利用大腸桿菌產(chǎn)y-谷氨酰甲胺合成酶高效生產(chǎn)l-茶氨酸的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是一種基因工程菌，含重組質(zhì)粒pET28a-GMAS,質(zhì)粒大小6585bp，GMAS片段大小1308bp,命名為大腸埃希氏菌Escherichiacoli，具有卡納青霉素抗性，異丙基硫代-e-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)y-谷酰胺甲胺合成酶基因，是一種具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。本發(fā)明以谷氨酸和乙胺為底物，操作方法簡(jiǎn)單，便于生產(chǎn)控制，茶氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)效率高，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用大腸桿菌產(chǎn)Y-谷氨酰甲胺合成酶高效生產(chǎn)L-茶氨酸 的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)的 Y -谷氨酰甲胺合成酶來(lái)催化合成L-茶氨酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 茶氨酸（N-乙基-Y -谷氨酰胺）是茶葉特有的一種氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì) 之一，其含量直接決定著茶葉的品質(zhì)。同時(shí)，茶氨酸具有放松神經(jīng)、抗抑郁、抗腫瘤、降血壓、 提高免疫力等醫(yī)藥作用，也可以應(yīng)用與食品領(lǐng)域、如作為功能食品的添加劑等。因此越來(lái)越 受到人們的重視，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量不斷增大。
[0003] 目前，茶氨酸的生產(chǎn)方法，主要有三種。一種是從茶葉中提取。茶葉中茶氨酸含量 低，而且原料來(lái)源受限，茶氨酸產(chǎn)量很低，最終導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高。第二種方法，便是化學(xué)合 成的方法。該方法會(huì)導(dǎo)致毒性物質(zhì)殘留，而且生成物中會(huì)形成D、L-型茶氨酸異構(gòu)體，拆分 精制工藝復(fù)雜。第三種是利用微生物酶法生產(chǎn)L-茶氨酸。目前，專(zhuān)利和文獻(xiàn)所報(bào)道的生 產(chǎn)茶氨酸的酶主要是谷氨酰胺酶（CN1688705A，2005; JP2007185132A)、γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (CN101343618A, 2008;茶葉科學(xué)，2007, 27 (1)，61-66 ;食品工業(yè)科技，2008, 29(2)166-169) 或者谷氨酰胺合成酶等，反應(yīng)底物為谷氨酰胺和乙胺，與化學(xué)合成法相比，不會(huì)產(chǎn)生消旋現(xiàn) 象，轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)條件溫和。已受到了廣泛研究，并已進(jìn)入工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域。然而未見(jiàn)利 用基因工程來(lái)源的Y-谷氨酰甲胺合成酶為催化劑，以更低成本的谷氨酸和乙胺為底物， 高效酶法制備茶氨酸的文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高效轉(zhuǎn)化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的大腸桿菌菌種， 以及該菌種在制備L-茶氨酸中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 總體技術(shù)方案是自然環(huán)境土壤細(xì)菌基因組DNA的提取，γ -谷氨酰甲胺合成酶基因的 克隆，采用合適的表達(dá)載體和限制性?xún)?nèi)切酶，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將Y -谷氨酰甲胺合成酶 基因克隆到合適的宿主細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌。
[0006] 1.自然環(huán)境土壤細(xì)菌基因組DNA的提取：在多處茶樹(shù)根際取樣，按照本領(lǐng)域一般 技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑盒方法提取土壤環(huán)境微生物DNA。
[0007] 2. Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的克?。焊鶕?jù)Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的保守序 列，設(shè)計(jì)引物，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑配制方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增Y-谷氨 酰甲胺合成酶基因。
[0008] 3.表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選：按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、 試劑、完全可與從商業(yè)途徑獲得的載體、限制性?xún)?nèi)切酶和方法，將目標(biāo)基因克隆到載體，轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子。
[0009] 4.重組菌的搖瓶發(fā)酵：按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的步驟、試劑、方法，進(jìn)行搖 瓶發(fā)酵，利用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。
[0010] 5.茶氨酸酶法轉(zhuǎn)化合成工藝：根據(jù)酶本身的活性特征，按照本領(lǐng)域一般技術(shù)人員 熟悉的步驟、試劑、方法，進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化合成實(shí)驗(yàn)，參考文獻(xiàn)報(bào)道，利用液相檢測(cè)茶氨酸的合 成情況。
[0011] 發(fā)明效果 本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在，通過(guò)構(gòu)建高效表達(dá)Y-谷氨酰甲胺合成酶的大腸桿菌工程 菌，在有效獲得高產(chǎn)量重組酶的同時(shí)，能有效利用谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，且轉(zhuǎn)化率 在70%左右，為今后充分利用低成本的谷氨酸工業(yè)化成產(chǎn)L-茶氨酸提供了有效的生產(chǎn)菌 株。
[0012]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】 圖1重組質(zhì)粒（ρΕΤ-GMAS)圖譜 圖2 SDS-PAGE凝膠電泳圖譜 附序列Y-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 1材料與方法 1. 1菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌CfecAericAia co/i)DH5a、BL21 (DE3)菌株及質(zhì)粒載體 pMD18_T simple vector, pET28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。
[0014] L 2試劑和材料 實(shí)驗(yàn)試劑：DNA 聚合酶（Taq DNA Polymerase，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase)，限 制性?xún)?nèi)切酶（AfcoI 和及麗7 I)，T4 DNA Ligase, dNTP，DNA marker DL10, 000, Premixed Protein Marker (Low )均購(gòu)自 Takara公司；Power Soil DNA Isolation Kit 購(gòu)自 MOBIO Laboratories公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公 司；硫酸卡納霉素、氨節(jié)青霉素、IPTG購(gòu)自Genview公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。
[0015] 1.3實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)菌基因組提取、質(zhì)粒提取以及DNA純化回收等均按照試劑盒使用說(shuō)明，大腸桿菌感 受態(tài)的制備、酶切、酶連、載體的轉(zhuǎn)化，瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE等常規(guī)分子生物學(xué)操作 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版（科學(xué)出版社，2002)。
[0016] 1. 3. 1環(huán)境微生物基因組DNA的提取 收集茶園茶樹(shù)根際土壤，按照試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit使用說(shuō)明，提取 根際土壤微生物基因組DNA。
[0017] 1. 3. 2目標(biāo)基因Y-谷氨酰甲胺合成酶編碼序列的擴(kuò)增 根據(jù)Genbank登錄的辦sp. MCl (登錄號(hào)NC_015717.1)編碼序列設(shè)計(jì) 一對(duì)引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），引物序列及其酶切位點(diǎn)如下： PF :5' -CATG^rggCTCAGGATCTTGCCCAGCTC-3' (下劃線為 Afco I 酶切位點(diǎn)） PR: 5' -CGCGGAr6TTTAGCAGTCCAGCGTATGTGC-3' (下劃線為及麗7 I 酶切位點(diǎn)）。
[0018] 1. 3. 3反應(yīng)體系及條件： PCR反應(yīng)體系（50 μ?) : 5XPCRbuffer 10 μ?，dNTP 4 μ?，引物PF 和 PR(10 μΜ) 各 1 μ 1，模板 〇· 5 μ 1，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 0· 5 μ 1，水至 50 μ 1。
[0019] PCR 反應(yīng)條件（Touch down PCR) :95°C 5min ;98°C 10 sec，60-51 °C 10 sec，72 °C延伸 I. 5 min，10 個(gè)循環(huán)；98 °C 10 sec，55 °C 10 sec，72 °C延伸 I. 5 min，20 個(gè)循環(huán)； 72°C 10 min反應(yīng)終止。0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及純化PCR產(chǎn)物。
[0020] PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)體系（20 μ 1):取14. 5 μ I PCR產(chǎn)物，加入2μ I IOXTaq Buffer，3yl dNTP，2 U Taq DNA Polymerase，72 °C反應(yīng) 20?30 min 后直接純化回收。
[0021] 1. 3. 4目標(biāo)基因克隆載體的構(gòu)建與鑒定 按照PMD18-T simple vector試劑盒操作說(shuō)明，連接目標(biāo)基因與T載體，轉(zhuǎn)化萬(wàn). DH5ci，利用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并選擇部分轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程(上海）股份有限 公司測(cè)序。
[0022] 1. 3. 5目標(biāo)基因克隆及鑒定 在相關(guān)克隆子的測(cè)序結(jié)果中，選擇攜帶興趣基因的轉(zhuǎn)化子，37 °C過(guò)夜搖瓶培養(yǎng)，提取 重組質(zhì)粒，利用AfcoI和及_7 I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收目標(biāo)基因。
[0023] 同時(shí)利用AfcoI和及?" I雙酶切pET28a載體，并瓊脂糖凝膠回收載體產(chǎn)物。
[0024] 然后，利用T4連接酶16 °C過(guò)夜酶連pET28a載體和目標(biāo)基因，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凡 DH5 a (CaCl2法），選擇部分轉(zhuǎn)化子經(jīng)生工生物工程(上海）股份有限公司測(cè)序。
[0025] 選擇測(cè)序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒（pET-GMAS)轉(zhuǎn)化凡co/i BL21(CaCl2 法）。
[0026] 1.3.6重組蛋白的表達(dá) 挑取重組菌凡co/i BL21接種于含有硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩過(guò)夜 培養(yǎng)。將培養(yǎng)物接種于新鮮的含有硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，接種量2%，500 mL搖瓶 37^振蕩培養(yǎng)至00_=0.6?0.8。301：1?了6誘導(dǎo)（終濃度0.31111)，311后離心收集細(xì)胞 ；20 mMTris-Cl (pH8. 0)重懸細(xì)胞，超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和 沉淀。帶有空載的凡co/i BL21作為陰性對(duì)照。
[0027] L 3. 7酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸 如1. 3. 6,發(fā)酵完畢，5000r/min，離心IOmin收集菌體。IOOmL發(fā)酵液菌體濃縮至10mL， 溶解于20mM的Tris-Cl緩沖液（pH8. 0)，超聲破碎10min。茶氨酸合成反應(yīng)體系參考文 獻(xiàn)（Biosci. Biotechnol. Biochem.，71(2)，545 - 552，2007)，含有 50mM 谷氨酸，150mM 乙胺鹽酸鹽，7. 5mMATP、30mM MgCl2，100mM咪唑緩沖液（pH7. 75)，適量的細(xì)胞破碎后酶液， 30°C溫育。茶氨酸的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)（Process Biochemistry, 45 ,1330 - 1333,2010)。
[0028] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1以環(huán)境微生物基因組DNA為模板的Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的PCR擴(kuò)增 以PF和PR為引物，以土壤環(huán)境基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增到約1300 bp左右的DNA 片段。
[0029] 2.2目標(biāo)基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple載體酶連，轉(zhuǎn)化萬(wàn).co/i DH5a，并利用藍(lán)白斑篩選陽(yáng) 性克隆，收獲了大約500個(gè)左右的轉(zhuǎn)化子。
[0030] 2. 3目標(biāo)基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 選擇經(jīng)過(guò)測(cè)序的興趣基因轉(zhuǎn)化子，提取克隆載體，并雙酶切收獲目標(biāo)基因，酶連雙酶消 化的pET28a載體，轉(zhuǎn)化萬(wàn).co/i DH5a。選擇陽(yáng)性克隆子，提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR及雙 酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明酶連成功，重組載體圖譜如圖1。
[0031] 2.4重組蛋白的表達(dá) 重組大腸桿菌BL21 (pET-GMAS)，在IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析， 在大約44. 3kDa左右出現(xiàn)清晰的蛋白條帶（圖2)，即為γ -谷氨酰甲胺合成酶；誘導(dǎo)后，菌 體經(jīng)超聲破碎后取樣上清SDS-PAGE電泳，可見(jiàn)該蛋白在上清中存在，具有良好的可溶性。
[0032] 2. 5酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸 按照1. 3. 7所述轉(zhuǎn)酶化方法，離心收集菌體，細(xì)胞破碎，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)8小時(shí)連續(xù) 轉(zhuǎn)化，12000rpm離心。按照1. 3. 7所述進(jìn)行液相檢測(cè)，谷氨酸轉(zhuǎn)化率為69. 8%，表明重組酶 具有良好的酶轉(zhuǎn)化活性。
【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)Y-谷氨酰甲胺合成酶的菌株，該菌株為大腸桿菌基因工程菌，其特征在 于該菌株為用重組基因工程質(zhì)粒PET28-GMAS轉(zhuǎn)化大腸桿菌得來(lái)。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其宿主菌選自大腸桿菌BL21、 DH5a。
3. 如權(quán)利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重組基因工程質(zhì)粒PET28-GMAS含 有如說(shuō)明書(shū)中野生Y-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求1-3所述的任一權(quán)利要求所述基因工程菌主要用于生產(chǎn)L-茶氨酸。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104212757SQ201410316269
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】馬承國(guó), 程占冰, 王開(kāi)成 申請(qǐng)人:上海凱圣生物科技有限公司