非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法及其應用。該方法包括：（1）將末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金納米粒子的分散液，并加入檸檬酸鈉緩沖液混合均勻、孵育，而后離心去除游離的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸與金納米粒子的復合物；（2）將步驟（1）最終所獲復合物以中性磷酸鹽緩沖液重懸，再次加入所述寡核苷酸、封閉試劑以及氯化鈉溶液，再次孵育，并離心除去游離的所述寡核苷酸及封閉試劑，獲得所述非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物。該方法可應用于DNA的可視化檢測及制備DNA檢測試劑盒。本發(fā)明制備的核酸-納米金穩(wěn)定性高，應用于核酸檢測時具有快速、靈敏、動態(tài)范圍寬、低成本、操作簡便等優(yōu)點，適于推廣應用。
【專利說明】非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法及其應用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于納米金粒子與末端連接多聚腺嘌呤的寡核苷酸形成復合物 的制備方法及其應用，特別是在檢測DNA中的應用，屬于生物【技術(shù)領域】。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA是遺傳信息的承擔者，是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎。由于對每一種生物體來 說，核酸的序列都是獨一無二的。因此，在診斷和識別各種疾病時，這些細菌、病毒、病原體 的核酸序列就成為了研究對象。目前，很多疾病的序列信息已被人們掌握，為了能夠有效抗 擊這些疾病，及早和準確地探測DNA序列顯得尤為重要?；诩{米材料的DNA檢測手段則 在定位、可視化、多重檢測等方面具有很大優(yōu)勢，其中核酸-納米金偶聯(lián)物在核酸檢測中獲 得了廣泛的應用。因此，非常有必要開發(fā)一種簡便、靈敏、成本低廉的檢測DNA的方法。
[0003] 傳統(tǒng)的核酸-納米偶聯(lián)物制備基于Au-S共價鍵實現(xiàn)巰基化寡核苷酸在金納米粒 子表面的自組裝。雖然這種方法已經(jīng)得到廣泛應用，但也存在如下問題需要克服：（一）該 方法制備過程中需要利用高濃度的NaCl驅(qū)使巰基末端修飾的核酸靠近納米金表面，而這 一過程操作非常繁瑣、納米金在高濃度鹽的作用下容易團聚，制備過程重復性差；（二）采用 巰基化的核酸-納米金偶聯(lián)物作為探針與目標核酸雜交，由于所得產(chǎn)物常常聚集程度大， 容易沉淀，檢測的動態(tài)響應范圍比較窄(僅1-2數(shù)量級濃度);(三)巰基化的核酸序列成本較 高；。最近，有研究報道了采用多聚腺嘌呤末端核酸（PolyA-DNA)偶聯(lián)納米金的方法，能夠 提高核酸-納米金探針應用于的核酸檢測的靈敏度，縮短檢測時間，（Langmuir 2012，28， 17053 - 17060)。但是，現(xiàn)有PolyA-DNA偶聯(lián)納米金的制備方法，穩(wěn)定性和重復性較差，且 在應用于核酸檢測時還具有動態(tài)檢測范圍較窄的缺點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法，以克服 現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供所述非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法在檢測 DNA中的應用。
[0006] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種可視化DNA檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種DNA檢測試劑盒。
[0008] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括： 一種非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法，包括： (1) 將末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金納米粒子的分散液，并加入檸檬 酸鈉緩沖液混合均勻、孵育，而后離心去除游離的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸與金 納米粒子的復合物； (2) 將步驟（1)最終所獲寡核苷酸與金納米粒子的復合物以中性磷酸鹽緩沖液重懸，再 次加入所述寡核苷酸、封閉試劑以及氯化鈉溶液，再次孵育，并離心除去游離的所述寡核苷 酸及封閉試劑，獲得所述非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物。
[0009] 進一步的，所述封閉試劑可選自dATP或巰基十一烷酸，且不限于此。
[0010] 進一步的，所述金納米粒子的粒徑優(yōu)選為15_50nm。
[0011] 前述任一種方法在檢測DNA或制備DNA檢測試劑盒中的應用。
[0012] 一種可視化DNA檢測方法，包括： 提供5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸及金納米粒子，并采用權(quán)利要求1-2 中任一項所述方法制成作為第一探針的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物； 提供3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸及金納米粒子，并采用權(quán)利要求1-2 中任一項所述方法制成作為第二探針的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物，X > 10 ; 以及，將所述第一探針和第二探針混合，并加入可能含有能夠與所述第一寡核苷酸和 第二寡核苷酸互補雜交的核酸序列的目標DNA的樣品，在適于進行核酸雜交反應的環(huán)境中 進行互補雜交反應，通過測定雜交反應體系的可見光吸收強度變化，實現(xiàn)對樣品的檢測。
[0013] 進一步的，所述可視化DNA檢測方法具體可以包括： 取所述第一探針和第二探針按照1 :1的摩爾比均勻混合，并加入雜交緩沖液和一系列 具有不同濃度的目標DNA標準樣品，形成一系列不同混合體系進行核酸雜交反應，反應結(jié) 束后，檢測一系列不同混合體系可見光光吸收值，由此確定光吸收強度隨目標DNA濃度變 化的標準曲線； 以及，取所述第一探針和第二探針按照1 :1的摩爾比均勻混合，并加入雜交緩沖液和 待檢測樣品進行核酸雜交反應，反應結(jié)束后檢測所獲混合反應物的可見光光吸收值，并依 據(jù)所述標準曲線而計算出待檢測樣品所含目標DNA的濃度。
[0014] 進一步的，所述可見光的波長優(yōu)選為520 nm、650 nm。
[0015] 進一步的，所述雜交緩沖液優(yōu)選采用pH=7. 4,且含有150-300mM NaCl的、濃度為 0. 01M的磷酸鹽緩沖液。
[0016] 一種DNA檢測試劑盒，包括： 第一探針，主要由5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸與金納米粒子經(jīng)前述 任一種方法所制成的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物組成； 第二探針，主要由3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸與金納米粒子經(jīng)前述 任一種方法所制成的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物組成； 以及，用以構(gòu)成適于進行核酸雜交反應的液相環(huán)境的輔助試劑， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別能夠與目標DNA中的不同核酸序列互補 雜交，X彡10。
[0017] 進一步的，所述輔助試劑包括含有濃度為150-300mM的NaCl的磷酸鹽緩沖液。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點包括： a) 通過采用非巰基末端的核酸探針制備核酸-金納米偶聯(lián)物，可顯著降低核酸試劑 成本，從而顯著降低檢測成本，并且，采用這種PolyA末端探針的核酸-納米金偶聯(lián)物檢測 核酸，由于能控制核酸雜交后AuNPs的聚集程度，從而提高了該DNA-AuNPs探針檢測的靈 敏度和線性范圍，特別是，通過采用兩步法吸附核酸，可有效解決高鹽濃度下，AuNPs吸附 PolyA-DNA容易產(chǎn)生沉淀、制備重復性差的問題； b) 進一步的，通過采用dATP,巰基^--燒酸等進一步修飾AuNPs,可提高 PolyA-DNA-AuNPs探針雜交的穩(wěn)定性； c)與現(xiàn)有PolyA-DNA-AuNPs探針的制備方法相比，本發(fā)明具有探針制備的重復性、穩(wěn) 定性更高、用于光度法檢測核酸時動態(tài)檢測范圍寬，靈敏度高等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明一典型實施方案之中一種PolyA-DNA-AuNP探針的制備工藝流程 圖； 圖2是本發(fā)明一典型實施方案之中一種DNA檢測方法的原理圖； 圖3a-3c是本發(fā)明一典型實施例中DNA-AuNP探針與目標DNA雜交前（a)以及與濃度 為1. OnM(b)、100nM(c)的目標DNA雜交后的透射電鏡照片； 圖4是本發(fā)明一典型實施案例中向AuNP-DNAi和AuNP-DNA2的混合溶液中加入不同濃 度的目標DNA而導致的不同強度的紫外吸收光譜圖； 圖5是本發(fā)明一典型實施例中的目標DNA濃度與紫外吸收強度的標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0020] 鑒于現(xiàn)有基于非巰基化寡核苷酸與納米金復合物制備及應用缺陷，本案發(fā)明人提 出了一種改進的技術(shù)方案，該技術(shù)方案克服了現(xiàn)有非巰基化寡核苷酸-納米金復合物制備 過程中易沉淀、重復性低以及應用于核酸檢測動態(tài)范圍窄的缺點。
[0021] 本發(fā)明的技術(shù)方案是基于一種兩步法將核酸探針吸附到納米金表面的技術(shù)方法， 核酸探針由末端連接多個、特別是10個以上的連續(xù)堿基A的寡核苷酸構(gòu)成，所制備的復合 物與目標DNA的互補雜交而實現(xiàn)目標DNA的檢測。
[0022] 更為具體的講，本發(fā)明的一個方面所涉及的是一種基于核酸-納米金復合物與目 標DNA雜交的DNA光度檢測方法，該方法包括 ： 將末端含有多聚腺嘌呤的第一寡核苷酸(可標記為DNAJ、末端含有多聚腺嘌呤的第二 寡核苷酸(可標記為DNA2)與金納米粒子（AuNP)分別偶聯(lián)，分別形成第一探針（AuNP-DNAj 和第二探針（AuNP-DNA2)， 將第一探針和第二探針混合，并加入可能含有能夠與第一寡核苷酸和第二寡核苷酸互 補雜交的核酸序列的目標DNA的樣品，在適于進行核酸雜交反應的環(huán)境中進行互補雜交反 應(其原理可參閱圖2)，通過測定雜交反應體系的可見光吸收強度變化，實現(xiàn)對樣品的檢 測。
[0023] 作為較為優(yōu)選的實施方案之一，參閱圖1，所述第一探針或第二探針的制備方法可 以包括如下步驟： (1) 將5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸或3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx 的第二寡核苷酸加入金納米粒子的分散液中，并加入檸檬酸鈉緩沖液混合均勻、孵育，而后 離心去除游離的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸，而保留第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與金 納米粒子的復合物； (2) 將步驟（1)最終所獲第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與金納米粒子的復合物以中性 磷酸緩沖液重懸，再次加入第一寡核苷酸或第二寡核苷酸、封閉試劑以及NaCl溶液，再次 孵育，并離心除去游離的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸及封閉試劑，獲得所述第一探針和 第二探針， 其中，所述封閉試劑包括dATP或巰基十一烷酸。
[0024] 本發(fā)明的另一個方面所涉及的是一種DNA檢測試劑盒，該試劑盒包括： 第一探針，包含金納米粒子與第一寡核苷酸的偶聯(lián)物，其中，所述第一寡核苷酸以末端 包含的多聚腺噪呤PolyAx與所述金納米粒子偶聯(lián)， 第二探針，包含金納米粒子與第二寡核苷酸的偶聯(lián)物，其中，所述第二寡核苷酸以末端 包含的多聚腺噪呤PolyAx與所述金納米粒子偶聯(lián)， 以及，用以構(gòu)成適于進行核酸雜交反應的液相環(huán)境的輔助試劑， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別能夠與目標DNA中的不同核酸序列互 補，X > 10。
[0025] 例如，在本發(fā)明的一典型實施案例中，該基于納米金形成的可視化DNA檢測方法 可以包括如下步驟： (1) AuNP 和 DNA 偶聯(lián) 將檸檬酸鈉還原法制備的金納米粒子（AuNP，直徑15-50nm)和3'末端含有多聚腺嘌呤 (PolyAx，x彡10)的DNA，'端含有PolyAx(x彡10)的DNA2分別進行偶聯(lián)形成AuNP-DNAp AuNP-DNA 2復合物。例如，取AuNP的分散液分別加入100uM的DNAp DNA2，然后加入500mM pH值為3的檸檬酸鈉緩沖液，震蕩混勻，孵育3分鐘以上離心，去除游離的DNApDNA 2分子， 用中性磷酸緩沖液（〇. 01M)重懸至原體積，再加入濃度100uM的DNAi、DNA2溶液，濃度100uM 的dATP(或濃度10 uM的巰基i^一烷酸)，然后分批，例如每兩小時加一次濃度0. 1M的NaCl 溶液，直至形成的混合體系中含有濃度為〇. 01M的PB (磷酸鹽)、濃度為100mM的NaCl，繼 續(xù)孵育30h后，加入封閉試劑封閉AuNP-DNAi、AuNP-DNA2的偶聯(lián)物，孵育10h，離心，去除游 離的 DNAp DNA2、dATP 分子，得到 AuNP-DNAi 和 AuNP-DNA2。 (2) AuNP-DNAl和AuNP-DNA2的混合溶液與目標DNA雜交，分別取步驟（1)制備出的 AuNP-DNAdPAuNP-DNA2以1 :1的比例混勻，然后向該混合溶液中加入不同濃度的目標DNA 標準樣品進行互補雜交(雜交緩沖液可選用含有濃度為150-300mM NaCl溶液的磷酸鹽緩沖 液)。所得混合溶液反應15分鐘及以上后，采用分光光度計檢測520 nm和650 nm波長的 光吸收值。
[0026] 本發(fā)明通過兩步法實現(xiàn)了制備PolyA末端DNA與納米金復合物穩(wěn)定和重復性高， 通過將這種核酸納米金探針與目標核酸雜交，使得納米金一定程度上聚集，吸收光譜發(fā)生 變化，與已報道的核酸-納米金偶聯(lián)物的光度法檢測核酸相比，本發(fā)明的基于核酸-納米金 偶聯(lián)物的光度法具有快速(時間在10分鐘以內(nèi)）、靈敏(檢測靈敏度可達〇. 1 nM)、檢測動態(tài) 范圍可達到3個數(shù)量級等優(yōu)點。
[0027] 以下結(jié)合若干實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作更為具體的說明。
[0028] 以下實施例中所涉及的DNA。DNA2、目標DNA的序列如下表1所示，其均可通過本 領域技術(shù)人員熟知的方式，例如人工合成等方式獲取。又及，需要說明的是，本案發(fā)明人利 用具有其它序列的DNAp DNA2、目標DNA按照前文所述的方式進行測試，亦可獲得與如下實 施例相近之檢測效果。
[0029] 表1實施例1-3中核酸-納米金探針（AuNP-DNA)的設計舉例

【權(quán)利要求】
1. 一種非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于包括： (1) 將末端含有多聚腺嘌呤PolyAx的寡核苷酸加入金納米粒子的分散液，并加入檸檬 酸鈉緩沖液混合均勻、孵育，而后離心去除游離的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸與金 納米粒子的復合物； (2) 將步驟（1)最終所獲寡核苷酸與金納米粒子的復合物以中性磷酸鹽緩沖液重懸，再 次加入所述寡核苷酸、封閉試劑以及氯化鈉溶液，再次孵育，并離心除去游離的所述寡核苷 酸及封閉試劑，獲得所述非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物； 其中，所述封閉試劑包括dATP或巰基十一烷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于所述金納 米粒子的粒徑為15_50nm。
3. 權(quán)利要求1-2中任一項所述方法在檢測DNA或制備DNA檢測試劑盒中的應用。
4. 一種可視化DNA檢測方法，其特征在于包括： 提供5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸及金納米粒子，并采用權(quán)利要求1-2 中任一項所述方法制成作為第一探針的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物； 提供3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸及金納米粒子，并采用權(quán)利要求1-2 中任一項所述方法制成作為第二探針的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物，X > 10 ; 以及，將所述第一探針和第二探針混合，并加入可能含有能夠與所述第一寡核苷酸和 第二寡核苷酸互補雜交的核酸序列的目標DNA的樣品，在適于進行核酸雜交反應的環(huán)境中 進行互補雜交反應，通過測定雜交反應體系的可見光吸收強度變化，實現(xiàn)對樣品的檢測。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的可視化DNA檢測方法，其特征在于具體包括： 取所述第一探針和第二探針按照1 :1的摩爾比均勻混合，并加入雜交緩沖液和一系列 具有不同濃度的目標DNA標準樣品，形成一系列不同混合體系進行核酸雜交反應，反應結(jié) 束后，檢測一系列不同混合體系可見光光吸收值，由此確定光吸收強度隨目標DNA濃度變 化的標準曲線； 以及，取所述第一探針和第二探針按照1 :1的摩爾比均勻混合，并加入雜交緩沖液和 待檢測樣品進行核酸雜交反應，反應結(jié)束后檢測所獲混合反應物的可見光光吸收值，并依 據(jù)所述標準曲線而計算出待檢測樣品所含目標DNA的濃度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的可視化DNA檢測方法，其特征在于所述可見光的波長為 520 nm、 650 nm〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的可視化DNA檢測方法，其特征在于所述雜交緩沖液采用 pH=7. 4,且含有150-300mM NaCl的、濃度為0. 01M的磷酸鹽緩沖液。
8. -種DNA檢測試劑盒，其特征在于包括： 第一探針，主要由5'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第一寡核苷酸與金納米粒子經(jīng)權(quán)利 要求1-2中任一項所述方法所制成的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物組成； 第二探針，主要由3'端含有多聚腺嘌呤PolyAx的第二寡核苷酸與金納米粒子經(jīng)權(quán)利 要求1-2中任一項所述方法所制成的非巰基核酸-納米金偶聯(lián)物組成； 以及，用以構(gòu)成適于進行核酸雜交反應的液相環(huán)境的輔助試劑， 其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別能夠與目標DNA中的不同核酸序列互補 雜交，X彡10。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA檢測試劑盒，其特征在于所述金納米粒子的粒徑為 15_50nm〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA檢測試劑盒，其特征在于所述輔助試劑包括含有濃度為 150-300mM的NaCl的磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059976SQ201410288696
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】彭池方, 泮秋立, 劉春麗, 劉麗強 申請人:江南大學