一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，本發(fā)明包括嗜熱鏈球菌菌粉制備、德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備、及將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照1.5-2:1的重量比混合均勻，充氮?dú)獍b后得產(chǎn)品。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，所得發(fā)酵劑具有含活性乳酸菌數(shù)量高、保質(zhì)期長(zhǎng)、發(fā)酵乳性能優(yōu)良、使用簡(jiǎn)單、使用量少等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種發(fā)酵劑的制作方法，特別涉及一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑 的制作方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑已廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)，直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑作 為生物研究的一個(gè)領(lǐng)域，對(duì)人類的營(yíng)養(yǎng)和健康具有重大的意義。目前直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑 在食品中主要應(yīng)用于發(fā)酵乳制品，同時(shí)也逐步被應(yīng)用于其他功能性食品，如果汁、冰激凌、 糖果等。
[0003] 2012年，市場(chǎng)研究機(jī)構(gòu)Euromonitor International調(diào)研數(shù)據(jù)表明，2011全球類 似于直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑的發(fā)酵食品和補(bǔ)充劑的銷售額為280億美元，預(yù)計(jì)到2016年，將 以50%的增長(zhǎng)達(dá)到420億美元。在2012年的益生菌全球市場(chǎng)份額中，最大的收入來源是以 直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑為基礎(chǔ)開發(fā)的乳酸飲料，約140億美元的市場(chǎng)份額，其次是直接采用 直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑生產(chǎn)的酸奶已達(dá)113億美元，然后為補(bǔ)充劑27億美元及果汁1. 35億 美元。歐洲市場(chǎng)上益生菌乳酸飲料領(lǐng)軍的產(chǎn)品為Danone和Yaklut，在2003年它們的銷售 額就達(dá)到12億歐元。在日本、法國、俄羅斯、德國等國家，直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑的研究與應(yīng) 用受到廣泛重視，其中，法國每年用在此方面的研究開發(fā)經(jīng)費(fèi)高達(dá)數(shù)億法郎，其重視程度可 見一般。
[0004] 但直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑在我國的研究與利用，與發(fā)達(dá)國家相比尚存在一定的距 離。中國的直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)，起步很遲，是進(jìn)入21世紀(jì)后才被重視和發(fā)展起來的。 目前，中國直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為核心的菌種基本上都受制于他人。國內(nèi)企業(yè) 所使用的菌種幾乎全部源自進(jìn)口或由外資企業(yè)在華設(shè)廠所生產(chǎn)而提供的，其中，最主要的 是杜邦和科漢森兩大企業(yè)。
[0005] 目前，我司每年對(duì)益生菌菌粉的需求達(dá)到15萬包（約合15噸)，購買費(fèi)用達(dá)到幾 千萬元人民幣。在此背景下，開發(fā)出和國外先進(jìn)的直投式發(fā)酵菌劑功能及發(fā)酵乳風(fēng)味相似 的菌種發(fā)酵劑，從而完全替代目前生產(chǎn)所用的國外直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑。
[0006] 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目前生產(chǎn)上所用的直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑菌粉活力相對(duì)偏低，有的還 不足10 1(lCFU/g，在生產(chǎn)中需要添加的劑量過大，同時(shí)傳代不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，工藝簡(jiǎn)單 易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)，所得發(fā)酵劑具有含活性乳酸菌數(shù)量高、保質(zhì)期長(zhǎng)、發(fā)酵乳性能優(yōu)良、 使用簡(jiǎn)單、使用量少等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，包括如下步驟： 一、嗜熱鏈球菌菌粉制備 (1) 配制嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基，將嗜熱鏈球菌接種于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā) 酵培養(yǎng)，接種量為〇. 1-0. 3wt%，嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在6. 6-7. 0之間，培養(yǎng) 溫度設(shè)定為36. 5-44. 5°C，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為4-5小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用5-10%的氨水 進(jìn)行發(fā)酵pH控制； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000-10000g，離心時(shí)間 10-30分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8-1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二 次離心，二次離心力控制在6000-8000g，離心時(shí)間10-30分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥 與凍干保護(hù)劑按照1:1-2的重量比混合均勻； (3) 將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 1-0. 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 嗔射入液氣中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒猶得液氣造粒半成品； 二次離心的主要目的有二個(gè)：1.進(jìn)一步消除離心菌泥中的乳酸殘留，從而避免底物反 饋抑制的二次發(fā)生，2.防止培養(yǎng)基中不適合直接添加到發(fā)酵乳中的物質(zhì)余量殘留，由于培 養(yǎng)基中某些成分直接加入食品中對(duì)人體不宜，因此通過二次離心可消除潛在的食品安全隱 患。
[0009] (4)液氮造粒半成品在_40°C下真空冷凍干燥24-72小時(shí)得到嗜熱鏈球菌菌粉； 二、 德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備 (a)配制德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基，將德式乳桿菌保加利亞亞種接種于德式乳 桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為〇. 1-0. 3wt%，德式乳桿菌保加 利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在5. 1-5. 6之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37. 0-42. 5°C，發(fā)酵時(shí) 間設(shè)定為6-8小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中米用5-10%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制； 發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用5-10%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制，氨水溶解于培養(yǎng)基后所形成的的 銨根離子可以作為微生物發(fā)酵的有限氮源供其生長(zhǎng)所需，銨鹽、硝酸鹽等雖然不是乳酸菌 的最適碳源，但乳酸菌依然可以利用其進(jìn)行生物代謝，高密度發(fā)酵過程中氨水在調(diào)節(jié)pH的 過程中，會(huì)有產(chǎn)生銨鹽，這些銨鹽在高密度發(fā)酵對(duì)數(shù)期，可以快速便捷的隨著調(diào)節(jié)pH的進(jìn) 行，通過滲透擴(kuò)散和膜蛋白運(yùn)輸?shù)茸饔脼槿樗峋焖僭鲋堤峁┑磩?dòng)力。
[0010] (b)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000-10000g，離心時(shí) 間10-30分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8-1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行 二次離心，二次離心力控制在6000-8000g，離心時(shí)間10-30分鐘，隨后將得到的二次離心菌 泥與凍干保護(hù)劑按照1:1-2的重量比混合均勻； (c) 將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 1-0. 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 嗔射入液氣中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒猶得液氣造粒半成品； (d) 液氮造粒半成品在-40°C下真空冷凍干燥24-72小時(shí)得到德式乳桿菌保加利亞亞 種菌粉； 三、 混合 將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照1. 5-2:1的重量比混合均勻， 充氮?dú)獍b后得產(chǎn)品。
[0011] 作為優(yōu)選，所述嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖 1-9%，脫脂乳酶解物1-10%，濃縮番茄汁1-5%，水溶性小麥蛋白1-3%，酵母抽提物0. 1-2%，余 量為無菌水。
[0012] 由于嗜熱鏈球菌在生長(zhǎng)增值過程中，需要消耗大量的有機(jī)氮源，尤其是氨基酸類 物質(zhì)，但由于菌體自身不能產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，因此生長(zhǎng)極易受到影響和抑制，而濃縮 番茄汁、酵母抽提物這些成分富含氨基酸、維生素類，極易被乳酸菌利用，通過添加這些成 分后，可大大刺激嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)增值；水溶性小麥蛋白中由于富含天然谷光氨肽功能 成分，可有效刺激乳酸菌的快速生長(zhǎng)繁殖，因此，本發(fā)明采用上述特定配比的嗜熱鏈球菌培 養(yǎng)基配方。
[0013] 作為優(yōu)選，所述德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì) 的組分組成：乳糖1-9%，脫脂乳酶解物1-10%，濃縮番茄汁1-5%，酵母抽提物0. 1-2%， Κ2ΗΡ04 · 3H20 0· 1-3%，Tween 0· 01-6%，甲酸鈉 0· 01-0. 1%，余量為無菌水。
[0014] 因此，本發(fā)明采用上述特定配比的德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基配方可有效刺 激德式乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖能力，達(dá)到發(fā)酵周期短，乳酸菌活菌含量高的目的，并提高終發(fā)酵 液中活性菌的得率。
[0015] 作為優(yōu)選，所述凍干保護(hù)劑由以下重量百分比計(jì)的組分混合制成：3-10%的甘油， 0. 1-1%的維生素 C，1-3%的小牛血清，0. 1-3%的甘露醇，1-5%的蔗糖，0. 1-0. 5%的明膠， 1-10%的海藻多糖，余量為無菌水。
[0016] 海藻多糖和小牛血清的添加目的是為了給乳酸菌提供一個(gè)適宜的保護(hù)外層；甘露 醇、蔗糖、甘油的添加目的是為了通過胞膜的滲透作用對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性提供保 護(hù)；Vc具有抗氧化作用，通過其添加可提高乳酸菌在加工過程中對(duì)空氣中氧的耐受性；以 上3類物質(zhì)的添加，主要是為了增強(qiáng)乳酸菌在冷凍干燥過程中的耐受性，提高最終樣品中 的存活率。明膠的添加是為了提高冷凍干燥過程中的凍結(jié)冰點(diǎn)，同時(shí)可提高凍干菌種樣品 的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度，隨著玻璃化轉(zhuǎn)化溫度的提升，可有效節(jié)約能耗，研究表明，玻璃化溫度 每提升1°C，冷凍干燥過程中的能耗可節(jié)約13%左右，而隨著明膠的加入，凍干保護(hù)劑各物 質(zhì)間的協(xié)同效應(yīng)明顯加強(qiáng)，玻璃化轉(zhuǎn)化溫度提高了近5°C，保護(hù)效果明顯增加，最終活菌數(shù) 可達(dá) 10n-1014cfu/g。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟（3)及步驟（c)中噴嘴與液氮液面的垂直距離為20-50cm，噴嘴孔 徑為 0. 1-5_。
[0018] 由于在菌種的冷凍干燥過程中，菌泥和保護(hù)劑混合后的樣品含水量較大，在冷凍 過程中，隨著溫度的降低，樣品中的水將逐漸凝結(jié)成冰晶，隨著冰晶的長(zhǎng)大，將會(huì)刺破胞膜， 造成乳酸菌不可逆的損傷，影響最終產(chǎn)品中的活菌數(shù)。而本發(fā)明采取急速的溫度降低，采用 液氮造粒手段，將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物噴射入液氮中，可迅速形成大量的微 小冰核，而不會(huì)形成大顆粒冰晶，從而最大限度的減少對(duì)乳酸菌的損傷，最大限度的保證最 終產(chǎn)品中較高的活菌數(shù)。
[0019] 控制二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物的輸送壓力、噴嘴與液氮液面的垂直距離 及噴嘴孔徑保證二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在進(jìn)入液氮時(shí)都成為了液滴狀，保證液 氮造粒的效果。
[0020] 作為優(yōu)選，嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在嗜熱鏈 球菌接種后的第2-4小時(shí)，補(bǔ)加占嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基5-15%體積的嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基， 嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：10-15%的乳糖，0. 1-3%的 酵母抽提物，〇. 1-5%的蛋白胨，余量為無菌水。
[0021] 作為優(yōu)選，德式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工 藝為在德式乳桿菌保加利亞亞種接種后的第2-4小時(shí)，補(bǔ)加德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng) 基5-15%體積的德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng) 基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：10-15%的乳糖，1-10%的脫脂乳酶解物，0. 1-3% 的酵母抽提物，1-5%的濃縮番茄汁，余量為無菌水。
[0022] 本發(fā)明采用補(bǔ)料工藝，乳酸菌在高密度發(fā)酵過程中，當(dāng)菌體處于延遲期時(shí)，由于菌 體對(duì)新培養(yǎng)基有一個(gè)適應(yīng)過程，因此物料中的碳源濃度一般不能太高，否則容易造成較高 的滲透壓，影響菌體增殖生長(zhǎng)的啟動(dòng)，因此初始培養(yǎng)基中的糖濃度一般不會(huì)太高；當(dāng)其生長(zhǎng) 達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，培養(yǎng)基中的碳源(乳糖等）即將消耗完全，同時(shí)細(xì)胞合成及各種合成 代謝活動(dòng)需要大量的維生素及氨基酸類物質(zhì)，因此在此時(shí)適時(shí)補(bǔ)充乳酸菌快速生長(zhǎng)所需要 的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是保證獲得最大發(fā)酵得率的有效手段，而補(bǔ)充的相關(guān)物質(zhì)主要是乳糖、酵 母抽提物、蛋白胨等，可以明顯增加最終發(fā)酵液中的乳酸菌得率，最終活菌數(shù)比未補(bǔ)料工藝 高出5-10倍的活菌數(shù)。
[0023] 作為優(yōu)選，所述脫脂乳酶解物的制備方法為：將質(zhì)量濃度10-20%的脫脂乳水溶液 加熱到55_60°C，加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑添加量為脫脂乳水溶液重量的0. 01-0. 1%， 100-150rpm/min轉(zhuǎn)速的攪拌條件下，保溫酶解l-3h，過200-300目篩網(wǎng)，得到的濾液即為脫 脂乳酶解物。
[0024] 采用本發(fā)明的工藝制備的脫脂乳酶解物發(fā)酵培養(yǎng)效果好。
[0025] 作為優(yōu)選，所述復(fù)合酶制劑由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶組成，蛋白酶：脂肪酶：乳 糖酶的重量比=2-3:2-3:1。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是： 1、工藝簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0027] 2、具有含活性乳酸菌數(shù)量高、保質(zhì)期長(zhǎng)、發(fā)酵乳性能優(yōu)良、使用簡(jiǎn)單、使用量少等 優(yōu)點(diǎn)。
[0028] 3、在使用過程中，一般為一次性使用，方便、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，不需要像傳統(tǒng)發(fā)酵劑使用 那樣，進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)培繁殖傳代，減少了相關(guān)菌種生產(chǎn)所需的投資和人員投入，同時(shí)可最大限 度的降低雜菌或其他微生物污染的幾率，確保每批次發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，減少潛在的 不必要浪費(fèi)。
[0029] 4、產(chǎn)品性能穩(wěn)定，可在_18°C以下冷凍保存，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)24月；在室溫條件下也可 維持12月的發(fā)酵活力。在使用過程中，操作簡(jiǎn)單，只需要簡(jiǎn)單復(fù)水或者溶解于1-10%的脫 脂奶粉溶液中，就可直接用于生產(chǎn)；同時(shí)方便運(yùn)輸，適合長(zhǎng)距離配送。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0031] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0032] 本發(fā)明的原料濃縮番茄汁（5倍濃縮汁)、水溶性小麥蛋白、酵母抽提物等都為市售 產(chǎn)品。
[0033] 菌種來源：從市售發(fā)酵乳或自然發(fā)酵乳中分離出產(chǎn)粘能力強(qiáng)的嗜熱鏈球菌和產(chǎn)酸 性能好的德式乳桿菌保加利亞亞種。
[0034] 實(shí)施例1 : 一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，包括如下步驟： 一、嗜熱鏈球菌菌粉制備 (1)配制嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組 成：乳糖1%，脫脂乳酶解物10%，濃縮番茄汁1%，水溶性小麥蛋白1%，酵母抽提物2%，無菌水 85%。將嗜熱鏈球菌接種于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為0. lwt%，嗜 熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在6. 6-7. 0之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為36. 5°C，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定 為5小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用質(zhì)量濃度5%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0035] (2)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000g，離心時(shí)間30 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二次離心， 二次離心力控制在6000g，離心時(shí)間30分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按 照1:1的重量比混合均勻。
[0036] (3)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. IMpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為20cm，噴嘴孔徑為0. 1mm。
[0037] (4)液氮造粒半成品在_40°C下真空冷凍干燥24小時(shí)得到嗜熱鏈球菌菌粉。
[0038] 嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在嗜熱鏈球菌接種后 的第2小時(shí)，補(bǔ)加占嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基5%體積的嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌補(bǔ)料 培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：1〇%的乳糖，3%的酵母抽提物，5%的蛋白 胨，無菌水82%。
[0039] 二、德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備 (a)配制德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基的配方由 以下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖1%，脫脂乳酶解物10%，濃縮番茄汁1%，酵母抽提物2%， Κ2ΗΡ04 · 3Η20 0. 1%，Tween 0. 01%，甲酸鈉0. 01%，無菌水85. 88%。將德式乳桿菌保加利亞亞 種接種于德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為〇. lwt%，德式 乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在5. 1-5. 6之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37. 0°C，發(fā) 酵時(shí)間設(shè)定為8小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用5%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0040] (b)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000g，離心時(shí)間30 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二次離心， 二次離心力控制在6000g，離心時(shí)間30分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按 照1:1的重量比混合均勻。
[0041] (c)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. IMpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為20cm，噴嘴孔徑為0. 1mm。
[0042] (d)液氮造粒半成品在_40°C下真空冷凍干燥24小時(shí)得到德式乳桿菌保加利亞亞 種菌粉。
[0043] 德式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在德式 乳桿菌保加利亞亞種接種后的第2小時(shí)，補(bǔ)加德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基5%體積的德 式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下重 量百分比計(jì)的組分組成：10%的乳糖，10%的脫脂乳酶解物，3%的酵母抽提物，1%的濃縮番茄 汁，無菌水76%。
[0044] 上述凍干保護(hù)劑由以下重量百分比計(jì)的組分混合制成：3%的甘油，0. 1%的維生素 C，1%的小牛血清(市售)，3%的甘露醇，1%的蔗糖，0. 1%的明膠(市售)，10%的海藻多糖(市 售)，無菌水81. 8%。
[0045] 三、混合 將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照1. 5:1的重量比混合均勻，充 氮?dú)獍b后得產(chǎn)品。
[0046] 本發(fā)明中原料脫脂乳酶解物的制備方法為：將質(zhì)量濃度10%的脫脂乳水溶液加熱 到55°C，加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶組成，蛋白酶：脂肪酶：乳 糖酶的重量比=3:3:1,復(fù)合酶制劑添加量為脫脂乳水溶液重量的0. 01%, 100rpm/min轉(zhuǎn)速 的攪拌條件下，保溫酶解3h，過200目篩網(wǎng)，得到的濾液即為脫脂乳酶解物。
[0047] 實(shí)施例2 : 一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，包括如下步驟： 一、嗜熱鏈球菌菌粉制備 (1)配制嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分 組成：乳糖9%，脫脂乳酶解物1%，濃縮番茄汁5%，水溶性小麥蛋白3%，酵母抽提物0. 1%， 無菌水81. 9%。將嗜熱鏈球菌接種于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為 0. 3wt%，嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在6. 6-7. 0之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為44. 5°C，發(fā) 酵時(shí)間設(shè)定為4小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用10%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0048] (2)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在lOOOOg，離心時(shí)間10 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二次離心，二 次離心力控制在8000g，離心時(shí)間10分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按照 1: 2的重量比混合均勻。
[0049] (3)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0· 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為50cm，噴嘴孔徑為5mm。
[0050] (4)液氮造粒半成品在-40°C下真空冷凍干燥72小時(shí)得到嗜熱鏈球菌菌粉。
[0051] 嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在嗜熱鏈球菌接種后 的第4小時(shí)，補(bǔ)加占嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基15%體積的嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌補(bǔ)料 培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：15%的乳糖，0. 1%的酵母抽提物，0. 1%的蛋 白胨，無菌水84. 8%。
[0052] 二、德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備 (a)配制德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基的配方 由以下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖9%，脫脂乳酶解物1%，濃縮番茄汁5%，酵母抽提物 0. 1%，Κ2ΗΡ04 · 3H20 3%，Tween 6%，甲酸鈉0. 1%，無菌水75. 8%。將德式乳桿菌保加利亞亞 種接種于德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為〇. 3wt%，德式 乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在5. 1-5. 6之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為42. 5°C，發(fā) 酵時(shí)間設(shè)定為6小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用10%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0053] (b)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在10000g，離心時(shí)間10 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二次離心，二 次離心力控制在8000g，離心時(shí)間10分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按照 1: 2的重量比混合均勻。
[0054] (c)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為50cm，噴嘴孔徑為5mm。
[0055] (d)液氮造粒半成品在-40°C下真空冷凍干燥72小時(shí)得到德式乳桿菌保加利亞亞 種菌粉。
[0056] 德式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在德式 乳桿菌保加利亞亞種接種后的第4小時(shí)，補(bǔ)加德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基15%體積的 德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下 重量百分比計(jì)的組分組成：15%的乳糖，1%的脫脂乳酶解物，0.1%的酵母抽提物，5%的濃 縮番茄汁，無菌水78. 9%。
[0057] 上述凍干保護(hù)劑由以下重量百分比計(jì)的組分混合制成：10%的甘油，1%的維生素 C，3%的小牛血清(市售)，0.1%的甘露醇，5%的蔗糖，0.5%的明膠(市售)，1%的海藻多糖 (市售)，無菌水79.4%。
[0058] 三、混合 將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照2:1的重量比混合均勻，充氮 氣包裝后得產(chǎn)品。
[0059] 本發(fā)明中原料脫脂乳酶解物的制備方法為：將質(zhì)量濃度20%的脫脂乳水溶液加熱 到60°C，加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶組成，蛋白酶：脂肪酶：乳 糖酶的重量比=2:2:1,復(fù)合酶制劑添加量為脫脂乳水溶液重量的0. 1%, 150rpm/min轉(zhuǎn)速的 攪拌條件下，保溫酶解lh，過300目篩網(wǎng)，得到的濾液即為脫脂乳酶解物。
[0060] 實(shí)施例3 : 一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，包括如下步驟： 一、嗜熱鏈球菌菌粉制備 (1)配制嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組 成：乳糖3%，脫脂乳酶解物5%，濃縮番茄汁3%，水溶性小麥蛋白2%，酵母抽提物1%，無菌水 86%。將嗜熱鏈球菌接種于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為0. 2wt%，嗜 熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在6. 6-7. 0之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為40°C，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為 4. 5小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用8%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0061] (2)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在8000g，離心時(shí)間20 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 9% (質(zhì)量濃度）的NaCl溶液中，再進(jìn) 行二次離心，二次離心力控制在7000g，離心時(shí)間20分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍 干保護(hù)劑按照1:1的重量比混合均勻。
[0062] (3)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0· 2Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為30cm，噴嘴孔徑為1mm。
[0063] (4)液氮造粒半成品在_40°C下真空冷凍干燥48小時(shí)得到嗜熱鏈球菌菌粉。
[0064] 嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在嗜熱鏈球菌接種后 的第3小時(shí)，補(bǔ)加占嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基10%體積的嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌補(bǔ) 料培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：12%的乳糖，1%的酵母抽提物，2%的蛋白 胨，無菌水85%。
[0065] 二、德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備 (a)配制德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基的配方由 以下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖3%，脫脂乳酶解物5%，濃縮番茄汁3%，酵母抽提物1%， Κ2ΗΡ04 · 3H20 1%，Tween (市售）1%，甲酸鈉0. 05%，無菌水85. 95%。將德式乳桿菌保加利亞 亞種接種于德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為0. 2wt%，德 式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在5. 1-5. 6之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為40°C，發(fā) 酵時(shí)間設(shè)定為7小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用8%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制。
[0066] (b)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在8000g，離心時(shí)間20 分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 9%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二次離心， 二次離心力控制在7000g，離心時(shí)間20分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑按 照1:1的重量比混合均勻。
[0067] (c)將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 2Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 噴射入液氮中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒獲得液氮造粒半成品，噴嘴與液氮液面的 垂直距離為30cm，噴嘴孔徑為1mm。
[0068] (d)液氮造粒半成品在_40°C下真空冷凍干燥48小時(shí)得到德式乳桿菌保加利亞亞 種菌粉。
[0069] 德式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在德式 乳桿菌保加利亞亞種接種后的第3小時(shí)，補(bǔ)加德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基10%體積的 德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基，德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下 重量百分比計(jì)的組分組成：12%的乳糖，5%的脫脂乳酶解物，1%的酵母抽提物，3%的濃縮番 茄汁，無菌水79%。
[0070] 上述凍干保護(hù)劑由以下重量百分比計(jì)的組分混合制成：5%的甘油，0. 5%的維生 素 C，2%的小牛血清(市售)，1%的甘露醇，2%的蔗糖，0. 3%的明膠(市售)，4%的海藻多糖(市 售)，無菌水85. 2%。
[0071] 三、混合 將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照1. 5:1的重量比混合均勻，充 氮?dú)獍b后得產(chǎn)品。
[0072] 本發(fā)明中原料脫脂乳酶解物的制備方法為：將質(zhì)量濃度15%的脫脂乳水溶液加熱 到60°C，加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶制劑由蛋白酶、脂肪酶及乳糖酶組成，蛋白酶：脂肪酶：乳 糖酶的重量比=3:2:1,復(fù)合酶制劑添加量為脫脂乳水溶液重量的0. 05%, 120rpm/min轉(zhuǎn)速 的攪拌條件下，保溫酶解2h，過200目篩網(wǎng)，得到的濾液即為脫脂乳酶解物。
[0073] 采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵劑，其中含乳酸菌活菌數(shù)可達(dá)1. 1-6. IX 10nCFU/g，使 用量?jī)H為〇. 0001-0. 0006%的即可達(dá)到發(fā)酵乳基本要求，發(fā)酵過程中，菌種活力強(qiáng)，完全可 滿足生產(chǎn)所需。
[0074] 采用本發(fā)明方法制成的產(chǎn)品按照0. 0001-0. 0006%的量接種到滅菌處理的復(fù)原乳 或鮮牛奶中，經(jīng)4-5小時(shí)發(fā)酵，形成凝乳，發(fā)酵乳pH約為4. 3-4. 6左右，酸度維持87-95° T， 并且發(fā)酵乳基本無乳清析出，風(fēng)味良好，即可作為優(yōu)良的直投式發(fā)酵乳發(fā)酵劑進(jìn)行使用。
[0075] 以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權(quán)利要求】
1. 一種直投式乳酸菌發(fā)酵乳用發(fā)酵劑的制作方法，其特征在于，包括如下步驟： 一、 嗜熱鏈球菌菌粉制備 (1) 配制嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基，將嗜熱鏈球菌接種于嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā) 酵培養(yǎng)，接種量為〇. 1-0. 3wt%，嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在6. 6-7. 0之間，培養(yǎng) 溫度設(shè)定為36. 5-44. 5°C，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為4-5小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用5-10%的氨水 進(jìn)行發(fā)酵pH控制； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000-10000g，離心時(shí)間 10-30分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8-1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二 次離心，二次離心力控制在6000-8000g，離心時(shí)間10-30分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥 與凍干保護(hù)劑按照1:1-2的重量比混合均勻； (3) 將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 1-0. 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 嗔射入液氣中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒猶得液氣造粒半成品； (4) 液氮造粒半成品在-40°C下真空冷凍干燥24-72小時(shí)得到嗜熱鏈球菌菌粉； 二、 德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉制備 (a) 配制德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基，將德式乳桿菌保加利亞亞種接種于德式乳 桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為〇. 1-0. 3wt%，德式乳桿菌保加 利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng)過程中：pH維持在5. 1-5. 6之間，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37. 0-42. 5°C，發(fā)酵時(shí) 間設(shè)定為6-8小時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中米用5-10%的氨水進(jìn)行發(fā)酵pH控制； (b) 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心力控制在6000-10000g，離心時(shí)間 10-30分鐘，隨后將離心得到的菌泥在無菌條件下復(fù)溶于0. 8-1%的NaCl溶液中，再進(jìn)行二 次離心，二次離心力控制在6000-8000g，離心時(shí)間10-30分鐘，隨后將得到的二次離心菌泥 與凍干保護(hù)劑按照1:1-2的重量比混合均勻； (c) 將二次離心菌泥與凍干保護(hù)劑混合物在0. 1-0. 5Mpa的輸送壓力下，經(jīng)過噴嘴垂直 嗔射入液氣中形成固態(tài)顆粒，過濾收集固態(tài)顆粒猶得液氣造粒半成品； (d) 液氮造粒半成品在-40°C下真空冷凍干燥24-72小時(shí)得到德式乳桿菌保加利亞亞 種菌粉； 三、 混合 將嗜熱鏈球菌菌粉與德式乳桿菌保加利亞亞種菌粉按照1. 5-2:1的重量比混合均勻， 充氮?dú)獍b后得產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基的配方由以 下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖1-9%，脫脂乳酶解物1-10%，濃縮番茄汁1-5%，水溶性小 麥蛋白1-3%，酵母抽提物0. 1-2%，余量為無菌水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于：所述德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng) 基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：乳糖1-9%，脫脂乳酶解物1-10%，濃縮番茄汁 1-5%，酵母抽提物 0· 1-2%，Κ2ΗΡ04 · 3H20 0· 1-3%，Tween 0· 01-6%，甲酸鈉 0· 01-0. 1%，余量 為無菌水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的制作方法，其特征在于：所述凍干保護(hù)劑由以下重量 百分比計(jì)的組分混合制成：3-10%的甘油，0. 1-1%的維生素 C，1-3%的小牛血清，0. 1-3%的 甘露醇，1-5%的蔗糖，0. 1-0. 5%的明膠，1-10%的海藻多糖，余量為無菌水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的制作方法，其特征在于：步驟（3)及步驟（c)中噴嘴 與液氮液面的垂直距離為20-50cm，噴嘴孔徑為0. l-5mm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于：嗜熱鏈球菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中采用 補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在嗜熱鏈球菌接種后的第2-4小時(shí)，補(bǔ)加占嗜熱鏈球菌培養(yǎng)基 5-15%體積的嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì) 的組分組成：10-15%的乳糖，0. 1-3%的酵母抽提物，0. 1-5%的蛋白胨，余量為無菌水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于：德式乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵培養(yǎng) 過程中采用補(bǔ)料工藝，所述補(bǔ)料工藝為在德式乳桿菌保加利亞亞種接種后的第2-4小時(shí)， 補(bǔ)加德式乳桿菌保加利亞亞種培養(yǎng)基5-15%體積的德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基， 德式乳桿菌保加利亞亞種補(bǔ)料培養(yǎng)基的配方由以下重量百分比計(jì)的組分組成：10-15%的 乳糖，1-10%的脫脂乳酶解物，0. 1-3%的酵母抽提物，1-5%的濃縮番茄汁，余量為無菌水。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2或3或6或7所述的制作方法，其特征在于：所述脫脂乳酶解物的 制備方法為：將質(zhì)量濃度10-20%的脫脂乳水溶液加熱到55-60°C，加入復(fù)合酶制劑，復(fù)合酶 制劑添加量為脫脂乳水溶液重量的〇. 01-0. 1%，100-150rpm/min轉(zhuǎn)速的攪拌條件下，保溫 酶解l-3h，過200-300目篩網(wǎng)，得到的濾液即為脫脂乳酶解物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制作方法，其特征在于：所述復(fù)合酶制劑由蛋白酶、脂肪酶及 乳糖酶組成，蛋白酶：脂肪酶：乳糖酶的重量比=2-3:2-3:1。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK104152371SQ201410244634
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】侯保朝, 李言郡, 李寶磊, 趙建云, 葛紅娟, 邢良英, 馬廣輝, 范秋領(lǐng), 陳琳, 陳蘇, 徐顯睿, 陳麗娥 申請(qǐng)人:杭州娃哈哈科技有限公司