一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述方法包括以下步驟：選取待測(cè)水稻和對(duì)照水稻，選取的所述對(duì)照水稻為未感染白葉枯病但與待測(cè)水稻在相同條件下栽培的水稻；分別分離所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的總miRNA基因；分別檢測(cè)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達(dá)量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；根據(jù)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的miRNA166b基因的表達(dá)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功，若成功，進(jìn)一步判定所述待測(cè)植株是否感染白葉枯病。本發(fā)明提供的預(yù)測(cè)方法獲得了成功，可以在水稻白葉枯病癥出現(xiàn)前數(shù)天實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確預(yù)報(bào)，為早防早治贏得了時(shí)間，減少了白葉枯病對(duì)水稻造成的損失。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國(guó)主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞洲稻區(qū)發(fā)生尤重。白葉枯病發(fā)病率高、傳染快，發(fā)病稻田減產(chǎn)20-30%，甚至50%。與大部分病害一樣，白葉枯病發(fā)病早期防治效果較佳。發(fā)病中后期，病菌已大量繁殖，已對(duì)水稻造成了傷害，防治效果較差。由此可見(jiàn)，早期預(yù)報(bào)是水稻白葉枯病預(yù)防的關(guān)鍵所在。
[0003]傳統(tǒng)水稻白葉枯病預(yù)報(bào)主要依據(jù)氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害歷史等進(jìn)行推測(cè)，也可依據(jù)田間水稻白葉枯病癥狀表現(xiàn)，對(duì)后期病情發(fā)展進(jìn)行預(yù)報(bào)。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題:
[0005]根據(jù)天氣、氣候、品種抗性、栽培現(xiàn)狀和歷史等進(jìn)行的預(yù)報(bào)結(jié)果是很模糊的，可說(shuō)明在一定區(qū)域與時(shí)間范圍內(nèi)病害發(fā)生的概率，但不能預(yù)報(bào)病害發(fā)生的具體時(shí)間與地點(diǎn)，預(yù)報(bào)結(jié)果的可應(yīng)用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預(yù)報(bào)的氣候條件，但不能確定高溫高濕下病害是否一定出現(xiàn)、在那塊田出現(xiàn)、在那天出現(xiàn)。由于以上的不確定性，農(nóng)民不能決定是否開(kāi)始防治白葉枯、對(duì)哪塊田進(jìn)行防治、以及何時(shí)防治。同時(shí)，病癥出現(xiàn)表明白葉枯病已進(jìn)入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調(diào)查進(jìn)行預(yù)報(bào)的工作也無(wú)太大實(shí)際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中水稻白葉枯病預(yù)報(bào)不及時(shí)、不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法。所述技術(shù)方案如下:
[0007]選取9311水稻品種作為待測(cè)水稻和對(duì)照水稻；
[0008]栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻；
[0009]分別分離所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的總miRNA基因；
[0010]分別檢測(cè)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達(dá)量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示；
[0011]根據(jù)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的miRNA166b基因的表達(dá)量,判定實(shí)驗(yàn)是否成功，若成功，則進(jìn)一步判定所述待測(cè)植株是否感染白葉枯病。
[0012]具體地，所述栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻時(shí)，所述對(duì)照水稻在栽培時(shí)采用保護(hù)性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護(hù)性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對(duì)照水稻與所述待測(cè)水稻的栽培條件保持一致。
[0013]進(jìn)一步地，所述保護(hù)性栽培措施包括對(duì)土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0014]具體地，在上午8:55~9:05利用所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻的相同葉片的相同部位進(jìn)行所述總miRNA基因的分離。
[0015]具體地，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA166b基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量。
[0016]進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)定量PCR方法的前處理步驟包括:
[0017]利用分光光度計(jì)測(cè)定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；
[0018]向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05 %，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0019]將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液；
[0020]將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。
[0021]進(jìn)一步地，所述采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA166b基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量，包括:
[0022]將2 μ I所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3 μ I濃度為I μ M的引物、10 μ I定量PCR混合物和
0.4 μ I 50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)程序?yàn)?50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，67°C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67V 30秒這兩步在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量所述表達(dá)量的多少；
[0023]所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA166b基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA166b基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
[0024]進(jìn)一步地，將所述總miRNA基因的5’端與3’端連接的步驟包括:
[0025]取5 ng所述第一混合液、2 μ I 1X反應(yīng)緩沖液、I μ I 50mM的MnCl2、4 μ I 5Μ的甜菜堿和I μ I 5 u/μ I的環(huán)化酶，用水補(bǔ)足20μ I后混勻，得到第三混合液，將所述第三混合液于60°c保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活，得到所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液。
[0026]進(jìn)一步地，將所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括:
[0027]取所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5μ1濃度為I μΜ的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5 μ I濃度為100 mM的DTT和20 U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補(bǔ)足50 μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括mi RNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示。
[0028]具體地，所述判定實(shí)驗(yàn)是否成功方法為:若所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值小于1.5，則實(shí)驗(yàn)成功；若所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的大于等于1.5，則實(shí)驗(yàn)不成功。
[0029]具體地，判定所述待測(cè)植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測(cè)水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量小于2倍所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量，則所述待測(cè)水稻未感病；若所述待測(cè)水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量大于或等于2倍的所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量，則所述待測(cè)水稻感病。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是:本發(fā)明提供的一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法，可將miRNA166b基因的表達(dá)變化可作為水稻感染白葉病菌的標(biāo)志物，用以明確待測(cè)水稻是否染病，以及明確發(fā)病的時(shí)間與田塊，避免了傳統(tǒng)病害預(yù)報(bào)的模糊性。同時(shí)，本發(fā)明的預(yù)測(cè)時(shí)間早，可在水稻感染白葉枯病24小時(shí)內(nèi)作出預(yù)報(bào)。

【具體實(shí)施方式】
[0031]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明中未標(biāo)注說(shuō)明的試劑均為常用市售試劑，在大多數(shù)生物技術(shù)公司均可購(gòu)買(mǎi)到且效果幾乎無(wú)差別。
[0032]實(shí)施例
[0033]本發(fā)明實(shí)施例將9311水稻品種作為待測(cè)水稻和對(duì)照水稻，其中，待測(cè)水稻是指種植于大田正常栽培條件下，需要監(jiān)控是否感染白葉枯病的水稻；對(duì)照水稻是指通過(guò)保護(hù)性技術(shù)措施和白葉枯病防治措施，確保其為沒(méi)有感染白葉枯病的健康水稻，除保護(hù)性栽培措施和防治白葉枯病外，對(duì)照水稻與待測(cè)水稻的栽培條件保持一致，其中，保護(hù)性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0034]種子的選取:待測(cè)水稻的種子和對(duì)照水稻的種子均收獲于健康的9311水稻植株，并且種子表面無(wú)明顯病蟲(chóng)害危害癥狀。
[0035]種子的前處理、播種與栽培條件:對(duì)照種子與待測(cè)種子均用濃度為70%的酒精浸泡2分鐘，再用去離子水洗2次，在30°C的水中浸泡過(guò)夜，在30°C的溫度下對(duì)種子進(jìn)行催芽，種子出芽后播種。
[0036]從待測(cè)水稻生長(zhǎng)的田塊中取土壤，利用滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)，型號(hào)為YSQ-LS-50S11)對(duì)土壤進(jìn)行高溫高壓消毒滅菌，消毒滅菌條件為:120°C，30分鐘。消毒后的土壤作為對(duì)照水稻的種植土壤。將對(duì)照水稻在隔離條件下播種、移栽、生長(zhǎng)于填有消毒土壤的塑料盆中，待測(cè)水稻則種植于大田環(huán)境中，栽培待測(cè)水稻和對(duì)照水稻時(shí)，除保護(hù)性栽培措施與白葉枯病防治措施外，待測(cè)水稻與待測(cè)水稻的栽培條件保持一致。
[0037]保護(hù)性栽培措施包括:(I) 土壤隔離:利用盆栽，使對(duì)照水稻生長(zhǎng)的土壤與大田土壤隔離，避免通過(guò)土壤傳病感染白葉枯病；(2)水源隔離:采用自來(lái)水灌溉對(duì)照水稻，確保大田水源不進(jìn)入對(duì)照水稻，避免通過(guò)水源感染白葉枯病；(3)空間隔離:對(duì)照水稻周?chē)?0米不種植其它水稻，避免與帶白葉枯菌的水稻葉片摩擦感染白葉枯病。待測(cè)水稻不防治白葉枯病，除保護(hù)性栽培措施與白葉枯病防治措施外對(duì)照水稻與待測(cè)水稻的栽培條件盡可能保持一致，包括播種、移栽、施肥、防蟲(chóng)、防病(除白葉枯病外其它病害)等生產(chǎn)管理措施同時(shí)、同步進(jìn)行。
[0038]具體地，在對(duì)照水稻周?chē)?0米范圍內(nèi)，不播種或種植其它水稻；對(duì)照水稻灌溉水采用干凈的自來(lái)水；除以上條件外，對(duì)照與待測(cè)水稻的其它栽培條件與普通大田常規(guī)栽培條件相同，但所有栽培措施在對(duì)照水稻與待測(cè)水稻間保持一致，如播種、移栽、施肥、防蟲(chóng)、防病(除白葉病外其它病害)等生產(chǎn)管理措施同時(shí)、同步進(jìn)行。本次試驗(yàn)中，播種期為2010年11月27日，地點(diǎn)為海南瓊海。
[0039]將對(duì)照水稻和待測(cè)水稻采用相同的栽培條件種植，使對(duì)照水稻和待測(cè)水稻能夠在相同的條件下生長(zhǎng)，保證對(duì)照水稻和待測(cè)水稻的表達(dá)量不受栽培條件的影響。
[0040]在需要預(yù)報(bào)白葉枯病是否發(fā)生的時(shí)期，如苗期和破口期至抽穗揚(yáng)花期，在上午8:55~9:05分別取倒數(shù)第二片中部2/3的部位的葉片。每次對(duì)照水稻與待測(cè)水稻各取至少3片葉片混合，用于代表對(duì)照水稻與待測(cè)水稻的樣本。所取葉片立即置于液氮中保存至總miRNA基因的提取。在本實(shí)施例中，取樣時(shí)間段為2011年2月28號(hào)至當(dāng)年3月3號(hào)，連續(xù)取樣5天，共獲得對(duì)照水稻與待測(cè)水稻各5個(gè)樣本，分別編號(hào)為Cl~C5和Tl~T5，其中C表示Control, T表示Treatment,其中，對(duì)照水稻與待測(cè)水稻取樣的時(shí)間點(diǎn)是一致的,對(duì)照水稻和待測(cè)水稻所選取的葉片位置也是相同的，這能夠使對(duì)照水稻和待測(cè)水稻之間的生物時(shí)鐘與發(fā)育狀態(tài)是相同的，只有選取生物時(shí)鐘與發(fā)育狀態(tài)均相同的葉片才能進(jìn)一步保證對(duì)照水稻和待測(cè)水稻間的miRNA表達(dá)量比較不受生物時(shí)鐘與發(fā)育的影響。
[0041]分離總miRNA基因:利用miRNA基因分離試劑盒(miRNA基因分離試劑盒為市售，貨號(hào):R6727，生產(chǎn)公司:0mega，該試劑盒具體包括:RNA離心柱、基因組DNA去除離心柱、離心管、MCL裂解緩沖液、XD結(jié)合緩沖液、RNA洗脫液II和DEPC水)分離上述Cl~C5和Tl~T5水稻葉片中的總miRNA基因。
[0042]具體操作方法如下:從液氮中分別取出Cl~C5和Tl~T5水稻葉片樣本，分別置于10個(gè)研缽中，并立即向研缽中倒入液氮，充分研磨，分別研磨可以避免交叉污染。向每個(gè)研缽中取大約10mg研磨好的粉末置于1.5ml的離心管中，加700 μ L的裂解液，渦旋30秒以混勻樣品，55°C保溫30分鐘，在離心力為12000Xg的室溫條件下離心5分鐘，得到上清液，并將上清液轉(zhuǎn)移至離心柱中離心，用于去除基因組中的DNA，經(jīng)12000Xg室溫離心2分鐘，并將流出的液體轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mL的離心管中，向該流出的液體中加入該液體體積1.1倍的無(wú)水乙醇并渦旋20秒混勻，將該渦旋后的液體轉(zhuǎn)移至RNA離心柱中經(jīng)12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L濃度為96-100%的乙醇到RNA離心柱中，再經(jīng)12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L XD結(jié)合緩沖液到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，再加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，將RNA離心柱在大于12000Xg的最大速度下，室溫離心2分鐘，向RNA離心柱中加入30-50 μ L DEPC水，室溫下放置5分鐘后，在大于12000 Xg的最大速度下，室溫離心I分鐘，離心獲得的液體即為含有總miRNA基因的溶液，將該溶液保存于_70°C備用。
[0043]實(shí)時(shí)定量PCR(polymerase chain react1n,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法的前處理步驟包括:
[0044]總miRNA基因的定量:利用分光光度計(jì)(分光光度計(jì)由美國(guó)Quawell公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中RNA定量程序，測(cè)定并獲得分離的總miRNA基因的濃度，根據(jù)濃度與體積計(jì)算總miRNA基因的質(zhì)量。
[0045]向分離的總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液:外源參考miRNA基因的加入量為分離的總miRNA基因質(zhì)量的0.05%，外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，其由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
[0046]miRNA基因環(huán)化:取含有約5ng總miRNA基因的第一混合液、2 μ I 1X反應(yīng)緩沖液、I μ I 50 mM的MnCl2、4 μ I 5 M的甜菜堿和I μL 5 u/μ I的環(huán)化酶,用水補(bǔ)足20 μ I后混勻，得到第三混合液；將第三混合液于60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活。將總miRNA基因和外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，獲得環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液，該混合液用于滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄。其中，環(huán)化酶由美國(guó)Epicentre公司生產(chǎn)，貨號(hào)為CL9021K。隨該酶一起提供的還有:10X反應(yīng)緩沖液、50mM的MnCl2、5M的甜菜堿和無(wú)酶水。
[0047]環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液的逆轉(zhuǎn)錄:取環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5y I濃度為100 mM的DTT、20 U的逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrigen公司生產(chǎn),貨號(hào)為18064-014)和5μ I 1X的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(隨逆轉(zhuǎn)錄酶一起提供)，用水補(bǔ)足50 μ I混勻后，42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活。該逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；據(jù)此設(shè)計(jì)的miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物如序列表中SEQ ID N0:7所示；外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示，上述逆轉(zhuǎn)錄引物均由美國(guó)Invitrigen公司合成。其中，逆轉(zhuǎn)錄包括兩類(lèi)，一類(lèi)為目標(biāo)基因，即miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄，另一類(lèi)為外源參考miRNA基因(外源參考miRNA基因命名為ECK基因)的逆轉(zhuǎn)錄，兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程平行進(jìn)行，且所有反應(yīng)成份與條件均相同，僅逆轉(zhuǎn)錄引物不一致。對(duì)于miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)說(shuō)，所設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄引物的最后一個(gè)堿基(決定引物特異性的關(guān)鍵堿基)不能與miRNA166家族中miRNA166c和miRNA166g兩個(gè)成員配對(duì)，因而不能對(duì)它們進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，降低了它們對(duì)結(jié)果的干擾。在前期研究中發(fā)現(xiàn):除miRNA166b、miRNA166c和miRNA166g外，miRNA166家族中其它成員要么在感染白葉枯病24小時(shí)內(nèi)，表達(dá)也上升2倍以上，要么表達(dá)量?jī)HmiRNA166b的1/20左右，而miRNA166b在感染白葉枯后24小時(shí)內(nèi)，表達(dá)量上升了 4倍以上，因此，上升2倍是一個(gè)寬松的判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，在逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)時(shí)，并不刻意區(qū)分除miRNA166c和miRNA166g外的miRNA166家族的其它成員，因?yàn)樗鼈儾⒉桓蓴_對(duì)結(jié)果的判斷。
[0048]實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量:實(shí)時(shí)定量PCR同樣包括兩類(lèi)，一類(lèi)為目標(biāo)基因，即miRNA166b基因的實(shí)時(shí)定量，另一類(lèi)為外源參考miRNA基因的實(shí)時(shí)定量，二者平行進(jìn)行，所有反應(yīng)成份與條件均相同，僅引物不相同。引物包括:miRNA166b基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:3所示；miRNA166b基因反向引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所不,其中設(shè)計(jì)的miRNA166b的反向引物和最后一個(gè)喊基(決定引物特異性的關(guān)鍵喊基)不能與miRNA166家族中miRNA166c和miRNA166g兩個(gè)成員配對(duì)，因而不能對(duì)它們進(jìn)行PCR擴(kuò)增，降低了它們對(duì)結(jié)果的干擾。在前期研究中發(fā)現(xiàn):除miRNA166b、miRNA166c和miRNA166g外，miRNA166家族中其它成員要么在感染白葉枯病24小時(shí)時(shí)內(nèi)，表達(dá)也上升2倍以上，要么表達(dá)量?jī)HmiRNA166b的1/20左右，而miRNA166b在感染白葉枯后24小時(shí)內(nèi)，表達(dá)量上升了 4倍以上，因此，上升2倍是一個(gè)寬松的判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，在定量PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)，并不刻意區(qū)分除miRNA166c和miRNA166g外的miRNA166家族的其它成員他們，因?yàn)樗鼈儾⒉桓蓴_對(duì)結(jié)果的判斷。引物還包括:外源參考miRNA基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；外源參考miRNA基因反向引物序列為如序列表中SEQ ID N0:6所示。實(shí)時(shí)定量PCR引物均由美國(guó)Invitrigen公司合成。
[0049]實(shí)時(shí)定量PCR方法的具體步驟如下:取2 μ I上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3 μ I濃度為I μ M的引物(這里的引物指正向引物和反向引物等摩爾比混合物，即指序列如序列表中SEQ IDΝ0:3所示的miRNA166b基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA166b基因反向引物的等摩爾比的混合物，或者指序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物的等摩爾比的混合物)、10 μ I日本Toyobo公司生產(chǎn)的定量PCR混合物(貨號(hào)為QPS-201)和0.4 μ 150倍的ROX熒光校正染料(由日本Toyobo公司生產(chǎn)，并且隨QPS-201—起提供)混合均勻，得到第二混合液，將該第二混合液在ABI StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀中按如下程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè):50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，670C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和
0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量表達(dá)量的多少。實(shí)時(shí)定量的結(jié)果由Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)處理時(shí)以外源參考miRNA基因?yàn)閙iRNA166b表達(dá)分析的參考基因。結(jié)果見(jiàn)表1:
[0050]表1 miRNA166b基因在對(duì)照水稻與待測(cè)水稻間的相對(duì)表達(dá)量
[0051]

【權(quán)利要求】
1.一種利用miRNA166b基因預(yù)報(bào)水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 選取9311水稻品種作為待測(cè)水稻和對(duì)照水稻； 栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻； 分別分離所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的總miRNA基因； 分別檢測(cè)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達(dá)量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示； 根據(jù)所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的miRNA166b基因的表達(dá)量，判定實(shí)驗(yàn)是否成功，若成功，則進(jìn)一步判斷所述待測(cè)植株是否 感染白葉枯病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻時(shí)，所述對(duì)照水稻在栽培時(shí)采用保護(hù)性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護(hù)性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對(duì)照水稻與所述待測(cè)水稻的栽培條件保持一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護(hù)性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8:55~9:05利用所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻的相同葉片的相同部位進(jìn)行所述總miRNA基因的分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA166b基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR方法的前處理步驟包括: 利用分光光度計(jì)測(cè)定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度； 向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質(zhì)量的0.05%，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示； 分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環(huán)化的所述總miRNA基因和環(huán)化的所述外源參考miRNA基因的混合液； 將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于進(jìn)行所述實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)所述miRNA166b基因在所述待測(cè)水稻和所述對(duì)照水稻中的表達(dá)量，包括: 將2 μ I所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3 μ I濃度為I μ M的引物、10 μ I定量PCR混合物和0.4μ I 50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)程序?yàn)?50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66V 30秒，67°C 30秒，共45個(gè)循環(huán)，其中，66°C 30秒和67V 30秒在每循環(huán)一次后分別增加0.1°C和0.2°C，在每一次循環(huán)的最后一步收集熒光信號(hào)，所述熒光信號(hào)的強(qiáng)弱用于衡量所述表達(dá)量的多少； 所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID N0:3所示的miRNA166b基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA166b基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環(huán)化的總miRNA基因和所述環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的步驟包括: 取所述環(huán)化的總miRNA基因和環(huán)化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉(zhuǎn)錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5 μ I濃度為10mM的DTT和20 U的逆轉(zhuǎn)錄酶，用水補(bǔ)足50 μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時(shí)，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述逆轉(zhuǎn)錄引物包括miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物，所述miRNA166b基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄引物序列如序列表中 SEQ ID NO:8 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定實(shí)驗(yàn)是否成功的方法為:若所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值小于1.5，則實(shí)驗(yàn)成功；若所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量最大值與表達(dá)量最小值的比值大于等于1.5，則實(shí)驗(yàn)不成功。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，判定所述待測(cè)植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測(cè)水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量小于2倍所述對(duì)照水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量，則所述待測(cè)水稻未感??；若所述待測(cè)水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量大于或等于2倍的所述對(duì)照 水稻的miRNA166b基因的表達(dá)量，則所述待測(cè)水稻感病。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131076SQ201410305410
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】馮濤, 陳利紅 申請(qǐng)人:江漢大學(xué)