H3亞型禽流感病毒二溫式rt-pcr檢測試劑盒及其引物對的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有一對特異性引物。實驗證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測H3亞型禽流感病毒，具有操作快速簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明用于H3亞型禽流感病毒導(dǎo)致的禽類感染，可以節(jié)約時間的成本。
【專利說明】H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒及其引物對
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒及其引物對。
【背景技術(shù)】
[0002]禽流感(avian influenza virus, Al)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的家禽及野生禽類感染及疾病的總稱。其感染范圍很廣，幾乎所有的野生及家養(yǎng)禽類均可感染，其中以家禽中的火雞和雞最為易感，發(fā)病率與死亡率較高。根據(jù)禽流感病毒(AIV)致病性強(qiáng)弱，將其分為高致病和低致病性AIV。以H5N1、H7N7亞型毒株為代表的高致病性AIV不僅可引起禽類的大面積死亡，甚至可以感染并致人死亡。低致病性AIV在禽類體內(nèi)只表現(xiàn)輕微癥狀或不發(fā)病，未能引起人們的廣泛關(guān)注。直至1999年的香港H9N2亞型AIV感染人的事件才引起世界對低致病AIV的關(guān)注。越來越多的研究報道表明低致病性AIV可以為高致病性AIV提供基因片段造成對人類的感染。H3亞型AIV雖屬于低致病性AIV，但其在低致病性AIV中占有較重要地位，Yi PENG等通過對2009-2011年廣西地區(qū)低致病性AIVs進(jìn)行病原學(xué)檢測與分析，表明H3亞型AIV在家禽中分離率較高。此外，研究報道H3亞型AIV在不同家禽中分布的季節(jié)性與我國人群中流感病毒流行的季節(jié)性比較一致且有逐年上升趨勢，這就為兩種宿主的流感病毒在豬這個“混合器”中發(fā)生基因重排提供了條件。1968年爆發(fā)的香港流感病毒A/HongKong/68 (H3N2)經(jīng)研究證實是由人的H2N2亞型流感病毒與H3亞型AIV的HA基因重排得來，其PBl基因也來自于Al V。因此，加強(qiáng)對H3亞型AIV的監(jiān)測對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生都具有重要意義。
[0003]二溫式PCR即二溫式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是根據(jù)常規(guī)三溫式PCR技術(shù)原理改進(jìn)而成的一種PCR特殊形式。二溫式RT-PCR將退火和延伸合并為同一個溫度，只有兩種溫度變化，即變性和退火-延伸溫度。與常規(guī)RT-PCR相比，二溫式PCR擴(kuò)增程序簡單，耗時短，同時由于較常規(guī)PCR退火溫度高而延伸溫度低，不但增強(qiáng)了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也使引物的延伸變得更容易。因此，二溫式RT-PCR是一種操作簡單、檢測速度更快更特異的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供敏感性好、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒及其引物對，以簡便快速地檢測H3亞型禽流感病毒。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，包括引物I和2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的堿基序列。
[0006]引物I和引物2的摩爾比為0.5-1: 0.5-1 ο
[0007]引物I和引物2的摩爾比為1:1。
[0008]上述H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測弓丨物對在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，PCR擴(kuò)增的退火溫度為60.(TC -68.(TC。[0009]PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
[0010]H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒，包括引物對、PCR緩沖液和水；
[0011]引物對包括引物I和2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/L,在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L ；
[0012]PCR 緩沖液為 2 X Taq PCR Mix。
[0013]引物I和2在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.5 μ mol/L。
[0014]上述H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，PCR擴(kuò)增的退火溫度為60.(TC -68.(TC。
[0015]PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
[0016]針對目前缺乏對H3亞型禽流感病毒進(jìn)行快速檢測和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā)明人研究設(shè)計了一對特異性引物，據(jù)此建立了 H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測方法，并制備了相應(yīng)的檢測試劑盒。實驗證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測H3亞型禽流感病毒，具有操作快速簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明用于H3亞型禽流感病毒導(dǎo)致的禽類感染，可以節(jié)約時間的成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是二溫式RT-PCR特異性試驗結(jié)果的電泳圖，圖中:M.1OObp DNA ladder ;1_5.5株Η3分離株；6.Η1 ；7.Η4 ；8.Η5 ；9.Η6 ；10.Η7 ；11.Η9 ；12.新城疫病毒；13.傳染性支氣管炎病毒；14傳染性喉氣管炎；15.雞毒霉形體；16.禽呼腸孤病毒；17.陰性對照。
[0018]圖2是二溫式PCR的敏感性試驗結(jié)果的電泳圖，圖中:M.1OObp DNA ladder ；1-6.1 X IO7-1 X IO2 拷貝 / μ L ；7.陰性對照。
【具體實施方式】
[0019]以下實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下:
[0020]Hl亞型禽流感病毒記載在“利用RT-LAMP可視化檢測技術(shù)檢測Hl亞型禽流感病毒及Ν1、Ν2亞型的分型”，病毒學(xué)報，2013，29⑵:154-159，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0021]Η3 亞型禽流感病毒記載在 “Visual detection of H3subtype avian influenzaviruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplificationassay” Virology Journal, 2011, 5 ;8:337,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0022]H4亞型禽流感病毒記載在“H4亞型家養(yǎng)水禽流感病毒分離株的表面膜蛋白基因的序列測定和遺傳進(jìn)化分析”，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37 (12)，1334-1339，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0023]H5亞型禽流感病毒記載在“H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術(shù)的建立”，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，02:323-327，H5亞型AIV RNA為美國賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研
究室惠贈；
[0024]H6亞型禽流感病毒記載在“H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立”，畜牧與獸醫(yī)，2012，44(11)，12-16，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0025]H7亞型禽流感病毒記載在“H5和H7亞型禽流感病毒多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測及鑒別方法的建立”，中國獸醫(yī)科技，2005, 35 (6)，437-440，H7亞型AIV RNA為美國賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈；
[0026]H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學(xué)報，2006，(09):858-860，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0027]新城疫病毒記載在“禽流感和新城疫病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法的建立”，生物技術(shù)通訊，2008，19 (3) 410-413，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0028]傳染性支氣管炎病毒記載在“應(yīng)用多重反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)檢測雞新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的研究”，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22(2)，126-130，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0029]傳染性喉氣管炎病毒記載在“傳染性喉氣管炎病毒疫苗的研究進(jìn)展”，中國畜牧獸醫(yī)，2006，33 (2)，41-44，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得
[0030]雞毒霉形體記載在“用SDS-PAGE分析雞毒霉形體廣西分離株的結(jié)構(gòu)蛋白”，中國獸醫(yī)科技，2003，33 (2)，41-43，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0031]禽呼腸孤病毒記載在“禽呼腸孤病毒廣西分離株σ 3基因的克隆和表達(dá)”，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2005，27 (3)，167-170，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得；
[0032]RNA抽提試劑盒、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、5 XAMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司，2 X Taq PCRMaster MIX 購自 Invitrogen 公司。
[0033]實施例1、引物的設(shè)計與合成
[0034]根據(jù)GenBank中H3亞型AIV HA基因的保守序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行多序列比對，在保守區(qū)用primer5.0設(shè)計引物。引物由Invitrogen公司合成。(表1)。
[0035]表1引物信息
[0036]
【權(quán)利要求】
1.H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，其特征在于包括引物I和2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的喊基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，其特征在于: 所述引物I和引物2的摩爾比為0.5-1: 0.5-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，其特征在于: 所述引物I和引物2的摩爾比為1:1。
4.權(quán)利要求2所述H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為60.(TC -68.(TC。
5.權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
6.一種H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括引物對、PCR緩沖液和水； 所述引物對包括引物I和2，它們分別具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的堿基序列，其濃度均為25 μ mol/L,在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.1 μ mol/L-0.5 μ mol/L ；所述PCR緩沖液為2 X Taq PCR Mix。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于: 所述引物I和2在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.5 μ mol/L。
8.權(quán)利要求7所述H3亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測試劑盒在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為60.(TC -68.(TC。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
【文檔編號】C12Q1/70GK104017903SQ201410272791
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】謝芝勛, 劉婷婷, 羅思思, 謝麗基, 李孟, 謝志勤, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所