利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法及其培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的組成成分為每升蒸餾水中包含有：葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂0.4-0.6g/L、氯化鐵0.004-0.006g/L，將上述組分以蒸餾水溶解，定容至1L，再以NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.0，然后在121℃下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得所需培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，能顯著提高海洋印尼紅藻共生真菌Daldiniaeschscholzii生產(chǎn)免疫抑制化合物DalesconolA和DalesconolB的產(chǎn)量。
【專利說明】利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法及其培養(yǎng)基
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學領域，具體涉及用于生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基【技術領域】，更具體地，涉及利用海洋印尼紅藻共生真菌Daldinia eschscholzii生產(chǎn)免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B的方法及其所用培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]海洋微生物是生物功能天然產(chǎn)物的重要來源之一，從海洋中尋找天然活性物質(zhì)正在成為新藥開發(fā)的研究熱點。海洋生物生活在高壓、低營養(yǎng)、低溫(特別是深海)、無光照以及局部的高溫和高鹽等環(huán)境中,造成了海洋微生物的多樣性和特殊性。海洋微生物由于適應了海洋環(huán)境，有了新的特異性，能產(chǎn)生陸棲微生物所不能產(chǎn)生的結構新穎、作用特殊的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)將極大地克服機體的抗藥性，同時為新藥研發(fā)提供新的先導化合物，可以作為重要的海洋藥物資源。
[0003]南京大學譚仁祥教授從海洋印尼紅藻(CraciJaria sp.5K?_7)分離得到了海洋印尼紅藻共生真菌escAscAohii，其屬于光輪層炭殼菌。該菌經(jīng)過液體或固體發(fā)酵可產(chǎn)生多種代謝物質(zhì)。Dalesconol A (簡稱DA)和Dalesconol B (簡稱DB)是其產(chǎn)生的一種聚酮類次級代謝物，其體外的T細胞增殖實驗表明DA和DB具有顯著的免疫抑制效應(IC50:
0.16~0.58 μ g/mL)，同目前臨床上使用最多的環(huán)孢素A相近(IC5tl: 0.06 μ g/mL)，而且相較于環(huán)孢素A，DA和DB具 有選擇性更廣、副作用更小的優(yōu)點，是一種具有良好前景的免疫抑制候選藥物。
[0004]然而，化合物DA和DB在初始環(huán)境下的產(chǎn)率相當?shù)?，已成為制約DA和DB用于臨床前研究的瓶頸。因此需要通過優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境來使得化合物DA和DB獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)。但微生物發(fā)酵是一個極其復雜的生物過程，涉及到許多相互影響的因素，產(chǎn)物生物合成水平受到很多方面的影響，其中適宜的培養(yǎng)基是微生物發(fā)酵的一個關鍵性因素。因此，針對該菌種的培養(yǎng)基進行優(yōu)化顯得十分重要。
[0005]目前比較成熟的優(yōu)化培養(yǎng)基的方法有單因素實驗、Plackett-Burman (篩選試驗設計，簡稱PB)設計、正交實驗、響應面設計等。
[0006]其中，Plackett-Burman設計,可對多個不同因子對響應值的顯著性進行分析,從而找出對發(fā)酵產(chǎn)量或細胞生長最為重要的培養(yǎng)基組分，該方法分別對每個因子取高(+1)和低(-1 )兩個水平，通過每個因子兩水平之間的差異與整體差異之間的統(tǒng)計分析來確定各因子對相應變量的顯著性。該方法可大大提高篩選效率，能以最少的試驗次數(shù)使因素的主效果得到盡可能精確的估計。
[0007]響應面設計方法由Box-Wilson方法發(fā)展而來的，它是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過響應面和等高線分析，能夠精確地研究各因子與響應變量之間的關系，優(yōu)化出最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。響應面法是一種適用性強的實驗設計方法，包括實驗設計、建模及尋求因子水平最佳操作條件等功能，顯示出了其他方法所不具備的優(yōu)點。該方法不但具備試驗次數(shù)少，周期短、精度高等優(yōu)點，而且可以對各因子水平及其交互作用進行優(yōu)化和評價，可快速有效的確定多因子系統(tǒng)的最佳條件。
[0008]因此，通過聯(lián)用PB設計和響應面設計，可以通過搖瓶實驗確定重要因素，再針對重要因素得到最佳的組分水平，從而可大大加快獲得最佳的培養(yǎng)基組成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的主要目的就是針對以上現(xiàn)狀，解決限制對免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B深入研究的瓶頸問題,提供一種用于發(fā)酵海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii生產(chǎn)免疫抑制劑Dalesconol A和Dalesconol B的培養(yǎng)基及其制備方法,及使用該培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)Dalesconol A和Dalesconol B的方法。該培養(yǎng)基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，而使用該培養(yǎng)基發(fā)酵海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii 生產(chǎn)免疫抑制劑 Dalesconol A 和 Dalesconol B,能顯著提高 Dalesconol A和Dalesconol B 的產(chǎn)量。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基，其組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀 0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂 0.4-0.6g/L、氯化鐵 0.004-0.006g/L。
[0011]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案之一，所述培養(yǎng)基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麥芽浸膏37.5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鐵0.005g/L。
[0012]一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基之制備方法，該制備方法的步驟為:
將葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵加入蒸餾水中定容至1L，使上述成分在培養(yǎng)基中的終濃度分別為11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、
0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 6.5-7.0，然后在 121 °C下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基。
[0013]一種利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法，該方法包括如下步驟:
a.將冷凍保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,在固體平板培養(yǎng)基中央進行點樣并活化培養(yǎng)7-10天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，固體平板培養(yǎng)基每隔30天重新活化一次；
b.從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)3-4天，獲得新鮮種子液；
c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入權利要求1和2任一項所述培養(yǎng)基，以28±2° C、180±20 rpm搖床振蕩培養(yǎng)6_8天后，獲得發(fā)酵液；以及
d.取所述發(fā)酵液進行抽提、萃取、純化，獲得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
[0014]其中，所述海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii是一種光輪層炭殼菌。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的一種利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法及其培養(yǎng)基的主要優(yōu)點如下:本發(fā)明的培養(yǎng)基成分簡單，制備方法操作方便，成本低廉，不需特殊設備，能顯著提高海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii生產(chǎn)免疫抑制化合物Dalesconol A和Dalesconol B 的產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為基于Plackett-Burman實驗結果，以葡萄糖(Xl)為確定最優(yōu)區(qū)域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖2為基于Plackett-Burman實驗結果，以尿素(X2)為確定最優(yōu)區(qū)域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖3為基于Plackett-Burman實驗結果，以麥芽浸膏(X3)為確定最優(yōu)區(qū)域的中心點而進行的單因素的實驗結果圖；
圖4-6為利用Design Expert 8.0數(shù)據(jù)處理軟件,建立回歸方程后獲得的三個因子葡萄糖、尿素、麥芽浸膏對Dalesconol A和Dalesconol B產(chǎn)量的響應面分析圖。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。
[0018]本發(fā)明所用菌種、培養(yǎng)基為:
菌種:海洋真菌eschscholzii是由南京大學譚仁祥教授課題組從海洋印尼HiGreicileiriei sp.S GR-1)中分離的一株能夠生產(chǎn)免疫抑制化合物的絲狀真菌,鑒定此菌為光輪層炭殼菌屬。
[0019]培養(yǎng)基制備:葡萄糖20g、尿素lg、麥芽浸膏20g、磷酸二氫鉀0.5g、七水硫酸鎂
0.5g、氯化鐵0.005g，瓊脂20g (固體培養(yǎng)基)，加入蒸餾水中定容至1L，再以NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.0，然后在121°C下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物
的培養(yǎng)基。
[0020]以下給出發(fā)酵操作過程以及Dalesconol A和Dalesconol B的檢測方法:
I)發(fā)酵操作過程
將-4°C保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,用接種針在固體平板培養(yǎng)基中央進行點樣，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱，活化培養(yǎng)7-10天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，然后置于4°C冰箱保存。然后用接種鏟從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊5X5 mm瓊脂塊,接種至裝有400 ml種子培養(yǎng)基的100ml搖瓶中，以28。C、180 rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)3_4天，獲得新鮮種子液。取新鮮種子液，按5-20% (v/v)的接種量接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基，以28° C、180 rpm搖床振蕩培養(yǎng)6_8天，獲得發(fā)酵液。
[0021]2) Dalesconol A 和 Dalesconol B 的產(chǎn)量檢測
取50 ml所獲發(fā)酵液于250 ml錐形瓶中，加入50 ml乙酸乙酯和30顆直徑為3 mm的玻璃珠，密封后，置于28°C和200 rpm搖床環(huán)境進行研磨、萃取I小時，并重復三次，然后取3 ml上層有機相進行減壓旋轉蒸餾除去乙酸乙酯；殘留物用I ml無水甲醇溶解；在相對離心力為13780Xg的條件下離心3分鐘后，取500 μ I上清液，用高效液相色譜法測定Dalesconol A和Dalesconol B的含量，進而通過標準曲線換算成所述發(fā)酵液中DalesconolA和Dalesconol B的實際含量。
[0022]本實施例的試驗設計、數(shù)據(jù)分析及檢測結果如下:
1.Plackett-Burman 試驗設計
Plackett-Burman設計,可對多個不同因子對響應值的顯著性進行分析，從而找出對發(fā)酵產(chǎn)量或細胞生長最為重要的培養(yǎng)基組分，分別對每個因子取高(+1)和低(-1 )兩個水平，通過每個因子兩水平之間的差異與整體差異之間的統(tǒng)計分析來確定各因子對相應變量的顯著性。通過Design Expert 8.0數(shù)據(jù)處理軟件設計,本實驗選取影響因素6個,選用了N=12的PB試驗設計表。各參數(shù)所代表的因素及水平見表格(參見表1和表2)。表1中X1,X2, X3，X4，X5和X6分別代表葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵；￥代表免疫抑制化合物Dalesconol A (以下簡稱DA)和Dalesconol B (以下簡稱DB)的產(chǎn)量和。
[0023]表1 Placket-Burman設計實驗結果
【權利要求】
1.一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖11.6-28.4g/L、尿素0.87-2.13g/L、麥芽浸膏17.39-42.61g/L、磷酸二氫鉀0.4-0.6g/L、七水硫酸鎂0.4-0.6g/L、氯化鐵0.004-0.006g/L。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于發(fā)酵培養(yǎng)海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的組成成分為每升蒸餾水中包含有:葡萄糖22.98g/L、尿素1.48g/L、麥芽浸膏37.5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鐵0.005g/L。
3.一種用于發(fā)酵培養(yǎng)海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基之制備方法，其特征在于，該制備方法的步驟為: 將葡萄糖、尿素、麥芽浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鐵加入蒸餾水中定容至1L，使上述成分在培養(yǎng)基中的終濃度分別為11.6-28.4g/L、0.87-2.13g/L、17.39-42.61g/L、0.4-0.6g/L、0.4-0.6g/L、0.004-0.006g/L，再以 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 6.5-7.0，然后在 121。。下滅菌15-30分鐘，滅菌后即得海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的培養(yǎng)基。
4.一種利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化 合物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: a.將冷凍保存的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii解凍后,在固體平板培養(yǎng)基中央進行點樣并活化培養(yǎng)7-10天，獲得新鮮固體平板培養(yǎng)基，固體平板培養(yǎng)基每隔30天重新活化一次； b.從新鮮的海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii的固體平板培養(yǎng)基中挖取I塊瓊脂塊，接種至種子培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)3-4天，獲得新鮮種子液； c.取所述新鮮種子液，按5-20%(v/v)的接種量接入權利要求1和2任一項所述培養(yǎng)基，以28±2° C、180±20 rpm搖床振蕩培養(yǎng)6-8天后，獲得發(fā)酵液；以及 d.取所述發(fā)酵液進行抽提、萃取、純化，獲得免疫抑制化合物DalesconolA和Dalesconol B。
5.根據(jù)權利要求4所述的利用海洋真菌生產(chǎn)免疫抑制化合物的方法，其特征在于，所述海洋印尼紅藻共生真菌eschscholzii是一種光輪層炭殼菌。
【文檔編號】C12P7/26GK104031948SQ201410299672
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權日:2014年6月26日
【發(fā)明者】盧艷花, 潘正驊, 譚仁祥, 焦瑞華, 趙國琰 申請人:華東理工大學, 南京大學