利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血dnt細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方法。包括以下步驟：1）采集人體外周血樣品，2）體外分離純化獲得DNT細胞，3）體外培養(yǎng)DNT細胞，4）洗滌、收集DNT細胞，其特征在于：所述的步驟3）依次在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，再加上1~10v%的AB血清、1~10v%的自體血漿或1~10v%的人血白蛋白中的一種或多種作為添加蛋白成分。本發(fā)明所述方法安全、高效、經(jīng)濟、可產(chǎn)業(yè)化、可用于臨床應用。
【專利說明】利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的 方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] TCR+CD3+CD4TD8-T (Double Negative T，DNT)細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有獨特 調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群。此類細胞具有獨特的細胞表型（⑶25+⑶281〇⑶30+⑶44_)和細胞因 子表達譜（IFN-r+、TNF-α +、IL-2' IL-4' IL-KT、IL-13-)。因此，DNT 細胞在免疫調(diào)節(jié)、免 疫抑制、自身免疫病、移植物抗宿主病、HIV感染以及抗腫瘤方面有重要作用。然而由于DNT 細胞僅占外周血T淋巴細胞的19Γ5%，并且缺少有效的方法進行體外擴增，使其研究較少。
[0003] 專利號為200680043116. 7,專利名稱為"擴增雙陰性T細胞的方法"的中國專利中 公開了一種擴增方法：包括（a)提供包括DNT細胞或者其前體的起始樣品；(b)從起始樣 品基本上去除CD8+和CD4+T細胞；（c)在包括能夠刺激DNT細胞生長的試劑的培養(yǎng)基中用 固定的T細胞促分裂原培養(yǎng)來自步驟（b)的樣品；（d)洗滌步驟（c)中得到的細胞，并重懸 于包括所述試劑但無 T細胞促分裂原的培養(yǎng)基中；和（e)洗滌步驟（d)中得到的細胞，并重 懸于包括所述試劑和可溶性T細胞促分裂原的培養(yǎng)基中。上述技術(shù)方案是基于實驗室的 科研方法及操作，其主要缺陷是培養(yǎng)基中添加動物血清，給臨床應用帶來潛在危險。DNT前 期培養(yǎng)用6孔板或24孔板以及后期采用培養(yǎng)瓶擴增培養(yǎng)，其培養(yǎng)操作繁瑣，細胞瓶占用空 間大，操作耗時耗力，增加污染的幾率，不適宜產(chǎn)業(yè)化；另外，其整個培養(yǎng)過程中繁瑣的細胞 收集、離心、洗滌等操作程序，也不適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和管理的優(yōu)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種安全、高效、經(jīng) 濟、可產(chǎn)業(yè)化、可用于臨床應用的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞 的方法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：該利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模 擴增人外周血DNT細胞的方法依次包括以下步驟：1)采集人體外周血樣品，2)體外分離 純化獲得DNT細胞，3)體外培養(yǎng)DNT細胞，4)洗滌、收集DNT細胞，其特征在于：所述的步 驟3)依次在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，再加上1 ~10v%的AB血清、 1 ~-10v%的自體血漿或1 ~10v%的人血白蛋白中的一種或多種作為添加蛋白成分。本發(fā) 明采用培養(yǎng)瓶而不是24孔或6孔培養(yǎng)板作為起始培養(yǎng)材料，操作簡易可控，減少污染的幾 率。采用細胞培養(yǎng)袋而不是細胞培養(yǎng)瓶來大規(guī)模擴增細胞，由此提高細胞擴增倍數(shù)、減少細 胞培養(yǎng)空間，有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和管理。采用無動物血清培養(yǎng)基，由此避免了可能造成的種 系間病原微生物污染及其它對細胞生長的不利因素，避免了可能帶來的安全隱患。
[0006] 本發(fā)明所述的步驟3)中不收集、離心、洗滌細胞。本發(fā)明優(yōu)化起始培養(yǎng)材料，合理 選擇培養(yǎng)基種類，因此在細胞擴增過程中無需采用傳統(tǒng)的收集、離心、洗滌方式就能創(chuàng)造并 維持細胞擴增的良好環(huán)境同時減少細胞損失，所以大大簡略了細胞培養(yǎng)過程，節(jié)省人力、物 力和時間，同時減少了細胞污染機會。
[0007] 本發(fā)明所述的步驟4)之后將收集到的DNT細胞加入0. 9w%的生理鹽水袋中，并添 加 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2和1飛v%的人血白蛋白。添加以上的成分，可大大 提高細胞的穩(wěn)定性，為細胞建立一個良好的細胞保存環(huán)境，有效保留細胞的殺瘤活性。
[0008] 本發(fā)明所述的步驟3)具體過程為： (Γ3天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶已用1~10 Pg/ml的抗人⑶3單克隆抗體(克隆0KT3)包 被，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素 、ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人 白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、l~20ng/ml的重組人白介素7、1~20 ng/ml的重 組人白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v%的AB血清； 3~7天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、廣5 ng/ml的重組人白介素4、廣20 ng/ml的重組人 白介素7、1?20 ng/ml的重組人白介素12、1?5v%的自體血漿和1?10v%的AB血清； 7~10天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、廣5 ng/ml的重組人白介素4、50?200 ng/ml的可溶 性抗人⑶3單克隆抗體、廣20 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v% 的AB血清； 1(Γ20天在培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、5(T200 ng/ml的可溶性 抗人⑶3單克隆抗體、廣20 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的人血白蛋白和1?10v% 的AB血清。
[0009] 本發(fā)明對細胞培養(yǎng)過程中各種成分，在(Γ3天、3~7天、7~10天以及10天以后四個 培養(yǎng)時間段，培養(yǎng)基的選擇以及所添加的細胞因子、自體血漿、異體血清，以及人血白蛋白 的濃度組合和加入順序作了摸索，獲得了最佳培養(yǎng)工藝流程。
[0010] 本發(fā)明所述的無動物血清培養(yǎng)基為Life Technology公司的AM-V培養(yǎng)基、寶 日醫(yī)公司的GT-T551培養(yǎng)基、日本細胞科學研究所的ALyS505N培養(yǎng)基、德國Pan-biotech 公司的PANSERIN701培養(yǎng)基、美國L0NZA公司的X-VIV010培養(yǎng)基或美國L0NZA公司的 X-VIV015培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基都是適合人T細胞培養(yǎng)，支持細胞高密度培養(yǎng)，具有很高的細 胞成活率和擴增倍數(shù)，很高的殺傷活性，且無動物源成分，安全有效，適合于臨床應用。
[0011] 本發(fā)明所述的(Γ7天，無動物血清培養(yǎng)基選用AM-V培養(yǎng)基、X-VIV010培養(yǎng)基或 X-VIV015培養(yǎng)基；10天?20天，無動物血清培養(yǎng)基選用PANSERIN701培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng) 基或ALyS505N培養(yǎng)基。在不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)基的選擇，經(jīng)過實驗比較其培養(yǎng)條件是最優(yōu) 的，可使細胞大量增殖，增強細胞殺傷活性，并節(jié)約成本。
[0012] 本發(fā)明所述的步驟4)中采用尖底離心瓶收集DNT細胞，接著離心處理，然后用 0. 9w%的生理鹽水洗滌，最后再離心處理。以此去除培養(yǎng)基中含有的細胞因子、細胞碎片和 抗生素等物質(zhì)，避免回輸后對人體產(chǎn)生的不良影響。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點： 1、可用于臨床應用的DNT細胞體外培養(yǎng)方法。
[0014] 前面所述的DNT專利，涉及的DNT細胞擴增方法，都是基于實驗室的科研方法及操 作(添加動物血清且操作繁瑣，不可用于臨床應用）。本發(fā)明基于上述專利，經(jīng)過多次的摸索 及創(chuàng)新，形成DNT細胞體外培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化工藝流程，適合于臨床應用。
[0015] 2、大大簡化細胞培養(yǎng)操作程序，有利于實現(xiàn)規(guī)范化、系統(tǒng)化生產(chǎn)。
[0016] 本發(fā)明所述工藝操作簡單、步驟明確、重復性強、可控、出錯率低，特別適宜于大規(guī) 模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0017] 3、最大程度提高細胞擴增倍數(shù)，不需要使用血細胞單采機。
[0018] 通過本發(fā)明方法可在體外高效活化和擴增自身DNT細胞。從30 ml人外周血 IX 107?4X 107單個核細胞開始，可獲得8X 109?14X 109個經(jīng)活化、擴增后的，以DNT細胞為 主的免疫細胞(純度> 70%)。這種約500倍的高效體外擴增工藝，避免了傳統(tǒng)免疫細胞擴增 方法中必需使用血細胞分離儀以獲取大量起始外周血單個核細胞從而造成對機體免疫系 統(tǒng)的破壞。
[0019] 4、確保整個培養(yǎng)體系無動物來源成分，提高產(chǎn)品的安全度。
[0020] 本發(fā)明整個培養(yǎng)體系全程使用無動物血清培養(yǎng)基，由此避免了可能造成的種系間 病原微生物污染及其它對細胞生長的不利因素，避免了可能帶來的安全隱患。
[0021] 5、選擇不同無動物血清培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)條件，節(jié)約成本。
[0022] 本發(fā)明生產(chǎn)工藝按細胞在不同生長階段對培養(yǎng)基的不同需求，選擇相應的無動物 血清培養(yǎng)基，最大程度優(yōu)化不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)條件，節(jié)約生產(chǎn)成本，利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應 用和推廣。
[0023] 6、細胞制備工藝的標準化生產(chǎn)。
[0024] 本發(fā)明所述產(chǎn)品生產(chǎn)工藝可保證體外擴增后的DNT細胞獲得數(shù)量和質(zhì)量相對一 致的產(chǎn)品，DNT細胞純度大于70%，IFN- γ表達大于50%，有利于終產(chǎn)品質(zhì)量標準的制定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
[0026] 圖2為采用本發(fā)明實施例1所述方法對來自健康供體的DNT細胞的增殖曲線。
[0027] 5個健康供體經(jīng)過20天的培養(yǎng)，從第7天開始，DNT細胞生長速度顯著增加，呈對 數(shù)生長，第20天DNT細胞的增殖倍數(shù)達到500倍左右。
[0028] 圖3-A為本發(fā)明實施例1所述方法擴增DNT細胞不同時間點的純度變化。
[0029] 5個健康供體經(jīng)過20天的培養(yǎng)，在第10天DNT細胞純度均值就達到85%，在第15 天及第20天，DNT細胞純度均達90%。
[0030] 圖3-B是以一個健康供體為例，以本發(fā)明實施例1所述方法擴增DNT細胞不同時 間點的純度變化。
[0031] 在全血（Whole blood)中，DNT細胞即CD3+CD4XD丨細胞比例僅為4. 9% ;第0天， 經(jīng)本發(fā)明方法分離純化后，DNT細胞純度即⑶3+⑶4_CD8_細胞的比例為12. 3% ;通過本發(fā)明 方法的培養(yǎng)，在第7天，DNT細胞即⑶3+CD4TD8_細胞的比例高達84. 6% ;在第10天，DNT細 胞即⑶3+⑶4-⑶8-細胞的比例為86. 2% ;在第15天，DNT細胞即⑶3+CD4XD8-細胞的比例 為90. 6% ;在第20天，DNT細胞即CD3+CD4XD丨細胞的比例為91. 5%。
[0032] 圖4-A為本發(fā)明實施例1所述方法離體擴增的DNT細胞IFN- γ表達分析。
[0033] 5個健康供體經(jīng)過20天的培養(yǎng)，在第15天IFN- γ百分比均值就達到74%，第20 天，IFN- γ百分比均值高達87%左右。
[0034] 圖4-Β是以一個健康供體為例，以本發(fā)明實施例1所述方法離體擴增的DNT細胞 IFN- γ表達分析。
[0035] 在第15天，DNT (CD3+)細胞中IFNi百分比為71. 3% ;在第20天，DNT (CD3+)細 胞中IFN-γ百分比為90.6%。本發(fā)明方法擴增的0階細胞表達大量0^-^，有利于殺傷腫 瘤細胞。
[0036] 圖5為本發(fā)明實施例1所述方法離體擴增的DNT細胞對Κ562及Η1975細胞體外 殺傷活性分析。
[0037] 2株人腫瘤細胞系，Κ562 (人紅白血病)和Η1975(非小細胞性肺癌）。效應細胞是 DNT細胞，采用CCK8細胞增殖抑制法檢測。在96孔板中效應細胞按所示比例添加到1 X 104 個靶細胞/每孔中，3復孔。按照下列公式計算特異性殺傷率： 殺傷率（％)= [1 -（實驗孔均值一對應效應細胞孔均值）/靶細胞孔均值]X 100%。
[0038] 計算效應細胞數(shù)/靶細胞數(shù)（Ε/Τ)= 20:1、10:1、5:1、2.5:1時的殺傷活力，發(fā)現(xiàn) DNT細胞能夠以劑量依賴方式非常有效的殺傷這些腫瘤細胞，即使在低效靶比（5 :1)條件 下DNT細胞也有很強的殺傷能力。

【具體實施方式】
[0039] 實施例1 人DNT細胞 1、采集人體外周血樣品。
[0040] 從健康供體收集3(T60ml外周血到含肝素化管中。
[0041] 2、體外分離純化 按照廠商說明書，利用Rossettsep?試劑盒（Stem Cell Technologies Inc),通過與 RBC的Resetting去除⑶4+、⑶8+ T細胞。血液樣品用抗人⑶4和⑶8去除雞尾酒試劑標 記，在室溫下孵育20分鐘，然后血液在50ml離心管與等體積Ficoll-Hypaque的密度梯度 分層。在2500rpm離心25分鐘后，在Ficoll和血漿的界面收集已去除PBMC中⑶4+CD8+的 細胞，g卩DNT細胞，用0. 9%生理鹽水洗滌1次。
[0042] 3、體外培養(yǎng)DNT細胞。
[0043] 1)將步驟2獲得的DNT細胞在75cm2培養(yǎng)瓶中以1?6X106個/ml細胞在X-VIV010 培養(yǎng)基中37°C和5%C0 2培養(yǎng)3天，所述的培養(yǎng)瓶已用抗人⑶3單克隆抗體(克隆0KT3 )( 10 Pg/ml)包被，所述在X-VIV010培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (500 IU/ml)、重組人白介素4 (2 ng/ml)、重組人白介素7 (8 ng/ml)、重組人白介素12 (5 ng/ml)、自體血楽（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0044] 2)第3天傳至另一個75cm2培養(yǎng)瓶，在相同條件以1?6X106個/ml細胞在 X-VIV010培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天（75cm2培養(yǎng)瓶滿可傳至175cm2培養(yǎng)瓶)，所述X-VIV010培 養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml )、重組人白介素2 ( 500 IU/ml)、重組人白介素4 (2 ng/ml)、重組人白介素7 (8 ng/ml)、重組人白介素12 (5 ng/ml)、自體血漿（2 v%)和AB血 清（6 v%)。
[0045] 3)第7天，在175cm2培養(yǎng)瓶傳瓶，以1?6X 106個/ml細胞在X-VIV010培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)3天，所述X-VIV010培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (500 IU/ml)、重組人白介素4 (2 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（50 ng/ml)、重組人白介 素12 ( 5 ng/ml )、自體血楽（5 v% )和AB血清（6 v%)。
[0046] 4)第10天2個175cm2培養(yǎng)瓶入袋培養(yǎng)，以1?6X 106個/ml細胞在ALyS505N培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至第20天，所述ALyS505N培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組 人白介素2 (500 IU/ml)、重組人白介素4 (2 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（50 ng/ ml)、重組人白介素12 (5 ng/ml)、人血白蛋白（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0047] 4、洗滌、收集DNT細胞。
[0048] 第20天，收獲DNT細胞，用250ml尖底離心瓶收集細胞，離心，用0. 9w%生理鹽水 洗滌'離心。
[0049] 5、制成DNT細胞制劑。
[0050] 將步驟4之后收集到的DNT細胞加入100ml的0. 9w%的生理鹽水袋中，并添加500 IU/ml的重組人白介素2和2 v%的人血白蛋白。
[0051] 實施例2 人DNT細胞 1、采集人體外周血樣品。
[0052] 從健康供體收集3(T60 ml外周血到含肝素化管中。
[0053] 2、體外分離純化 按照廠商說明書，利用Rossettsep?試劑盒（Stem Cell Technologies Inc),通過與 RBC的Resetting去除⑶4+、⑶8+ T細胞。血液樣品用抗人⑶4和⑶8去除雞尾酒試劑標 記，在室溫下孵育20分鐘，然后血液在50ml離心管與等體積Ficoll-Hypaque的密度梯度 分層。在2500rpm離心25分鐘后，在Ficoll和血漿的界面收集已去除PBMC中⑶4+CD8+的 細胞，g卩DNT細胞，用0. 9%生理鹽水洗滌1次。
[0054] 3、體外培養(yǎng)DNT細胞。
[0055] 1)將步驟2獲得的DNT細胞在75cm2培養(yǎng)瓶中以1?6 X 106個/ml細胞在AM-V培 養(yǎng)基中37°C和5%C02培養(yǎng)3天，所述的培養(yǎng)瓶已用抗人⑶3單克隆抗體（克隆0KT3 ) (8 Pg/ml)包被，所述在ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (200 IU/ml)、重組人白介素4 (1 ng/ml)、重組人白介素7 (2 ng/ml)、重組人白介素12 (10 ng/ ml)、自體血楽（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0056] 2)第3天傳至另一個75cm2培養(yǎng)瓶，在相同條件以1?6X106個/ml細胞在AM-V 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天（75cm2培養(yǎng)瓶滿可傳至175cm2培養(yǎng)瓶)，所述ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶大 霉素（60單位/ml )、重組人白介素2 ( 200 IU/ml)、重組人白介素4 (1 ng/ml)、重組人 白介素7 (2 ng/ml)、重組人白介素12 (10 ng/ml)、自體血楽（2 v%)和AB血清（6 v%)。
[0057] 3)第7天，在175cm2培養(yǎng)瓶傳瓶，以1~6X 106個/ml細胞在AM-V培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)3天，所述ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (200 IU/ml)、 重組人白介素4 (1 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（120 ng/ml)、重組人白介素12 (10 ng/ml )、自體血楽（5 v% )和 AB 血清（6 v%)。
[0058] 4)第10天2個175cm2培養(yǎng)瓶入袋培養(yǎng)，以f6X106個/ml細胞在GT-T551培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至第20天，所述GT-T551培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人 白介素2 (200 IU/ml)、重組人白介素4 (1 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（120 ng/ ml)、重組人白介素12 (10 ng/ml)、人血白蛋白（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0059] 4、洗滌、收集DNT細胞。
[0060] 第20天，收獲DNT細胞，用250ml尖底離心瓶收集細胞，離心，用0. 9w%生理鹽水 洗滌'離心。
[0061] 5、制成DNT細胞制劑。
[0062] 將步驟4之后收集到的DNT細胞加入100ml的0. 9w%的生理鹽水袋中，并添加500 IU/ml的重組人白介素2和2 v%的人血白蛋白。
[0063] 實施例3 人DNT細胞 1、采集人體外周血樣品。
[0064] 從健康供體收集3(T60 ml外周血到含肝素化管中。
[0065] 2、體外分離純化 按照廠商說明書，利用Rossettsep?試劑盒（Stem Cell Technologies Inc),通過與 RBC的Resetting去除⑶4+、⑶8+ T細胞。血液樣品用抗人⑶4和⑶8去除雞尾酒試劑標 記，在室溫下孵育20分鐘，然后血液在50ml離心管與等體積Ficoll-Hypaque的密度梯度 分層。在2500rpm離心25分鐘后，在Ficoll和血漿的界面收集收集已去除PBMC中⑶4+⑶8+ 的細胞，即DNT細胞，用0. 9%生理鹽水洗滌1次。
[0066] 3、體外培養(yǎng)DNT細胞。
[0067] 1)將步驟2獲得的DNT細胞在75cm2培養(yǎng)瓶中以1?6X 106個/ml細胞在AM-V培 養(yǎng)基中37°C和5%C02培養(yǎng)3天，所述的培養(yǎng)瓶已用抗人⑶3單克隆抗體(克隆0KT3 ) ( 5 Pg/ml)包被，所述在ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (1000 IU/ml)、重組人白介素4 (4 ng/ml)、重組人白介素7 (15 ng/ml)、重組人白介素12 (15 ng/ml)、自體血楽（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0068] 2)第3天傳至另一個75cm2培養(yǎng)瓶，在相同條件以1?6X106個/ml細胞在AM-V 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4天（75cm2培養(yǎng)瓶滿可傳至175cm2培養(yǎng)瓶)，所述ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶 大霉素（60單位/ml )、重組人白介素2 ( 1000 IU/ml)、重組人白介素4 (4 ng/ml)、重 組人白介素7 (15 ng/ml)、重組人白介素12 (15 ng/ml)、自體血楽（2 v%)和AB血清（6 V%)。
[0069] 3)第7天，在175cm2培養(yǎng)瓶傳瓶，以1~6X 106個/ml細胞在AM-V培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)3天，所述ΑΙΜ-V培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組人白介素2 (1000 IU/ml)、 重組人白介素4 (4 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（150 ng/ml)、重組人白介素12 (15 ng/ml )、自體血楽（5 v% )和 AB 血清（6 v%)。
[0070] 4)第10天2個175cm2培養(yǎng)瓶入袋培養(yǎng)，以1?6X 106個/ml細胞在ALyS505N培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至第20天，所述ALyS505N培養(yǎng)基包含了慶大霉素（60單位/ml)、重組 人白介素2 (1000 IU/ml)、重組人白介素4 (4 ng/ml)、可溶性抗人⑶3單克隆抗體（150 ng/ml)、重組人白介素12 (15 ng/ml)、人血白蛋白（5 v%)和AB血清（6 v%)。
[0071] 4、洗滌、收集DNT細胞。
[0072] 第20天，收獲DNT細胞，用250ml尖底離心瓶收集細胞，離心，用0. 9w%生理鹽水 洗滌，離心。
[0073] 5、制成DNT細胞制劑。
[0074] 將步驟4之后收集到的DNT細胞加入100ml的0. 9w%的生理鹽水袋中，并添加500 IU/ml的重組人白介素2和2 v%的人血白蛋白。
[0075] 本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基不局限于上述實施例中的公開范圍，一般比較優(yōu)選的無動 物血清培養(yǎng)基為Life Technology公司的AM-V培養(yǎng)基、寶日醫(yī)公司的GT-T551培養(yǎng)基、日 本細胞科學研究所的ALyS505N培養(yǎng)基、德國Pan-biotech公司的PANSERIN701培養(yǎng)基、美 國L0NZA公司的X-VIV010培養(yǎng)基或美國L0NZA公司的X-VIV015培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基可以 組合使用，更優(yōu)選的方案是在0-7天選用AM-V培養(yǎng)基、X-VIV010培養(yǎng)基或X-VIV015培養(yǎng) 基，10天?20天選用PANSERIN701培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng)基或ALyS505N培養(yǎng)基。
[0076] 無動物血清培養(yǎng)基中的蛋白成分不局限于上述實施例中的公開范圍，一般可以添 加整個培養(yǎng)基f l〇v%的AB血清或f 10v%的自體血漿或f 10v%的人血白蛋白，上述三種 成分可以單一的添加也可以兩種或三種組合添加。
[0077] 無動物血清培養(yǎng)基的具體配方也不局限于上述實施例中的公開范圍，一般比較優(yōu) 選的配方為：(Γ3天采用的無動物血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶已用1~10 Pg/ml的抗人CD3單克隆 抗體（克隆0KT3)包被，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介 素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、l~20ng/ml的重組人白介素7、1~20 ng/ml的重組人 白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v%的AB血清。
[0078] 3?7天采用的無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素 、ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、1?5 ng/ml的重組人白介素4、1?20 ng/ml的重組人白介素7、 1?20 ng/ml的重組人白介素12、1?5v%的自體血漿和1?10v%的AB血清。
[0079] 7?10天采用的無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素 、ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、1?5 ng/ml的重組人白介素4、5(T200 ng/ml的可溶性抗人⑶3 單克隆抗體、廣2〇 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v%的AB血清。
[0080] 1(Γ20天采用的無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、10(Γ1000 IU/ml的重組人白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、5(T200 ng/ml的可溶性抗人⑶3單 克隆抗體、廣2〇 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的人血白蛋白和1?10v%的AB血清。
[0081] 雖然本發(fā)明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明的保護范圍，任何熟 悉該項技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所作的更動與潤飾，均應屬于本 發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方法依次包括以下 步驟：1)采集人體外周血樣品，2)體外分離純化獲得DNT細胞，3)體外培養(yǎng)DNT細胞，4)洗 滌、收集DNT細胞，其特征在于：所述的步驟3)依次在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物 血清培養(yǎng)基，再加上1?l〇v%的AB血清、1?10v%的自體血漿或1?10v%的人血白蛋白中的 一種或多種作為添加蛋白成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方 法，其特征在于：所述的步驟3)中不收集、離心、洗滌細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方 法，其特征在于：所述的步驟4)之后重懸DNT細胞，將收集到的DNT細胞加入0. 9w%的生理 鹽水袋中，并添加 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2和1飛v%的人血白蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方 法，其特征在于所述的步驟3)具體過程為： (Γ3天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶已用1~10 Pg/ml的抗人⑶3單克隆抗體(克隆0KT3)包 被，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素 、ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人 白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、l~20ng/ml的重組人白介素7、1~20 ng/ml的重 組人白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v%的AB血清； 3~7天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、廣5 ng/ml的重組人白介素4、廣20 ng/ml的重組人 白介素7、1?20 ng/ml的重組人白介素12、1?5v%的自體血漿和1?10v%的AB血清； 7~10天在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、1?5 ng/ml的重組人白介素4、50?200 ng/ml的可溶 性抗人⑶3單克隆抗體、廣20 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的自體血漿和1?10v% 的AB血清； 1(Γ20天在培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，采用無動物血清培養(yǎng)基，添加5(Γ200單位/ml的慶大霉素、 ΚΚΓ?ΟΟΟ IU/ml的重組人白介素2、1~5 ng/ml的重組人白介素4、5(T200 ng/ml的可溶性 抗人⑶3單克隆抗體、1?20 ng/ml的重組人白介素12、1?10v%的人血白蛋白和1?10v% 的AB血清。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的 方法，其特征在于：所述的無動物血清培養(yǎng)基為Life Technology公司的AM-V培養(yǎng)基、寶 日醫(yī)公司的GT-T551培養(yǎng)基、日本細胞科學研究所的ALyS505N培養(yǎng)基、德國Pan-biotech 公司的PANSERIN701培養(yǎng)基、美國L0NZA公司的X-VIV010培養(yǎng)基或美國L0NZA公司的 X-VIV015培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的方 法，其特征在于：所述的(Γ7天，無動物血清培養(yǎng)基選用AM-V培養(yǎng)基、X-VIV010培養(yǎng)基或 X-VIV015培養(yǎng)基；10天?20天，無動物血清培養(yǎng)基選用PANSERIN701培養(yǎng)基、GT-T551培養(yǎng) 基或ALyS505N培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用無動物血清培養(yǎng)體系大規(guī)模擴增人外周血DNT細胞的 方法，其特征在于：所述的步驟4)中采用尖底離心瓶收集DNT細胞，接著離心處理，然后用 0. 9w%的生理鹽水洗滌，再離心處理。
【文檔編號】C12N5/0783GK104109653SQ201410259944
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】楊黎明, 邊金鐸, 陳艷, 張麗 申請人:浙江瑞順生物技術(shù)有限公司