一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用，菌株代號為JF-7，菌株26SrDNAD1/D2區(qū)Genbank登錄號為KJ685388，現(xiàn)保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.8870；以其為發(fā)酵酵母，常規(guī)法釀造具有高甘油含量、口感肥碩的干白葡萄酒，酒中的甘油含量高達8.5g/L，比常用釀酒酵母菌株釀造的干白葡萄酒提高40%以上，提高了干白葡萄酒中的甘油含量，口感肥碩圓潤，從而提升了干白葡萄酒的質(zhì)量。
【專利說明】一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地講是一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】:
在葡萄酒發(fā)酵過程中，甘油的主要功能是維持酵母細胞內(nèi)NAD+/NADH的平衡，對發(fā)酵啟動具有重要作用，還是發(fā)酵過程中滲透壓力的代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)。甘油在葡萄酒中的感官閾值為5.2 g/L，當(dāng)其濃度超過此值時會賦予葡萄酒甜味。甘油的黏性和甜味可使葡萄酒具有圓潤、柔滑、甘甜、肥碩和更易入口的特性。甘油也可平衡酒中的酸感，增加口感復(fù)雜性，是高品質(zhì)葡萄酒的重要成分；但現(xiàn)有的葡萄酒中甘油含量較低，從而影響產(chǎn)品的口感和品質(zhì)。
[0003]不同葡萄酒酵母菌株間3-磷酸甘油脫氫酶活性的不同導(dǎo)致甘油生成量差異很大，因此在葡萄酒發(fā)酵過程中除了改善發(fā)酵工藝(如發(fā)酵溫度，pH，溶氧，等)來提高葡萄酒中甘油產(chǎn)量外，通過篩選高產(chǎn)甘油的菌株作為酒精發(fā)酵的主導(dǎo)菌株是提高葡萄酒質(zhì)量的重要途徑。在眾多葡萄酒釀造酵母的相關(guān)專利(如，一種玫瑰香葡萄酒專用釀酒酵母及其在葡萄酒釀造中的應(yīng)用，CN101701195B ;—種用于風(fēng)干葡萄酒的酵母及篩選方法，CN102649940A)中，未見高產(chǎn)甘油的釀造酵母專利。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是克 服上述已有技術(shù)的不足，而提供一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母。
[0005]本發(fā)明的另一目的提供一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母在干白葡萄酒中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明主要解決現(xiàn)有葡萄酒中甘油含量低而影響產(chǎn)品口感和質(zhì)量的問題。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母，菌株代號為JF-7,該菌株已于2014年2月28日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏地址:北京市朝陽區(qū)大屯路3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0.8870，建議分類命名為:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0008]本發(fā)明的高產(chǎn)甘油的釀酒酵母，其形態(tài)特征；菌落為奶油色稍帶綠色，球形凸出，表面光滑，不透明，為釀酒酵母的顯著特征。
[0009]本發(fā)明一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母，是從霞多麗葡萄品種中得到的，篩選過程是:采摘成熟霞多麗葡萄，破碎后分汁分裝無菌容器中進行自然發(fā)酵3-5d ;取Iml發(fā)酵葡萄汁經(jīng)逐級稀釋后涂布篩選培養(yǎng)基上，所用的篩選培養(yǎng)基為:葡萄糖10-40 g/L，甘油20-30 g/L,蛋白胨 10-20 g/L，酵母粉 5-15 g/L, Na2HPO4 2-6 g/L, KH2PO4 2-6 g/L，MgS04 1.2-5 g/L，氯霉素0.1-0.4 g/L, pH 6.5-8 ;在25_32°C下培養(yǎng)3d ;選取有典型酵母菌菌落特征的單菌落，重復(fù)劃線分離多次，獲得純培養(yǎng)并甘油管保藏(_20°C)；
將分離的酵母菌株采用改進的YEH)培養(yǎng)基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)進行液體培養(yǎng)，發(fā)酵5d采用高效液相色譜法(中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T 2544-2010)測定甘油含量，挑取高產(chǎn)甘油菌株；選育的菌株進行發(fā)酵產(chǎn)氣試驗、耐受SO2能力試驗、耐受酒精能力試驗、耐受高糖濃度試驗、耐受酸能力試驗，獲得高產(chǎn)甘油且適用葡萄酒釀造工藝的一株釀酒酵母JF-7 ;菌株JF-7經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列測定，確定為釀酒酵母(Saccharomyces cere vi si ae )。
[0010]本發(fā)明采用的發(fā)酵產(chǎn)氣性能試驗，具體過程為:采用杜氏管發(fā)酵法，將IOml改進的YEH)培養(yǎng)基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)加入含有杜氏管的試管中，滅菌冷卻后接入酵母菌，在28下。C培養(yǎng)，按照杜氏管充滿氣體的時間判定產(chǎn)氣能力大小。
[0011]本發(fā)明中的酵母菌耐受能力試驗，具體為:采用杜氏管發(fā)酵法，將IOml改進的YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)加入含有杜氏管的試管中，添加無水乙醇、蘋果酸、葡萄糖和SO2至不同濃度，其中無水乙醇和SO2為滅菌后添加，蘋果酸和葡萄糖為滅菌前添加。接入酵母菌，在28下。C培養(yǎng)，按照杜氏管充滿氣體的時間判定產(chǎn)氣能力大小。
[0012]采用上述的高產(chǎn)甘油的釀酒酵母JF-7為發(fā)酵酵母生產(chǎn)干白葡萄酒的方法，以破碎除梗壓榨后的葡萄汁為原料，采用JF-7為發(fā)酵劑，控溫15-20°C發(fā)酵，經(jīng)IOd后發(fā)酵醪殘?zhí)?lt; 4g/L后發(fā)酵結(jié)束，測定相關(guān)指標(biāo)，并與商品化釀酒酵母進行對比；本發(fā)明的干白葡萄酒產(chǎn)品具有較高甘油含量，香氣濃郁且有別于商品化酵母發(fā)酵產(chǎn)品。
[0013]本發(fā)明所述的一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用與已有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著進步，本發(fā)明通過選擇性篩選方法，分離出一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母，從而能夠在干白葡萄酒的發(fā)酵生產(chǎn)中依靠酵母菌自身產(chǎn)生甘油，生產(chǎn)的干白葡萄酒中的甘油含量高達8.5 g/L，比常用釀酒酵母菌株釀造的干白葡萄酒提高40%以上，口感肥碩圓潤，香氣濃郁，對于提升干白葡萄酒的產(chǎn)品質(zhì)量具有積極作用。
[0014]具體實 施方式:
為了更好地理解與實施，下面結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明；所舉實施例僅用于解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0015]實施例1:采摘中國山東蓬萊地區(qū)的成熟霞多麗葡萄，破碎后分汁分裝無菌容器中進行自然發(fā)酵4d ;取Iml發(fā)酵葡萄汁經(jīng)逐級稀釋后涂布篩選培養(yǎng)基上，所用的篩選培養(yǎng)基為:葡萄糖 10 g/L，甘油 30 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母粉 5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, KH2PO4 2 g/L，MgS04 1.2 g/L，氯霉素0.1 g/L, pH 6.5，在28°C下培養(yǎng)3d ;選取有典型酵母菌菌落特征的單菌落，重復(fù)劃線分離多次，獲得純培養(yǎng)并甘油管保藏(_20°C );將分離的酵母菌株采用改進的YEH)培養(yǎng)基(葡萄糖220g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L)進行液體培養(yǎng)，裝液量200ml/500ml瓶，在28°C下靜置發(fā)酵5d，采用高效液相色譜法測定甘油含量，獲得高產(chǎn)甘油的酵母菌株一株，即釀酒酵母JF-7，甘油產(chǎn)量為14.8 g/L。
[0016]將上述的釀酒酵母JF-7用于干白葡萄酒釀制，以破碎除梗壓榨后的霞多麗葡萄汁為原料，采用釀酒酵母JF-7為發(fā)酵劑，控溫15-20°C發(fā)酵，經(jīng)IOd后發(fā)酵醪殘?zhí)?lt; 4g/L后發(fā)酵結(jié)束，干白產(chǎn)品具有較高甘油含量，香氣濃郁。
[0017]1、實施例1的篩選酵母的菌屬鑒定:
將保存的酵母菌株劃線接種于WLN培養(yǎng)基中，置于28°C下培養(yǎng)5d后觀察；菌落為奶油色稍帶綠色，球形凸出，表面光滑，不透明，為釀酒酵母的顯著特征。
[0018]上述采用的WLN培養(yǎng)基如下:稱取酵母粉4 g，蛋白胨5 g，葡萄糖50 g，加儲液A40 ml，加儲液B I ml，瓊脂粉20 g，加熱融化后冷卻室溫調(diào)pH至5.5 ;將上述培養(yǎng)基組分在121°C下滅菌15min后，冷卻至不60°C左右，趁熱在超凈工作臺中加入1ml儲液C ;儲液A:磷酸二氫鉀5.5 g，氯化鉀4.25 g，氯化鈣1.25 g，硫酸鎂1.25 g，定容至400 ml，在4°C冰箱保存；儲液B:氯化鐵0.25 g，硫酸錳0.25 g，定容至100 ml，在4°C冰箱保存；儲液C:溴甲酚綠0.44 g溶于IOml水和IOml無水乙醇中。
[0019]2、確認菌株JF-7為釀酒酵母:
提取菌株DNA，進行PCR，PCR產(chǎn)物電泳條帶，切割所需DNA目的條帶，純化測序。以NL1-5' GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3 '和 NL4-5 ' GGTCCGTGTTTCAAGACGG3 '通用引物，PCR 循環(huán)條件:94°C預(yù)變性 4min，94°C 45 秒，52°C lmin,72°C Imin 循環(huán) 30 次，72°C 10 min修復(fù)延伸，40C終止反應(yīng)。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行比對，確認菌株JF-7為釀酒酵母cereFisiaeO,其 Genbank 登錄號為 KJ685388。
[0020]測序結(jié)果如下: GCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAAT
CTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACA
GGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGT
TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTA
CAGTGATGGAAAGATGAAAAGAA CTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTG
ATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTT
GGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGAC
TGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCT。
[0021 ] 3、釀酒酵母JF-7的發(fā)酵特性:
采用改進的YEro培養(yǎng)基(葡萄糖220 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉5g/L)作為初始培養(yǎng)基，杜氏管法考察發(fā)酵特性。其中酒精耐受力測定中乙醇終濃度分別為10%、13%、16%、19%，酸度耐受力測定中蘋果酸終濃度分別為5g/L、8 g/L、11 g/L、14 g/L, SO2耐受力測定中終濃度分別為60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，耐受高糖能力測定中葡萄糖終濃度分別為220g/L、300g/L、400g/L、500g/L，并與商品化釀酒酵母 CY3079 和 R-HST (CY3079 和 R-HST為國內(nèi)干白葡萄酒常用菌株)做對照。
[0022]結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株JF-7與商品化釀酒酵母相比具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，所有測試條件下均能夠正常啟動發(fā)酵，其中經(jīng)統(tǒng)計分析比對酒精耐受和SO2耐受能力處于同一水平上，而耐受酒精和高葡糖糖濃度下菌株JF-7的起酵特性總體優(yōu)于商品化酵母。故釀酒酵母JF-7具備釀造高品質(zhì)葡萄酒潛力。
[0023]4、高產(chǎn)甘油的釀酒酵母JF-7發(fā)酵生產(chǎn)霞多麗干白葡萄酒:
(1)所用菌種:高產(chǎn)甘油的釀酒酵母JF-7、商品化進口活性釀酒酵母CY3079和R-HST；
(2)釀酒酵母菌種制備:挑取斜面保藏菌種一環(huán)，接入裝有200ml菌種制備培養(yǎng)基的500ml三角燒瓶中，置于28°C下培養(yǎng)48h。菌種制備培養(yǎng)基:葡萄糖220 g，蛋白胨20 g，酵母粉10g，加水至1000ml，pH自然，115°C下滅菌20min?；罨N子液采用冷凍離心機在8000r/min和4°C下離心5min收集菌體,離心完畢后菌體用無菌水重懸浮,洗漆離心2次,收集囷體備用；
(3)釀造干白葡萄酒:成熟的霞多麗釀酒葡萄榨汁破碎收集葡萄汁，將葡萄汁初始糖濃度調(diào)整至200 g/L (含糖量較低時用蔗糖補充)，裝入IOL玻璃容器中，裝液量為容器體積的3/4。按照種子培養(yǎng)液體積的5%接入離心洗滌后的菌體，控溫15-20°C下發(fā)酵10天，定期測定CO2失重、殘?zhí)橇亢途凭?。發(fā)酵完畢后用葡萄酒分析儀測定發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，同時采用高效液相色譜法測定甘油含量；
將JF-7、CY3079和R-HST按照上面所述條件，進行干白葡萄酒發(fā)酵對比試驗，結(jié)果見表I ;由表1看出，釀酒酵母JF-7具有良好發(fā)酵特性，與商品化酵母相比，發(fā)酵后產(chǎn)品的酒精度與總酸基本處于同一水平，但殘?zhí)橇枯^低且甘油含量較高，達8.5g/L。
[0024]表1發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)甘油的釀酒酵母，菌株代號為JF-7，菌株26S rDNA D1/D2區(qū)Genbank登錄號為KJ685388，現(xiàn)保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC N0.8870。
2.權(quán)利要求1所述的釀酒酵母在干白葡萄酒中釀制中的應(yīng)用，以權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)甘油的釀酒酵母JF-7為發(fā)酵酵母，常規(guī)法釀造具有高甘油含量、口感肥碩的的干白葡萄酒。
【文檔編號】C12R1/865GK104017740SQ201410228616
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】李記明, 程仕偉, 韓鵬, 姜文廣, 于英, 沈志毅 申請人:煙臺張裕集團有限公司