Λ poxB在對應序列表中序列17的基因組部分缺失了序列 17的第80-1472位，實現(xiàn)了 poxB基因的敲除。
[0060] 實施例1、利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌的構建及功能鑒定
[0061] 一、重組大腸桿菌BWPD01的構建及功能鑒定
[0062] 1、重組大腸桿菌BWPD01的構建
[0063] 根據(jù)利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的途徑確定參與催化的三個關鍵酶：分別是 丙酰輔酶A轉移酶（Pct，氨基酸序列為序列14)催化由L-乳酸至L-乳酰輔酶A反應、輔酶A 依賴型琥珀酸半醛脫氫酶（PdcD，氨基酸序列為序列13)催化由L-乳酰輔酶A至L-乳醛途 徑及3-羥基丙酸脫氫酶（MmsB，氨基酸序列為序列12)催化L-乳醛反應最終生成S-1，2-丙 二醇。
[0064] 設計思路：敲除大腸桿菌BW25113- Λ poxB自身的lldD基因（序列5)的同時替 換上mmsB基因，敲除大腸桿菌BW25113-ApoxB自身的adhE基因（序列6)的同時替換上 pdcD基因，敲除大腸桿菌BW25113-ApoxB自身的ackA-pta基因（序列7)的同時替換上 pet基因。并且將三個關鍵酶基因一pet、pdcD和mmsB基因采用T5啟動子控制表達，并在 T5啟動子后接SD序列。
[〇〇65] 根據(jù)如上設計思路，依據(jù)Red重組系統(tǒng)工作原理，人工合成如下含有同源臂用于 敲除替換的三個DNA片段：
[0066] DNA片段A :其核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中，第1-40位為大腸桿菌 BW25113-ApoxB自身的lldD基因的上游序列（即上游同源臂）；第41-100位為T5啟動子 序列；第101-115位為SD序列；第116-994位為mmsB基因序列；第1016-1049位為FRT位 點序列；第1424-2218位為Kan抗性基因；第2409-2442位為FRT位點序列；第2443-2482 位為大腸桿菌BW25113-ApoxB自身的lldD基因的下游序列（即下游同源臂）。該DNA片 段A用于敲除大腸桿菌BW25113- Λ poxB自身的lldD基因同時替換上mmsB基因。
[0067] DNA片段B :其核苷酸序列如序列表中序列2所示。其中，第1-250位為大腸桿菌 BW25113-ApoxB自身的adhE基因的上游序列（即上游同源臂）；第251-310位為T5啟動 子序列；第311-325位為SD序列；第326-1714位為pdcD基因序列；第1736-1769位為FRT 位點序列；第2144-2938位為Kan抗性基因；第3129-3162位為FRT位點序列；第3163-3412 位為大腸桿菌BW25113-ApoxB自身的adhE基因的下游序列（即下游同源臂）。該DNA片 段B用于敲除大腸桿菌BW25113- Λ poxB自身的adhE基因同時替換上pdcD基因。
[0068] DNA片段C :其核苷酸序列如序列表中序列3所示。其中，第1-250位為大腸桿菌 BW25113-ApoxB自身的ackA-pta基因的上游序列（即上游同源臂）；第251-310位為T5 啟動子序列；第311-325位為SD序列；第326-1900位為pet基因序列；第1922-1955位 為FRT位點序列；第2330-3124位為Kan抗性基因；第3315-3348位為FRT位點序列；第 3349-3598位為大腸桿菌BW25113- Λ poxB自身的ackA-pta基因的下游序列（即下游同源 臂）。該DNA片段C用于敲除大腸桿菌BW25113-ApoxB自身的ackA-pta基因同時替換上 pet基因 〇
[0069] 將以上三個DNA片段（DNA片段A、DNA片段B和DNA片段C)通過電轉的方式轉入 大腸桿菌BW25113- Λ poxB的感受態(tài)細胞，分三次實驗轉入，依次進行，從而實現(xiàn)目的基因 的敲除與替換。以DNA片段A的轉入實驗為例說明具體步驟如下：
[0070] (1)把pKD46質粒轉化到大腸桿菌BW25113_ApoxB的感受態(tài)細胞中，30°C搖床 180rpm，過夜培養(yǎng)。次日按接種量1 % (體積分數(shù)）的比例將培養(yǎng)液接種到100mL新的LB 培養(yǎng)基（1〇〇μ g/mL氨芐青霉素）的錐形瓶中，30°C搖床180rpm，培養(yǎng)；0D = 0. 1時加入終 濃度0. 2% (0. 2g/100mL)L-阿拉伯糖；待0D = 0. 6-0. 7時，將菌液分裝成50mL/管，置于 冰上冷卻至4°C以下；6°C，4000rpm，離心10min，棄上清，收集菌體；每管加25II1L10 1% (體積 分數(shù)）無菌預冷甘油，輕輕懸浮，4°C，4000rpm，離心10min，棄上清；每管加15mL10% (體積 分數(shù)）無菌預冷甘油，輕輕懸浮，4°C，4000rpm，離心10min，棄上清；每管加2mL10% (體積 分數(shù)）無菌預冷甘油，輕輕懸浮，4°C，4000rpm，離心10min，棄上清；每管加200 μ L無菌預 冷甘油，輕輕懸浮，分裝成50 μ L/管。放入-80°C凍存?zhèn)溆?。得到含有pKD46質粒的大腸桿 菌BW25113- Λ poxB的感受態(tài)細胞。
[0071] (2)從-80°C取出步驟⑴制備含有pKD46質粒的大腸桿菌BW25113- Λ poxB的 感受態(tài)細胞，置冰上解凍，電擊杯（1mm狹縫）晾干后置冰上；取200ng DNA片段（以上獲得 的DNA片段A)，加入到感受態(tài)中，溫柔混勻，加到預冷的電極杯中；1800V電擊，6ms，立即加 入lmL LB培養(yǎng)基；將液體取出放入EP管中，150rpm恒溫培養(yǎng)lh ;取200 μ L涂布至含卡那 抗生素（35 μ g/mL)的LB平板；倒置平板，于恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
[0072] (3)抗性篩選和PCR鑒定
[0073] 將步驟（2)電轉DNA片段A后涂布于Kan抗性平板長出的單克隆，進行PCR檢 測。以挑出的單克隆為模板，以表1中給出的編號為1的引物對分別進行PCR擴增，選擇 經驗證正確的克隆進行繼續(xù)劃線培養(yǎng)。PCR擴增同時設置未轉入DNA片段A的大腸桿菌 BW25113-ApoxB作為野生型對照（WT)。擴增產物的理論長度見表1 (野生型和突變型KmK)。
[0074] 表1基因敲除驗證引物及理論擴增長度
[0075]
【權利要求】
1. 一種利用L-乳酸合成s-l，2-丙二醇的重組大腸桿菌A的制備方法，包括如下 ⑴-⑶的步驟： (1)將大腸桿菌BW25113-ApoxB中的lldD基因、adheE基因和ackA-pta基因分別替 換為3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因、輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因和丙酰輔 酶A轉移酶的編碼基因，得到的重組菌記為BWPD01 ; 所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB為將大腸桿菌BW25113野生型中的poxB基因敲除后 所得的菌株； ⑵敲除步驟⑴獲得的BWPD01的ldhA基因和did基因，得到的重組菌記為BWPD02 ; (3)向步驟（2)獲得的BWPD02中導入丙酮酸脫羧酶的編碼基因和NAD依賴型乙醛輔酶 A脫氫酶的編碼基因，得到的重組菌記為BWPD03 ;所述BWPD03即為所述重組大腸桿菌A。
2. -種利用L-乳酸合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌B的制備方法，包括權利要求 1中的步驟⑴和步驟⑵；所述步驟⑵中獲得的所述BWPD02即為所述重組大腸桿菌B。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述3-羥基丙酸脫氫 酶的氨基酸序列為序列表中序列12 ;所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列為 序列表中序列13 ;所述丙酰輔酶A轉移酶的氨基酸序列為序列表中序列14 ;或 步驟⑶中，所述丙酮酸脫羧酶的氨基酸序列為序列表中序列15 ;所述NAD依賴型乙 醛輔酶A脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列16。
4. 根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述3-羥基丙酸 脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1的第116-994位；所述輔酶A依賴型琥 珀酸半醛脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2的第326-1714位；所述丙酰輔 酶A轉移酶的編碼基因的核苷酸序列為序-列表中序列3的第326-1900位；或 步驟（3)中，所述丙酮酸脫羧酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4的第 1001-2671位；所述NAD依賴型乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序 列4的第3-953位；或 步驟（1)中，所述poxB基因的核苷酸序列為序列表中序列18所示；所述lldD基因 的核苷酸序列為序列表中序列5 ;所述adheE基因的核苷酸序列為序列表中序列6 ;所述 ackA-pta基因的核苷酸序列為序列表中序列7 ;或 步驟⑵中，所述ldhA基因的核苷酸序列為序列表中序列8;所述did基因的核苷酸 序列為序列表中序列9。
5. 根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步驟（1)中， 所述大腸桿菌BW25113- Λ Ρ〇χΒ是按照包括如下步驟的方法獲得的：向含有pKD46質粒 的所述大腸桿菌BW25113野生型的感受態(tài)中轉入序列表中序列17所示的DNA片段17,所述 DNA片段17與所述大腸桿菌BW25113野生型的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)敲除所述大腸 桿菌BW25113野生型的所述poxB基因，獲得所述大腸桿菌BW25113-Λ poxB ; 將所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中的所述lldD基因替換為所述3-羥基丙酸脫氫酶 的編碼基因，是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有PKD46質粒的所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB 的感受態(tài)中轉入序列表中序列1所示的DNA片段1，所述DNA片段1與所述大腸桿菌 BW25113-Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所述lldD基因替換為所述3-羥基丙酸 脫氫酶的編碼基因； 將所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中的所述adheE基因替換為輔酶A依賴型琥珀 酸半醛脫氫酶的編碼基因，是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有PKD46質粒的所述大腸桿菌 BW25113- Λ poxB的感受態(tài)中轉入序列表中序列2所示的DNA片段2,所述DNA片段2與所 述大腸桿菌BW25113- Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所述adheE基因替換為所 述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因； 將所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB中的所述ackA-pta基因替換為丙酰輔酶A轉移酶 的編碼基因，是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有PKD46質粒的所述大腸桿菌BW25113- Λ poxB 的感受態(tài)中轉入序列表中序列3所示的DNA片段3,所述DNA片段3與所述大腸桿菌 BW25113- Λ poxB的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)將所述ackA-pta基因替換為所述丙酰輔 酶A轉移酶的編碼基因。
6. 根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步驟⑵中，敲除所述BWPD01的 所述ldhA基因，是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有pKD46質粒的所述BWPD01的感受態(tài)中轉入 序列表中序列10所示的DNA片段10,所述DNA片段10與所述BWPD01的基因組發(fā)生同源重 組，即實現(xiàn)敲除所述BWPD01的所述ldhA基因； 敲除所述BWPD01的所述did基因，是通過如下方法實現(xiàn)的：向含有pKD46質粒的所 述BWPD01的感受態(tài)中轉入序列表中序列11所示的DNA片段11，所述DNA片段11與所述 BWPD01的基因組發(fā)生同源重組，即實現(xiàn)敲除所述BWPD01的所述did基因。
7. 根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，所述丙酮酸脫羧酶 的編碼基因和所述NAD依賴型乙醛輔酶A脫氫酶的編碼基因是通過重組表達載體的形式導 入所述BWPD02中的； 所述重組表達載體具體為將序列表中序列4所示DNA片段插入到pBAD43載體的多克 隆位點后得到的重組質粒。
8. 利用權利要求1-7中任一所述方法制備得到的所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸 桿菌B。
9. 權利要求8所述重組大腸桿菌A或所述重組大腸桿菌B在利用L-乳酸或其鹽合成 S-1，2-丙二醇中的應用。
10. 利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇的方法，為如下（A)或（B): ⑷包括如下步驟：向所述重組大腸桿菌B的培養(yǎng)體系中加入終濃度為200mM的L-乳 酸或其鹽作為底物，于37°C進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中獲得S-1，2-丙二醇； (B)向所述重組大腸桿菌A的培養(yǎng)體系中加入終濃度為200mM的L-乳酸或其鹽作為底 物，于37°C培養(yǎng)至0D600至0. 6-0. 8之間，加入終濃度為2g/L的L-阿拉伯糖作為誘導劑， 于37°C進行發(fā)酵培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中獲得S-1，2-丙二醇。
【文檔編號】C12P7/18GK104109651SQ201410354028
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權日:2014年7月23日
【發(fā)明者】管祥辰, 王麗敏, 于波 申請人:中國科學院微生物研究所