長鏈非編碼RNA Ovol2-AS的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生理和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和功能的長鏈非編碼RNA(lncRNA)及其應(yīng)用。建立妊娠期小鼠模型，分離妊娠期及非妊娠期小鼠的胰島檢測其lncRNA差異表達(dá)水平，篩選并發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和功能的lncRNA?Ovol2-AS。在小鼠胰島原代打散細(xì)胞以及小鼠胰島β細(xì)胞系Min6中過表達(dá)Ovol2-AS，可以顯著促進(jìn)β細(xì)胞的增殖，并起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。長鏈非編碼RNA?Ovol2-AS可用于抑制胰島細(xì)胞的凋亡、用于促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖；還可以用于制備或篩選制備治療糖尿病的藥物。
【專利說明】長鏈非編碼RNA 0vol2-AS的應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生理和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和功能的長鏈非 編碼RNA(lncRNA)及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種多病因的代謝性疾病，特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌和 (或）作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，胰島β細(xì)胞 數(shù)量和功能都對其臨床進(jìn)程起著重要作用。近年來糖尿病在全世界特別是中國的發(fā)病率迅 速上升，2010年我國在對近10萬人進(jìn)行了長期隨訪調(diào)查的結(jié)果顯示，我國18歲及以上成人 樣本中，根據(jù)國際最新臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷的糖尿病估測患病率為11. 6%，約1. 139億 人，使得此領(lǐng)域的研究也更為重要和迫切，揭示未知的調(diào)控機(jī)制和治療靶點(diǎn)是全球研究者 的共同目標(biāo)。
[0003] 胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其中β細(xì)胞 的增殖已成為糖尿病研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。越來越多研究傾向于認(rèn)為胰島β細(xì)胞功能缺陷是 糖尿病發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，而β細(xì)胞功能缺陷主要表現(xiàn)為兩個(gè)方面 ：β細(xì)胞數(shù)量的減少 和胰島素分泌異常。無論是1型還是2型糖尿病，都存在胰島β細(xì)胞數(shù)量缺陷，因此探討 影響β細(xì)胞數(shù)量和功能的原因和機(jī)制成為了全球糖尿病研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。胰島β細(xì)胞 數(shù)量主要由四種機(jī)制調(diào)控：β細(xì)胞復(fù)制（已分化的β細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂）、β細(xì)胞新生 (前體細(xì)胞的發(fā)育成熟）、β細(xì)胞凋亡（程序性細(xì)胞死亡）以及β細(xì)胞擴(kuò)張，任何一種調(diào) 控機(jī)制的變化都會(huì)直接影響β細(xì)胞的數(shù)量，這四種機(jī)制可根據(jù)發(fā)育的不同階段或體內(nèi)代 謝的需求變化而調(diào)控β細(xì)胞的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在胰島素抵抗或肥胖狀況下，β細(xì)胞 數(shù)量可出現(xiàn)近30倍的增加，而處于相同生理病理狀態(tài)下的人類胰島β細(xì)胞數(shù)量僅會(huì)增加 30-40%，成人胰島的β細(xì)胞增殖率非常低，尸體解剖人類胰腺發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞復(fù)制（Ki67陽 性β細(xì)胞）在5歲左右便降至不到0. 2%，而在成人胰腺中幾乎找不到Ki67陽性的β細(xì) 胞，這說明在正常生理狀況下成人體內(nèi)胰島β細(xì)胞的增殖非常有限，故如何能讓糖尿病病 人功能性的胰島β細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)則成為了糖尿病研究的重點(diǎn)。
[0004] 近年來許多重要研究結(jié)果揭示，盡管在特定環(huán)境下小鼠 β細(xì)胞可以由少量前體 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，但大多數(shù)β細(xì)胞還是通過自身復(fù)制增殖的，胰島β細(xì)胞的復(fù)制在胚胎期及 新生兒期會(huì)快速增加，而在斷奶后直到至發(fā)育成熟的時(shí)間內(nèi)其數(shù)量幾乎不會(huì)變化，無論在 成熟的嚙齒類動(dòng)物中還是在人類胰島其復(fù)制速度都非常緩慢，但β細(xì)胞仍保留了其加速 復(fù)制的能力，在一些特殊的生理病理情況下，比如妊娠、高血糖、胰腺損傷]以及周圍胰島 素抵抗（肥胖狀態(tài)等）的情況下胰島β細(xì)胞的復(fù)制會(huì)明顯增加。
[0005] 長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。2002年研究 人員在對小鼠全長互補(bǔ)DNA(cDNA)文庫的大規(guī)模的測序過程中首次發(fā)現(xiàn)了這類新的轉(zhuǎn)錄 物一IncRNA，根據(jù)IncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將IncRNA分為5 類：正義（sense)、反義（antisense)、雙向（bidirectional)、基因內(nèi)（intronic)、及基因間 (intergenic)，這種位置關(guān)系對于推測IncRNA的功能有很大幫助。目前的研究表明IncRNA 可能的來源包括以下方面：（1)編碼蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生中斷而轉(zhuǎn)變成IncRNAs，比如 Xist IncRNA，（2)染色質(zhì)重組的結(jié)果，即兩個(gè)非轉(zhuǎn)錄的基因與另一個(gè)獨(dú)立的基因并排重組 而產(chǎn)生含多個(gè)外顯子的IncRNAs，（3)非編碼基因復(fù)制過程中的反移位產(chǎn)物，（4)局部的串 聯(lián)復(fù)制子鄰近產(chǎn)生，（5)基因組中插入一個(gè)轉(zhuǎn)座成分而產(chǎn)生有功能的非編碼IncRNA，如BC1 和BC200。研究顯不，哺乳動(dòng)物基因組序列中1 %廣生的轉(zhuǎn)錄本是可編碼蛋白，而有4% 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是IncRNA，IncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的"噪音"，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn) 錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能，哺乳動(dòng)物中的IncRNA與蛋白編碼基因相比較，IncRNA的 長度普遍更短，保守性較差并且表達(dá)水平明顯低于蛋白編碼基因。然而近年來大量研究表 明，IncRNA在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、劑量補(bǔ)償效應(yīng)及細(xì)胞分化調(diào)控等許多生物過程 中發(fā)揮重要作用。IncRNA沒有一種普遍的作用模式，它可以以不同的方式來調(diào)控基因表達(dá) 和蛋白合成，可以在多個(gè)層面上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，包括表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平 調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控幾個(gè)方面。
[0006] IncRNA在調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制存在共性，主要從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄 后水平3個(gè)層面實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控，IncRNA主要可能具有以下幾個(gè)方面的功能：（1)通 過在蛋白編碼基因上游啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；（2)通過抑制RNA聚合酶 II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因表達(dá)；（3)通過與蛋白編碼基因的 轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，進(jìn)而干擾mRNA的剪切，從而產(chǎn)生不同的剪切形式；(4)通過與蛋白編 碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，進(jìn)一步在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的 表達(dá)水平；（5)通過結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，IncRNA轉(zhuǎn)錄本能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；(6)作 為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；（7)通過結(jié)合到特定蛋白上，改變該蛋白的 胞質(zhì)定位；（8)作為小分子RNA，如miRNA、piRNA的前體分子轉(zhuǎn)錄。而正因?yàn)镮ncRNA可以從 轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)控，這些基因包括疾病發(fā)生相關(guān)基因及發(fā)育相 關(guān)基因等，通過參與調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因，IncRNA既能影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也能影響 生物體發(fā)育過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前已報(bào)道IncRNA會(huì)對多種疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生 影響，包括神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，心血管疾病以及多種腫瘤癌癥等疾病。
[0007] 近年來對長鏈非編碼RNA (IncRNA)的研究引起了廣泛關(guān)注，而胰島β細(xì)胞相關(guān)的 IncRNA研究尚非常有限。探索新的在β細(xì)胞中扮演重要角色的IncRNA，不僅會(huì)揭示調(diào)控 β細(xì)胞數(shù)量和功能的重要機(jī)制，還將提供新的治療靶點(diǎn)，是糖尿病研究中亟待開拓的重要 科學(xué)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在提供調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和功能的IncRNA，并將上述IncRNA用于調(diào) 控胰島β細(xì)胞增殖和抑制胰島細(xì)胞凋亡。
[0009] 建立妊娠期小鼠這一成熟β細(xì)胞增殖模型，分離妊娠期及非妊娠期小鼠的胰島 檢測其IncRNA差異表達(dá)水平。用微陣列分析IncRNA表達(dá)譜的方法，利用IncRNA芯片檢 測了妊娠和非妊娠小鼠胰島中差異性表達(dá)的IncRNA,進(jìn)行了 G0(Gene ontology)功能分析 以及pathway通路分析，篩選并發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和功能的IncRNA:結(jié)果顯 示，根據(jù)對IncRNA芯片的分析，發(fā)現(xiàn)了約834種IncRNA在妊娠期和非妊娠期小鼠胰島中的 表達(dá)存在顯著性差異，結(jié)合差異表達(dá)的蛋白編碼基因進(jìn)行了 GO分析、pathway分析，通過分 析IncRNA-mRNA在表達(dá)水平上的相關(guān)性，構(gòu)建了 IncRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)結(jié)果， 表達(dá)豐度較高且變化倍數(shù)顯著的有AK078687、AK080649、AK154298、AK007144、AK149154以 及AK162104等，這幾個(gè)IncRNA的realtime PCR的結(jié)果也與芯片上的結(jié)果基本一致。其中 AK007144在小鼠胰島中表達(dá)豐度較豐富，變化差異較大，由于該IncRNA位于蛋白編碼基因 ovol2的反義鏈上，屬于antisense overlap的IncRNA,根據(jù)IncRNA命名的原則，將其命名 為 0vol2-AS。
[0010] 在小鼠胰島原代打散細(xì)胞以及小鼠胰島β細(xì)胞系Min6中過表達(dá)0VO12-AS，，觀 察0vol2-AS對胰島β細(xì)胞增殖和凋亡的影響；并進(jìn)一步檢測0vol2-AS對β細(xì)胞增殖相 關(guān)通路的作用。0v〇12-AS的表達(dá)水平在妊娠與非妊娠期小鼠胰島中存在顯著性差異，過表 達(dá)0vol2-AS組的胰島β細(xì)胞生長加快、S期細(xì)胞比例增加，早期凋亡細(xì)胞的比例減少；并 進(jìn)一步證明，0vol2-AS能使Min6細(xì)胞中Akt磷酸化水平增加，同時(shí)也增加 GSK-30磷酸化 水平，進(jìn)而影響c-myc等增殖相關(guān)基因的水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)0vol2-AS，可以顯著促進(jìn) β細(xì)胞的增殖，并起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。
[0011] 〇v〇12-AS可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖并抑制胰島β細(xì)胞凋亡，此作用可能是通 過激活A(yù)KT/GSK-3 β通路實(shí)現(xiàn)的。
[0012] 因此，長鏈非編碼RNA 0vol2-AS可用于抑制胰島細(xì)胞的凋亡、用于促進(jìn)胰島細(xì)胞 的增殖；還可以用于制備或篩選制備治療糖尿病的藥物。
[0013] 在胰島細(xì)胞過表達(dá)0vol2-AS可促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，抑制胰島細(xì)胞凋亡。所述的胰 島細(xì)胞為胰島β細(xì)胞Min6或小鼠原代胰島細(xì)胞。在胰島β細(xì)胞Min6中過表達(dá)0vol2-AS 還可以激活胰島β細(xì)胞Min6中Akt/GSK-3i3通路。
[0014] 本發(fā)明利用妊娠小鼠的模型，通過分離妊娠期及非妊娠期小鼠的胰島檢測其 IncRNA差異表達(dá)水平。用微陣列分析IncRNA表達(dá)譜的方法，通過分析妊娠期和非妊娠期胰 島IncRNA的表達(dá)水平，為繼續(xù)研究小鼠胰島β細(xì)胞增殖相關(guān)IncRNA的功能和機(jī)制提供了 豐富的資源。同時(shí)，我們還構(gòu)建了相關(guān)IncRNA的過表達(dá)質(zhì)粒，并包裝了慢病毒，實(shí)現(xiàn)在胰島 β細(xì)胞Min6細(xì)胞系和小鼠原代胰島上的過表達(dá)，證實(shí)了妊娠期的β細(xì)胞增殖過程中確實(shí) 存在IncRNA的參與。進(jìn)一步篩選和探索IncRNA的功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制，將可能為糖尿 病的治療提供新的思路。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為實(shí)施例1中，小鼠對照組及妊娠組6個(gè)樣本的IncRNA芯片的箱式圖分析
[0016] 圖2為實(shí)施例1中，妊娠組小鼠胰島顯著性表達(dá)升高基因的G0分析
[0017] 圖3為實(shí)施例1中，妊娠組小鼠胰島顯著性表達(dá)升高基因的通路（Pathway)分析
[0018] 圖4為實(shí)施例1中，妊娠14. 5天組（pregnancy)和對照組（control)小鼠胰島 IncRNA表達(dá)水平差異驗(yàn)證
[0019] 圖5為實(shí)施例2中，轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-〇vol2-AS后Min6細(xì)胞中0vol2-AS的表達(dá)水 平
[0020] 圖6為實(shí)施例2中，轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-〇vol2-AS后Min6細(xì)胞的生長曲線
[0021] 圖7為實(shí)施例2中，Min6細(xì)胞系轉(zhuǎn)染pcDNA3. l-〇vol2-AS過表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后， 免疫熒光檢測Ki67的陽性表達(dá)
[0022] 圖8為實(shí)施例2中，細(xì)胞系Min6轉(zhuǎn)染0vol2-AS過表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒后48小時(shí) 后，用流式檢測E du的陽性率的結(jié)果
[0023] 圖9為實(shí)施例2中，流式檢測分析Min6細(xì)胞系轉(zhuǎn)染0vol2-AS過表達(dá)質(zhì)粒和對照 質(zhì)粒后對細(xì)胞凋亡的影響
[0024] 圖10為實(shí)施例2中，流式檢測分析Min6細(xì)胞系轉(zhuǎn)染0vol2-AS過表達(dá)質(zhì)粒和對照 質(zhì)粒后對細(xì)胞凋亡的差異
[0025] 圖11為實(shí)施例2中，小鼠原代打散胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染0vol2-AS過表達(dá)質(zhì)粒和對 照質(zhì)粒后熒光照片
[0026] 圖12為實(shí)施例2中，細(xì)胞凋亡原位檢測過表達(dá)0vol2-AS對小鼠原代β細(xì)胞凋亡 的影響
[0027] 圖 13 為實(shí)施例 2 中，P-AKT，T-AKT，P-GSK3 β，T-GSK3 β 在轉(zhuǎn)染 0vol2-AS 和對照 質(zhì)粒的Min6細(xì)胞系中的蛋白差異表達(dá)
[0028] 圖14為實(shí)施例2中，Min6細(xì)胞系中過表達(dá)0vol2-AS后增殖相關(guān)基因變化水平 【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1
[〇〇3〇] 一、主要實(shí)驗(yàn)材料：妊娠期小鼠和對照組原代胰島細(xì)胞
[0031] 主要試劑：HBSS(IOX)、（IX) (Invitrogen 公司）；膠原酶 XI (Sigma 公司）； Trizol 裂解液（Invitrogen 公司）。
[0032] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0033] ( 一）建立妊娠小鼠模型
[0034] 購買SPF級C57BL/6雌性小鼠和雄性小鼠，于SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)：分籠飼養(yǎng)（4只 小鼠每籠），小鼠可自由攝食和飲水。動(dòng)物房的環(huán)境溫度21±1度，濕度55±10%，晝夜節(jié) 律12-12小時(shí)。一部分雌性小鼠為對照組，另一部分雌性小鼠與雄性小鼠按照2:1的比例 合籠，取妊娠14. 5天的小鼠，妊娠的小鼠在分離胰島時(shí)再次通過胚胎表型觀察確認(rèn)妊娠時(shí) 間。
[0035] (二）從對照組和妊娠14. 5天的C57BL/6雌性小鼠中分離胰島：
[0036] 1、麻醉動(dòng)物：采用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠（劑量為50mg/kg)。
[0037] 2、將小鼠于固定于動(dòng)物操作臺上，腹部朝上，固定好四肢；用75%酒精棉球擦拭 腹部，消毒。取腹正中切口，用眼科剪打開腹部呈一 U型切口；充分暴露腹部臟器，將其肝臟 上翻，將十二指腸翻向左側(cè)，小腸和盲腸向左翻，鈍性游離膽總管，用文氏血管鉗夾閉夾住 膽總管與十二指腸交匯處，即十二指腸大乳頭處，以避免膠原酶從此處進(jìn)入腸道。
[0038] 3、用5ml注射器吸滿膠原酶XI工作液（10XXI型膠原酶用lxHBSS稀釋為1XXI 型膠原酶，用量為4-5ml/胰腺），將一次性靜脈輸液針固定在注射器頭部連接好，排空內(nèi)部 的氣泡。在顯微鏡下用一次性靜脈輸液針在膽囊下方的膽總管處進(jìn)行穿刺（肝總管分支處 下方的位置）。
[0039] 4、固定好插入膽總管的靜脈針頭后，輕輕推入少許膠原酶XI工作液，在顯微鏡下 觀察胰腺有少許充盈，且膽總管周圍沒有滲液，迅速用眼科剪剪破心臟，停止血流，以免胰 腺內(nèi)混入過多血細(xì)胞。繼續(xù)緩慢注入約2-3ml膠原酶XI工作液，注入時(shí)，可感到注射器阻力 增大，即胰腺被充盈至壓力逐漸增加，直至胰腺被完全充盈后終止。
[0040] 5、將胰腺與周圍組織用鑷子輕柔的分離開，找到脾臟，將脾臟連著充盈的胰腺取 下，放于15ml離心管，離心管中提前已加入了 2-3ml膠原酶XI工作液，注意不要將脾臟混入 離心管里。
[0041] 6、接著將15ml離心管置于37°C水浴鍋中消化，一般消化時(shí)間約為18分鐘，期間， 當(dāng)消化到15分鐘、16分鐘、17分鐘時(shí)分別用手劇烈震蕩離心管1次，以便加速胰腺組織的 消化。至大約18分鐘時(shí)肉眼觀察可見消化完全的組織呈細(xì)沙狀。
[0042] 7、消化完畢后，向15ml離心管加入10ml冰上預(yù)冷的1 XHBSS，終止消化，以免過度 消化，4度，lOOOrpm(加速9,減速9)，離心1分鐘。將上清棄去，加入10ml左右的1 XHBSS， 用洗耳球連接玻璃管輕柔吹打重懸沉淀，將沉淀及液體吸至40目的篩網(wǎng)上，經(jīng)篩網(wǎng)過濾掉 無法消化的組織塊（如脂肪組織等），收集濾液于新的15ml離心管中。用1XHBSS將收集 的過濾液補(bǔ)滿至10ml，4度，lOOOrpm離心1分鐘。
[0043] 8、棄去上清液體，梯度離心，4度，1500rpm(加速5,減速0)離心20分鐘。將離 心后收集到的上清加入l〇mlIXHBSS液體，再次離心，4度，lOOOrpm(加速9,減速9)離心 1分鐘。將上清棄去，在離心管中加入lOmllXHBSS液體，使胰島細(xì)胞重懸，洗一遍，4度， lOOOrpm(加速9,減速9)，離心1分鐘。將上清棄去，加入10ml含有0· 5% BSA的1XHBSS， 用塑料吸引管吹打重懸沉淀，將混合液體吸入l〇cm培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下挑取胰島。
[0044] 9、用于提取RNA的胰島，挑出至1. 5ml EP管內(nèi)，4度，lOOOrpm(加速9,減速9)，離 心1分鐘，吸掉上清，每管加入lml Trizol裂解液，保存于-80度，或者將挑出的胰島放入凍 存管中，4度，lOOOrpm，離心1分鐘后，吸棄上清，直接存入液氮罐中。
[0045] (三）小鼠原代胰島RNA提取
[0046] 用上述方法，取妊娠14. 5天雌性小鼠胰島3組，每組由7只小鼠胰島組成，標(biāo)記為 pregl、preg2、preg3 ;對照組年齡匹配的雌性小鼠胰島3組，每組由7-8只小鼠胰島組成， 標(biāo)記為controll、control〗、control3。采用Trizol試劑法，分別從小鼠分離的原代胰島 提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈試劑盒（A3500, Promega)制成cRNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作按 Promega說明書進(jìn)行。并進(jìn)行RNA質(zhì)量控制檢測，對cRNA進(jìn)行標(biāo)記后也進(jìn)行了標(biāo)記質(zhì)量控 制。RNA濃度平均在200-500ng/ μ 1之間，28SRNA比18SRNA條帶亮度接近1:1，RNA的A260/ Α280比值在1. 8-2. 1之間，Α260/Α230比值大于1. 8。質(zhì)量良好，符合Mouse4x44K IncRNA expression array微陣列基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)要求。由上海康成生物有限公司采用小鼠 IncRNA Array (4x44K, ArrayStar)完成的基因表達(dá)譜檢測。
[0047] (四）小鼠 IncRNA芯片分析
[0048] 1、小鼠 IncRNA Array (4x44K, ArrayStar)微陣列雜交分析
[0049] 應(yīng)用 Agilent gene expression hybridization kit(Agilent p/n5188-5242), Hybridization Chamber, stainless (Agilent p/n G2534A), Hybridization Chamber gasket slides(Agilent p/n G2534-60003), Hybridization oven (Agilent p/n G2545A), Hybridization oven rotator for Agilent Microarray, Hybridization Chambers (Agilent p/nG2530-60029)進(jìn)行檢測。
[0050] 2、IncRNA芯片數(shù)據(jù)分析
[0051] 每個(gè)樣本的總RNA進(jìn)行Mouse4x44K IncRNA expression array微陣列基因表 達(dá)譜分析。該小鼠長鏈非編碼RNA芯片上含有約40000種IncRNA，其數(shù)據(jù)庫來自NCBI RefSeq、UCSC、RNAdb2. 0、NRED、Fantom3. 0、UCRs。重復(fù)序列以及小于 200bp 的非編碼 RNA 被剔除，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都對應(yīng)一個(gè)匹配的探針，一些管家基因?yàn)殛栃詫φ铡?shù)據(jù)分析首先應(yīng) 用Agilent GeneSpring GX vll. 5. 1軟件校正原始數(shù)據(jù)，在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了分位數(shù)校正 之后，對至少有3個(gè)以上樣本帶有標(biāo)記的IncRNA進(jìn)行進(jìn)一步的control組和preg組的 IncRNAs差異性表達(dá)篩選，將control組和preg組各個(gè)樣本檢測信號的比值進(jìn)行l(wèi)og2變 換，平衡，進(jìn)行t-test分析并計(jì)算p-values ;當(dāng)某種IncRNA在兩組間的t-test分析中得 至lj p-value <0· 05,并且差異性倍數(shù)> 1. 5時(shí)，便認(rèn)為control組和preg組的IncRNA有顯 著差異性表達(dá)。
[0052] 結(jié)果顯示，妊娠期小鼠胰島與非妊娠對照組小鼠胰島之間有大約800多種IncRNA 存在顯著性表達(dá)差異，約380種IncRNA的表達(dá)水平在妊娠期小鼠胰島中上調(diào)，約454種 IncRNA的表達(dá)水平在妊娠期小鼠胰島中下調(diào)，通過箱式圖（Box-Plot)可見6個(gè)樣本各組數(shù) 據(jù)內(nèi)和各組數(shù)據(jù)間的水平大致接近，組間均一性較好。通過散點(diǎn)圖（Scatter-Plot)可比較 對照組（control)與妊娠組（preg)間差異性表達(dá)的IncRNA水平，可見組間IncRNA差異較 明顯。圖1為芯片的箱式圖分析，Y軸為對數(shù)化的坐標(biāo)軸，表示紅綠兩熒光信號標(biāo)準(zhǔn)化后的 數(shù)值之比。
[0053] 對妊娠期與非妊娠期對照小鼠胰島中有顯著表達(dá)水平差異的基因進(jìn)行G0分析， 進(jìn)行生物學(xué)過程、分子功能以及亞細(xì)胞組分分類注釋分析，按集中趨勢由高到低（p-value 越小則集中趨勢越高）列出了顯著性差異表達(dá)基因集中的分類，結(jié)果顯示，妊娠期小鼠胰 島中顯著性表達(dá)水平升高的基因主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制有關(guān)。Pathway富集 分析可找出發(fā)生差異表達(dá)的基因影響的生物學(xué)通路，對有顯著性表達(dá)差異的基因進(jìn)行KEGG Pathway注釋分析，按集中趨勢由高到低（p-value越小則集中趨勢越高）列出顯著性差 異表達(dá)基因集中的生物學(xué)通路列表，結(jié)果顯示妊娠期小鼠胰島中表達(dá)升高的基因主要參與 DNA復(fù)制、氮代謝、p53信號通路以及卵母細(xì)胞成熟等過程。說明相應(yīng)的妊娠期表達(dá)水平顯 著升高的IncRNA可能通過調(diào)控相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白、參與相應(yīng)的生物學(xué)途徑等來調(diào)節(jié)胰 島β細(xì)胞的增殖過程。圖2顯示了 G0分析的柱狀圖，圖3顯示了 Pathway分析的柱狀圖。
[0054] 3、妊娠期小鼠胰島增殖期胰島IncRNA表達(dá)差異分析及統(tǒng)計(jì)
[0055] 任意挑選妊娠期小鼠胰島中差異性表達(dá)的112個(gè)IncRNA(差異性倍數(shù)> 2, p值 <0.05)，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，與未妊娠對照組小鼠胰島相比，妊娠期小鼠胰島有部分 IncRNA表達(dá)上調(diào)，部分IncRNA表達(dá)下調(diào)，組內(nèi)均一性較好，組間差異較明顯。
[0056] 分析表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)生表達(dá)改變的IncRNA中，表達(dá)豐度較高且變化倍數(shù)顯著的有 AK078687、AK080649、AK154298、AK007144、AK149154 以及 AK162104 等。與未妊娠對照組相 t匕，小鼠胰島中的這幾種IncRNA的表達(dá)水平在妊娠期明顯上調(diào)（表1)。
[0057] 表1對照和妊娠14. 5天小鼠胰島IncRNA表達(dá)差異分析
[0058]
【權(quán)利要求】
1. 長鏈非編碼RNA 〇V〇12-AS用于抑制胰島細(xì)胞的凋亡。
2. 長鏈非編碼RNA Ovol2-AS用于促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖。
3. 長鏈非編碼RNA Ovol2-AS用于制備或篩選制備治療糖尿病的藥物。
4. 一種促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，在胰島細(xì)胞中過表達(dá)Ovol2-AS。
5. 權(quán)利要求4所述促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，所述的胰島細(xì)胞為胰島β 細(xì)胞Min6或小鼠原代胰島細(xì)胞。
6. -種抑制胰島細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于，在胰島細(xì)胞中過表達(dá)0v〇12-AS。
7. 權(quán)利要求6所述抑制胰島細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于，所述的胰島細(xì)胞為胰島β 細(xì)胞Min6或小鼠原代胰島細(xì)胞。
8. -種激活胰島β細(xì)胞Min6中Akt/GSK-3i3通路的方法，其特征在于，在胰島β細(xì) 胞Min6中過表達(dá)Ovol2_AS。
【文檔編號】C12N15/113GK104059887SQ201410260768
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】寧光, 李明蔚, 曹亞南, 姜秀麗 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院